结直肠肿瘤的发生经过与特征突变相关的明确的临床阶段(1，2) (). 当单个结肠直肠上皮细胞获得使APC公司/β-连环蛋白通路(1). 构成激活KRAS公司/布拉夫通路与小腺瘤生长到临床显著尺寸（直径>1cm）有关(三). 由控制基因突变驱动的克隆扩展的后续波TGF公司-β (4，5),PIK3CA公司(6),TP53型(7)，其他途径负责从良性肿瘤（腺瘤）向恶性肿瘤（癌）的转变。癌和腺瘤的唯一区别是前者侵袭结肠直肠上皮下组织的能力。一些肿瘤最终获得了迁移和植入其他器官的能力（转移）(8). 结直肠肿瘤通常可以在最后一个阶段之前的任何阶段通过手术切除治愈，即在远处转移到肝脏等部位之前(9).
与结肠肿瘤发生相关的主要基因改变。请参见SI方法进一步解释。
了解这一进化过程的基本特征对科学和医学研究都具有明显而重要的意义。但仍然存在许多问题。例如，一个特定的肿瘤细胞需要多长时间才能获得这个过程中每个连续步骤所需的遗传事件？尽管通过临床和放射学研究获得了关于大块肿瘤而非细胞的相关信息，但迄今为止，这个问题还无法在单个患者中解决(10–12). 我们在此描述一种可以回答此问题和相关问题的方法。
人类肿瘤中绝大多数蛋白编码基因的大规模测序最近已成为可能，并已应用于研究乳腺癌和结直肠癌的基因组(13，14). 在当前的研究中，我们调查了Wood评估的结直肠癌中发现的突变等。(14)在同一患者的其他肿瘤病灶中发现，这是一种我们称之为“比较病灶测序”的方法。我们表明，当对测序数据进行定量分析时，可以用来确定负责任何两个连续克隆扩增的细胞的发育所需的时间间隔。我们对与转移相关的扩张特别感兴趣。这种最终的扩张在生物化学和生理学层面上是最难理解的，尽管它实际上是导致该病所有死亡的原因。
结果
结直肠癌的点突变率和生长动力学。
虽然通过比较病变序列得出结论不需要了解这些病变的精确突变率和肿瘤生长率，但对这些参数的估计可以为其解释提供依据。根据参考文献报道的结果，可以估计这些肿瘤的点突变率。14其中，在高质量测序的3.04亿bp序列中检测到847个非同义突变。所有这些突变都是体细胞突变，即不存在于生殖系中。参考文献中评估的大多数病变。14均为肝转移瘤，均为错配修复成功。转换参考文献中的突变流行率数据。14要达到突变率，必须知道癌细胞经历了多少分裂。测量人类肿瘤细胞扩散时间最可靠的方法是通过给患者服用DNA前体，如BrdU，然后通过流式细胞术评估BrdU掺入量和DNA含量(15). 这种方法产生T锅，定义为在没有细胞死亡的情况下，细胞分裂之间的时间。已经用这种方法评估了几百种结直肠癌，其中T锅测量值≈4天(16–21). 通过将此图用于参考文献中报告的细胞分裂率和突变数据。14，估计结直肠癌的点突变率为4.6×10−10每代每对碱基的突变。该比率略低于各种正常细胞类型的测量值[≈10×10−10每代每对碱基的突变(22–25)]. 有关此估算的更多详细信息，请参见支持信息（SI）方法.
