利用Affymetrix 50K SNP图谱阵列对前列腺癌等位基因失衡进行全基因组分析

前列腺癌的激光显微切割

简言之，5 μm薄片前列腺组织在低温恒温器上切割并放置在PALM®膜载玻片上。苏木精染色后（Sigma-Aldrich-Denmark，Brondby，Denmark）3 min，样品在H中冲洗₂O和伊红染色（Sigma-Aldrich）10 s.在H中清洗载玻片后₂O、 他们在乙醇浓度增加的情况下脱水，然后进行10次空气干燥 min.使用PALM系统通过激光显微切割分离前列腺癌细胞（PALM Microlaser Technologies AG，Bernried，Germany）。面积约为10–30 毫米²从每个病人身上解剖并分离出300个 μl溶解缓冲液（Gentra Systems Inc.，明尼阿波利斯，明尼苏达州，美国）。

DNA提取

使用PureGene DNA提取试剂盒（美国明尼苏达州Gentra Systems Inc.）提取DNA(www.gentra.com网站). 答10 μl蛋白酶K（5）的体积 毫克 毫升⁻¹)添加到裂解缓冲液中。添加蛋白质沉淀溶液并离心样品。分离上清液，1 μl线性聚丙烯酰胺（10 μ克 μ我⁻¹)和300 μ添加1升异丙醇。将样品离心，排出上清液，并将DNA沉淀在70%乙醇中洗涤。将上清液排出，并在15分钟内将干燥的颗粒重新水化 μ1升复水溶液。平均500 ng至1 μ从每个样本中获取g DNA。

在260和280处测量分光光度吸光度 纳米。比率（OD₂₆₀/外径₂₈₀)从激光显微切割的PCa组织中提取的DNA的平均值为1.4±0.2（平均值±标准偏差（s.d.）），血液DNA的比率为1.8±0.1。

GeneChip®映射50K阵列

阵列实验根据Affymetrix GeneChip Mapping 50K阵列标准协议（Affymmetrix Inc.，Santa Clara，CA，USA）进行。Mapping 50K系统由两个8-μm个阵列，每个阵列设计用于杂交标记的PCR片段Xba公司I-和欣dIII-叶DNA。为了降低项目成本，只有包含探测的数组Xba公司I-切割DNA检测58 使用了960个SNP。A 250型 DNA的ng测量用于映射50K阵列。我们在组织样本中获得了92.9±7%的调用率（平均值±标准差），在生殖系样本中获得96.1±4.5%的调用率，因此与Affymetrix上一代SNP阵列Mapping 10K的调用率相当(科德等, 2005).

数据分析

所有SNP的物理位置(n个=58 960). 根据2004年5月在http://genome.ucsc.edu/

未映射或映射到基因组组合中多个位置的单核苷酸多态性被排除在分析之外，留下57个 429 SNP。

DNA分析软件（GDAS）3.0.2 Patch software（Affymetrix Inc.，CA，USA）用于生成基因型调用。将来自生殖系和癌症DNA的基因型和探针强度加载到软件包dChip中(http://www.dchip.org/) (林等, 2004)用于LOH分析：对探针强度进行归一化，并获得每个阵列中每个SNP的单个信号值（观测信号）。对39个存在匹配肿瘤和生殖系DNA的样本进行杂合性缺失检测。

SNP基因型验证

通过与使用ABI PRISM®SNaPshot™Multiplex试剂盒（Applied Biosystems，Foster City，CA，USA）通过单碱基扩展方法独立获得的基因分型比较，评估Affymetrix GDAS 3.0.2软件生成的SNP基因型调用的准确性(高斯塔德讷等, 2006). 用于PCR扩增和单碱基延伸SNP基因分型的所有引物列表如所示补充信息(表1). DNA样本与用于SNP芯片分析的样本相似。

表1

前列腺癌常见基因组改变（LOH）的鉴定

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定量聚合酶链反应

使用SYBR®GREEN PCR Master Mix（Applied Biosystems）在ABI PRISM®7000序列检测系统（美国加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司）上进行实时PCR。四种不同靶基因（MAP3K7、PPP3CC、SGCZ和CSMD1）的定量基于从四倍连续稀释的正常基因组DNA样本构建的标准曲线。每个目标的拷贝数是相对于参考Line-1重复元素来确定的，之前其他人详细描述了一种方法(赵等, 2004). 引物序列的完整列表见补充信息（表2）使用Mann–Whitney非参数检验确定组间拷贝数的差异。GrapaPad Prism4（美国加利福尼亚州圣地亚哥）被用作统计软件。

加权信号强度的提取

按照数据分析中的描述，对87个阵列（43个肿瘤和44个种系样本）的信号值进行归一化和提取后，数据进一步归一化为单核苷酸多态性，以便对不同单核苷酸多态度进行比较。信号值不能直接比较，因为代表阵列上不同SNP的探针组具有不同的物理特性。因此，使用种系样本的平均值和s.d.对数据进行SNP归一化，即，z_ij公司=(x个_ij公司−平均值_j个)/标准差。_j个，其中x个_ij公司是SNP的观测信号j个在样品中我（生殖系或肿瘤），平均_j个和s.d。_j个是SNP的平均值和标准偏差j个所有44个种系样本。因此z_ij公司对于生殖系样本中的所有SNP，分别为0和1。为了进一步降低信号值中的噪声水平，我们计算了M（M）=9个SNP，按基因组距离加权；也就是说，一_ij公司=Σz_{我(j个+l）}经验（−d日_{j个(j个+我)})/∑exp（−d_{j个(j个+我)})，其中总和（∑）位于SNP两侧的四个相邻SNP之上j个(我=−4，−3，…，0，…，3,4）和d_{j个(j个+我)}是SNP之间的基因组距离j个和j个+我.一_ij公司称为加权信号强度，以下称为信号强度。