细胞培养或异种移植前后突变的比较。
参考文献中使用的样品。14均来源于传代6-12个月的结直肠癌细胞在体外作为细胞系或裸鼠作为异种移植物。在开始对同一患者的其他病变进行当前研究之前，重要的是要确定在培养细胞或异种移植细胞中发现的突变是否真的存在于细胞扩张前自然发生的病变中体外为此，我们分析了18种细胞系或异种移植物中发现的289种不同突变，每种突变都来自不同的患者。其中五个已经发起并通过在体外而剩下的13只在裸鼠中以异种移植物的形式传代。在细胞系或异种移植物中发现的289个突变中，有287个（99.3%）也在原始肿瘤中发现。我们在本文报告的实验中使用的直接Sanger测序方法的灵敏度约为25%，因此在<50%的细胞中不会观察到杂合突变(). 因此，这些数据表明，在结直肠癌细胞系或异种移植物中发现的点突变在在体外或体内肿瘤切除后细胞的实验性生长。
异种移植、异种移植来源的转移病灶和患者正常细胞的DNA序列色谱图的典型示例。请注意，异种移植物中突变与野生型等位基因的比率高于转移病灶中的比率，因为后者代表肿瘤细胞和非肿瘤细胞（基质、白细胞等）的混合物。箭头指向变异的底座。
转移癌与原发性大肠癌的比较。
本研究提供了来自10名患者的原发性结直肠癌和转移性病变的配对样本。指数病变()7例肝切除，3例肠系膜淋巴结切除。我们能够评估参考文献Discovery筛查中评估的患者每个病变平均28个突变。14。剩下的指数病变仅在验证屏幕中进行了研究，因此在这些病例中，每个患者只能研究大约五个突变。在这10例患者中，共评估了233个在指数转移中确定的体细胞突变。其中，只有7例[3.0%，90%置信区间（C.I.）1.5-5.7%]未在发生转移的结直肠癌中发现(SI表2).
表1。
| 患者编号。 | 木材等。(14)身份证号码。 | 诊断时的年龄 | 性别 | 大肠肿瘤的位置 | TNM阶段* | 指数病变部位 | 结直肠腺瘤突变数/癌突变数† | 结肠癌突变数量/指数转移数量† | 其他转移瘤数量 | 其他转移瘤的突变数量/指数转移的突变数量† |
|---|
| 1 | Mx27像素 | 73 | F类 | 提升 | T3N1M0型 | 肝脏 | 不适用 | 47/47 | 三 | 24/24 |
| 2 | Mx29毫米 | 50 | M（M） | 降序 | T4N1M1型 | 肝脏 | 不适用 | 7/7 | 三 | 2017年7月17日 |
| 三 | Mx34毫米 | 83 | F类 | 盲肠 | T4N2M1型 | 淋巴结 | 17/22 | 24/25 | 4 | 31/31 |
| 4 | Mx40毫米 | 75 | F类 | 盲肠 | T4N1M0型 | 淋巴结 | 不适用 | 第5页，共5页 | 三 | 9/9 |
| 5 | Mx43型 | 72 | M（M） | 乙状结肠 | T3N2M1型 | 肝脏 | 不适用 | 48/50 | 5 | 98/98 |
| 6 | 二氧化碳92 | 47 | F类 | 盲肠 | T3N2M0型 | 肝脏 | 不适用 | 8/8 | 0 | 不适用 |
| 7 | Mx32型 | 55 | F类 | 提升 | T3N1M0型 | 肝脏 | 不适用 | 28/32 | 三 | 39/45 |
| 8 | 二氧化碳84 | 41 | M（M） | 盲肠 | T4N2M1型 | 淋巴结 | 不适用 | 4/4 | 0 | 不适用 |
| 9 | Mx38毫米 | 65 | M（M） | 直肠 | yT3N1M0型 | 肝脏 | 不适用 | 6月6日 | 三 | 2017年7月17日 |
| 10 | 二氧化碳 | 80 | F类 | 盲肠 | T3N1M0型 | 科隆 | 6/11 | 不适用 | 1 | 第5页，共5页 |
| 11 | Mx26毫米 | 46 | F类 | 盲肠 | T2N2M1型 | 肝脏 | 不适用 | 不适用 | 1 | 3/3 |
| 12 | 二氧化碳108 | 76 | F类 | 提升 | T4N0M1型 | 肝脏 | 不适用 | 不适用 | 1 | 6/6 |
| 13 | Mx41毫米 | 55 | M（M） | 提升 | T3N1M1型 | 肝脏 | 不适用 | 49/49‡ | 2 | 6/6‡ |
| 平均或总计 | 63 | | | | | 23/33 | 226/233 | 29 | 255/261 |
不同转移性病变的比较。
在13例患者中的11例中，我们能够检测到至少一个与同一患者的指标病变不同的转移病灶。在总共评估的261个突变中，在29个额外研究的转移瘤中发现255个突变（97.7%）(). 这是预期的结果，因为转移瘤中存在的绝大多数突变也存在于前体晚期结直肠癌中，如上所述。更具信息性的是对在转移中发现突变但在晚期癌前体中没有发现突变的患者的研究（以下称为“转移特异性突变”）。虽然只有7个突变被鉴定出来，但其中5个突变的信息量特别大，因为它们可以在同一患者的其他转移病灶中进行评估。在患者5中，最初在肝转移指数中确定的转移特异性突变也在肠系膜淋巴结转移中确定。在患者7中，在同时切除患者的第二个独立肝转移瘤中，在指数转移中发现了三个肝转移特异性突变。
晚期结直肠癌与大腺瘤的比较。
据信，结直肠癌是通过获得额外的基因改变而发生于先前存在的良性腺瘤中(). 在大多数情况下，腺瘤组织在肿瘤生长过程中被破坏。然而，在这里研究的两个病例中，癌边缘仍存在较大的残留腺瘤(). 仔细地对这些病变的石蜡包埋切片进行显微解剖，以将腺瘤与癌细胞分开，并评估已知存在于癌中的33种突变。33个突变中有10个（30%）未在腺瘤成分中发现（参见SI表2). 在转移癌中发现但未发现其前体晚期癌的突变部分与在晚期癌中发现但未发现其大前体腺瘤的突变部分之间的差异具有统计学意义(P（P）<0.001，比例相等的两组二项检验）。
典型病变的组织病理学。(A类)患者10的管状腺瘤（被红色边界包围）中出现的原发性侵袭性中分化腺癌（被黑色边界包围）。(B类)患者2的原发性侵袭性中分化腺癌（被黑色边界包围），邻近非肿瘤性结肠粘膜（被红色边界包围）。(C类)转移性腺癌（黑界包围）至肝脏（红界包围），来源于患者2的原发性结肠腺癌。所有切片均进行H&E染色，并分别对每个边界内的组织进行显微解剖。
在晚期癌而非大腺瘤中发现的10个突变中，7个位于候选癌基因中(CAN总线-基因）如木材中所定义等。(14). 这一比例与转移特异性突变的比例（14%）显著不同CAN总线-基因(P（P）<0.001，两组二项检验）或CAN总线-所有突变基因中的基因（16%，P（P）<0.01，两组二项检验）。在癌中发现的10个突变中，有2个是在癌前体腺瘤中发现的TP53型，与之前关于TP53型突变(26).