基因组区域的绘图通常显示拷贝数变化

通常显示拷贝数改变的基因组区域被确定为连续SNP的片段，其平均加权信号强度（所有肿瘤样本）与生殖系样本的平均加权信号密度显著不同(P（P）⩽0.01）。只有40个连续SNP的区域，每个区域都有P（P）⩽0.01。通过随机排列阵列标签（肿瘤和生殖系）10获得生殖系样本的零分布 000次，并计算每个排列的平均值差。

基因组区域通常表现为LOH

正常血细胞中杂合SNP转化为肿瘤组织中纯合SNP表明肿瘤中一个等位基因（LOH）丢失。由dChip软件测定的39例前列腺癌样本中LOH的总体模式如所示图1，表1和图4(补充信息). 显示频繁LOH的基因组区域被定义为30%以上样本中显示LOH的区域（39例中的12例）。区域大小从1.5到22.1不等 Mb包括6q、8p、10q、13q和16q位置。LOH的最高百分比（>60%）局限于染色体8p21.3的1.5-Mb区域。高分辨率SNP阵列也为发现新的变化提供了一个极好的工具。一个新的频繁重复缺失区域21q22.2特别有趣，因为ERG公司和TMPRSS2型，两者都位于该区域，最近被发现参与了前列腺癌中常见的基因融合事件(汤姆林斯等, 2005). 这个新的LOH区域覆盖2.9 染色体21q22.2的Mb在12个样本中显示LOH。

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图1

由dChip测定的显微切割前列腺癌组织中6、8、10、13、16和21号染色体的杂合性缺失。39个匹配肿瘤和生殖系个体样本中覆盖基因组的杂合区（蓝色）、保留区（黄色）和无信息区（白色）的缺失。每列代表一个肿瘤/生殖系对。此外，沿着灰色阴影框内每个图形的右侧是39个样本的平均LOH得分。左侧显示了单个染色体的细胞带。染色体1-22如补充图4所示。

基因组区域通常显示拷贝数改变

通过比较肿瘤组Mapping 50K阵列的信号强度，确定了通常显示拷贝数改变的区域(n个=43）与44个生殖系样本的强度。使用40个连续SNP的截止值，每个SNP都显示出显著差异(P（P）在前列腺肿瘤和种系样本之间，我们鉴定了73个基因组区域。区域规模从0.5扩大到9.6 兆比特(表2). 在确定的73个区域中，只有染色体2q24和20q13.3上的两个区域出现增益。染色体2、5、6、8、10、13、16和18共享缺失的多个区域不一定是DNA拷贝改变的独立区域，但可能是较大区域的亚组分。

肿瘤DNA中LOH和拷贝数变化的比较

最近有研究表明，尽管丢失了一个等位基因，但癌症基因组中的LOH区域通常显示出两个拷贝(克莱顿·詹森等, 2004). 因此，我们测试了所有显示LOH的样本的LOH和信号强度之间的相关性。如所示图2第6、8、10、13、16和21号染色体上的主要LOH区域均与LOH呈正相关，且加权信号强度显著降低。这表明前列腺癌中一个等位基因的缺失与拷贝数的减少有关。所有染色体的LOH/信号强度图如所示补充图1我们进一步测试了局部和转移性PCa亚群的相同相关性，以确定与晚期乳腺癌的早期相比，晚期肿瘤中是否优先发现有丝分裂重组(克莱顿·詹森等, 2004)，但在各个组中没有观察到差异（数据未显示）。

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图2

LOH与显示LOH的SNPs中基因组拷贝数改变之间的相关性。计算特定SNP中所有LOH肿瘤的特定SNP的信号强度值，并用指示LOH肿瘤数量的颜色绘制。虚线对应1%的显著性水平。这些宽度不同，因为一些SNP经历的LOH比其他SNP更多。信号强度超过1%显著性水平阈值的单核苷酸多态性被认为代表不同于2的基因组拷贝数（如果阳性>2，如果阴性<2）。LOH和拷贝数减少似乎正相关的领域包括6q、8p、10q、13q、16q和21q。插入的颜色代码显示LOH的样本数量。

为了验证结果，我们通过实时PCR测定了染色体8p和6q处LOH区域中四个不同基因的LOH样本的拷贝数得分。

结果显示拷贝数为1.01±0.2（平均值±标准差）(n个=30），而肿瘤DNA为2.1±0.2(n个=28）在生殖系DNA中。这证实了在显示LOH的样品中拷贝数丢失明显。

Pamela Celis、Bente Pytlich和Susanne Scou提供的技术援助受到热烈欢迎。这项工作得到了丹麦癌症协会第DP 03 097号拨款、奥胡斯大学研究基金会注册号212、丹麦癌症研究基金会、Erland Richard Frederiksen og Hustrus Legat and Frits、Georg og Marie Cecilie Gluds Legat的支持。KDS得到了约翰和比尔特·梅耶基金会的资助。CW得到了丹麦癌症协会和Fraenkel基金会的支持。