DNA突变水平的量化。
通过桑格测序评估，给定DNA样本中没有体细胞突变，这仅仅意味着分析的DNA模板分子中有25%以上没有突变（即杂合突变的细胞中有50%以上）。较小部分的突变通常无法与测序色谱图中的背景区分开。为了确定突变是否存在于较小但仍相当大的肿瘤细胞群体中，我们通过BEAMing（珠子、乳剂、扩增、磁性）分析评估了DNA样本的子集（参见SI方法) (27，28). 我们对7名患者进行了20次BEAM分析，重点是那些似乎存在于晚期病变中但不存在于同一患者早期病变中的突变（例如，存在于转移中但不在晚期结直肠癌中）。在其中19次检测中，未观察到突变（例如). 由于BEAM分析的敏感性≈0.01%，我们得出结论，在前病变2500个细胞中，<1个细胞包含这19个突变中的任何一个，因此表明在每个病例的两个分析阶段之间至少发生了一次主要克隆扩增。
来自指定患者和病变的BEAMing测定的代表性实例。在患者13中，显示的突变代表化疗后29个月出现的新转移中存在的突变（见适用于个别患者). 红点对应于附着在突变DNA片段上的珠子[用藻红蛋白（PE）标记]，蓝点对应于粘附在WT DNA片段上[用荧光素（FITC）标记]的珠子，黑点对应于同时附着在WT和突变DNA片段的珠子。
结直肠癌演变：数学评估。
中的数据可用于确定产生上述各种肿瘤细胞群的创始细胞（F细胞）的相对出生时间(). 该分析的基础是，腺瘤中以克隆方式存在的所有体细胞突变（即存在于肿瘤的所有细胞中）必须存在于其起源细胞（其创始细胞）中。这些突变在创始细胞的生命周期中积累，包括在肿瘤发生前正常干细胞的转换过程中发生的突变。随着肿瘤的进展，它们会积累额外的突变，这些突变会固定在随后的肿瘤状态的起始细胞中。例如，晚期癌症的创始细胞将包含前体腺瘤中的所有突变以及在此期间发生的其他突变。这个过渡期的长度可以通过测量进展病变中额外突变的数量来估计。
致命癌症的演变。每个充满细胞的圆锥体代表一个或多个克隆扩张（参见SI方法详细信息）。大型腺瘤起始细胞向晚期癌起始细胞进化所需的时间（Δ拉丁美洲、澳大利亚)以及晚期癌创始细胞向转移创始细胞的进化（ΔACa、Met)通过比较病变序列测定。其他间隔，如时间(T型经验)用于扩展转移起始细胞FCell大都会根据我们的患者检测到的大小，估计如下SI方法该模型假设至少有两个克隆扩展，用问号表示，与任何已知的遗传改变无关。
感兴趣的创始人细胞是(我)一个（Fcell大都会)导致最终克隆扩张，导致指数转移；(ii（ii）)最后一个共同祖先（FcellACa公司)晚期癌和F细胞大都会; 和(三)最后一个共同祖先（Fcell小伙子)大腺瘤和F细胞ACa公司创始细胞的出生日期（T）定义为创始细胞第一次分裂时患者的年龄。如所示SI方法，间隔（ΔTACa、Met)创始细胞Fcell出生日期之间大都会和FcellACa公司可以近似为
哪里F类ACa、Met是未在晚期癌中发现的转移中突变的分数（即1−[晚期癌中的突变数/转移中的突变数量]）。同样，间隔（ΔT拉丁美洲、澳大利亚)出生日期T之间小伙子和TACa公司创始细胞FcellACa公司和FcellLAd公司分别可以近似为
哪里F类拉丁美洲、澳大利亚是在大型腺瘤中未发现的晚期癌中的突变部分。只要两个创始细胞中的一个是另一个的直系后代，就可以将类似的方程应用于代表两个创始细胞克隆性扩增的任何两个病变。
注意，这些方程与实际突变率和细胞分裂时间（T锅)这在不同的患者和癌症中可能有所不同。他们只要求突变率和细胞分裂时间，无论是什么，在每个患者的一生中都是恒定的。中的近似值等式。1和2只要对生长有积极或消极影响的突变的数量与中性突变的数量相比很小，则是准确的。详见SI方法一般来说，预计会满足这一要求。因此，突变起到了时钟的作用，提供的信息类似于通过使用序列差异来评估生物或细胞在进化或发育过程中的相关性而获得的信息(29，30).
适用于个别患者。
当前研究的主要结果之一是F拉丁美洲、澳大利亚远大于FACa、Met这意味着大腺瘤演变为晚期癌所需的时间要比此类癌转移的时间长得多。通过这些方程式确定的时间的准确性受到限制的假设如下所示SI方法。通过将其应用于当前研究中至少可评估25个突变的5名患者，可以最好地说明其实施情况().
患者1在73岁时患上了直径为4厘米的晚期升结肠癌，为T3N1M0期（T3是指癌的分期，在本例中，癌细胞完全通过固有肌层生长；N1表示癌细胞至少存在一个但不到四个淋巴结；M0表明手术时没有明显的远处转移）。15个月后，发现一个直径为5cm的肝转移瘤。转移中发现的所有47个突变也都发现于晚期结肠癌（FACa、Met=0.0）。应用等式。1表明转移源于细胞（Fcell大都会)其出生在细胞（Fcell）出生后不久ACa公司)导致晚期癌症（C.I.，0-3.4年）。
患者3在83岁时患上晚期升结肠癌，直径9厘米，分期为T4N2M1（N2表明癌细胞存在于三个以上的肠系膜淋巴结中）。手术时发现肿瘤周围有残留腺瘤。发现肠系膜小淋巴结转移（直径<1厘米）包含25个突变，随后在该患者的其他病变中进行了评估。其中，24例发现于结直肠癌（FACa、Met= 0.04). 应用等式。1表明晚期癌创始细胞在淋巴结转移创始细胞出生前3.2年（C.I.，0.4–7.1年）出生。相反，对发生癌的大腺瘤中相同突变的评估显示拉丁美洲、澳大利亚第0.23页。应用等式。2表明大腺瘤形成细胞比晚期癌形成细胞早17岁（C.I.，7.9-30.9岁）出生。Fcell出生后约17年小伙子和FcellACa公司，肿瘤经历了由基因突变驱动的克隆扩张波TP53型和其他基因(SI表2)可能是肿瘤侵袭和进一步生长所必需的。一旦获得这些能力大都会)淋巴结转移能力在较短时间内出现。
患者5在72岁时发生晚期乙状结肠癌，直径1.5厘米，分期为T3N2M1，伴有8.9厘米的肝转移。比较病变序列显示转移起始细胞Fcell大都会出生于晚期癌症创始细胞Fcell出生后2.8年（C.I.，0.6-4.9年）ACa公司该患者还评估了一个大的（1.3厘米）肠系膜淋巴结转移和两个较小的肠系膜淋巴结转移。较大的淋巴结中含有在肝转移中发现的50个相同突变，包括在原发性结直肠癌中未发现的两个突变；两个较小的淋巴结不包含这两个突变。因此，1.3厘米的肠系膜淋巴结转移和肝转移创始细胞可能都来自癌内获得转移能力的少数细胞。另外，肝转移可能起源于大的肠系膜淋巴结转移。在这种情况下，比较病变排序表明，肝转移创始细胞一定是在淋巴结转移创始癌细胞出生后不久（0年；C.I.，0.0–2.0年）出生的。
患者7岁，55岁，患有直径3.5厘米的晚期升结肠癌，分期为T3N1M0。20个月后，在肝脏发现两个直径分别为3.5厘米和4厘米的转移瘤。4-cm肝转移和结直肠癌的比较病变测序表明，转移起始细胞在癌起始细胞后6.6年出生（C.I.，1.8-8.6年）。还对初次手术时切除的两个肠系膜淋巴结转移和上述3.5cm肝转移进行了评估。在两个肝转移瘤中都发现了三个转移特异性突变，但在两个淋巴结转移瘤中均未发现。
患者13岁，55岁，患有直径2.5厘米的晚期升结肠癌，分期为T3N1M1。手术时切除了肝右叶7厘米的转移灶和肠系膜淋巴结的转移灶。术后20个月，在左叶发现一个直径为3.1cm的新肝转移瘤，并将其完全切除。一年后，发现另一个直径为3.5厘米的肝转移灶。在最初诊断后29个月和41个月确定的转移瘤都有19个突变，在最初手术切除的晚期癌或转移病灶中没有发现，而FACa、Met= 0.28. 相反，在最初手术切除的转移病灶中发现的所有突变也存在于同时切除的晚期癌中。我们用以下方式解释这个结果。在初次手术后的9个月内，由伊立替康、亚叶酸和5-FU组成的化疗切除了肝脏中残留的大部分微转移细胞。其中一个细胞对化疗有抵抗力，成为新的转移和随后复发的创始细胞。化疗在该细胞中诱导了许多新的突变，这与伊立替康已知的诱变性一致，并且可能因5-FU而加剧(31).等式。1不能用于估计该细胞的相对出生日期，因为比较病变测序要求突变率在整个致瘤过程中保持不变（参见SI方法). 值得注意的是，在我们的研究中，这名患者是唯一一名在新的转移灶形成之前接受伊立替康治疗的患者。
讨论
结直肠癌的时间定义模型。
本研究中使用的数据和方法可用于对结肠肿瘤发生中的一些关键遗传事件进行时间建模。如所示比较病变序列显示，大腺瘤起始细胞出生与晚期癌起始细胞出生之间的平均时间间隔为17年（C.I.，10.9-26.5年）。然而，晚期癌创始细胞与肝转移创始细胞的平均出生间隔仅为1.8年（C.I.，0.9-3.1年）。
迄今为止，还没有关于导致不同肿瘤阶段的创始细胞的出生时间的信息。然而，我们对这些值的估计与对大块肿瘤的临床和放射学观察一致。例如，根据对家族性腺瘤性息肉病患者的研究，小腺瘤出现与癌症诊断之间的时间估计为20至25年(11). 同样，对散发性大肠肿瘤患者的系列研究表明，从大腺瘤到癌的转变需要约15年的时间(11). 我们的估计也与通过连续放射学研究或CEA血清生物标记物的连续测量确定的肿瘤长时间加倍相一致(10，12，32，33). 这些研究表明，转移瘤的平均倍增时间通常为2-4个月，而腺瘤和癌的平均倍增时间更长。
生物影响。
我们的发现表明，几乎所有转移所必需的突变都已经存在于先前癌的所有细胞中。这些数据与两种不同的模型兼容。在模型A中，没有一种癌细胞能够引起转移，但它们几乎能够做到这一点；还需要一个或几个基因改变。在模型B中，所有的癌细胞都能引起转移；不需要更多的基因改变。来自当前研究的数据，包括同一患者不同转移病灶的比较，与两种模型都是一致的。
型号A。
如果癌细胞群中的每一个细胞都能引起转移，那么任何两个独立的转移都极不可能包含癌细胞中未发现的相同突变。然而，如中所述结果，我们确定了五个转移特异性突变，每个突变都存在于同一患者（患者5和7）的一个以上转移中。如果这两种转移中的一种的创始细胞不是另一种的直接后代，那么这些数据将支持这样一种观点，即癌症中的一小部分细胞获得了额外的改变，赋予了它们转移的能力。这种改变可能是实际确定为转移特异性的点突变(SI表2)或任何其他可遗传事件[整个染色体的增加或丢失，染色体易位或扩增，或某些表观遗传变化(34)].
型号B。
这种模型的普遍支持来自这样一个事实，即与晚期癌相比，在转移瘤中发现的额外改变很少。如果两个转移瘤的起始细胞从原发性结直肠癌转移后都遇到了瓶颈，那么在两个解剖上不同的转移瘤中发现的未在癌中发现的突变就可以解释。在患者5中，如果肝转移是由肠系膜淋巴结转移中包含相同突变的细胞发展而来，则可能发生这种情况。在患者7中，如果两个肝转移的创始细胞都在未被检测或切除的淋巴结转移中形成，则可能发生这种情况。
大腺瘤进展为晚期癌所需时间比晚期癌进展为转移所需时间长得多的原因可能是因为需要更多的突变和克隆扩增（其中一些在). 此外，一些与腺癌进展有关的基因已经被确定(SI表2和). 对数据的一个合理解释是，通过肠壁层侵入而不死亡，从而成为晚期结直肠癌的能力是最终导致转移的过程中最具挑战性的一步。一旦这一步发生，转移就不需要额外的步骤了。大规模癌症基因组测序的出现为研究肿瘤进化提供了独特的有价值的生物标记物。使用本研究中描述的方法对其他突变和病变进行研究，可以明确回答关于人类转移过程基本性质的各种长期存在的问题(35–39).
