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细胞生物学杂志。2007年3月12日；176(6): 757–763.
数字对象标识：10.1083/jcb.200701065
预防性维修识别码：项目编号：C2064049
PMID：17339379
报告

功能基因组学确定了CENP-a染色质组装所需的Myb结构域蛋白家族

保罗·马多克斯，弗朗西·亨德曼，乔斯特·莫南，凯伦·欧格玛、和阿尔沙德·德赛
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

含有着丝粒特异性组蛋白H3变体着丝粒蛋白A（CENP-A）的核小体为动粒组装奠定了染色质基础。为了了解选择性地将CENP-A靶向着丝粒的机制，我们在线虫中采用了功能基因组学方法秀丽隐杆线虫，其中未能加载CENP-A导致特征性动粒细胞缺失（KNL）表型。我们确定了一种单一的蛋白质，即KNL-2，它是CENP-a并入染色质所必需的。KNL-2和CENP-A在整个细胞周期中以相互依赖的方式定位于着丝粒，并协调直接染色体凝聚、动粒组装和染色体分离。KNL-2相关染色质的分离共富集了CENP-A，表明它们与DNA非常接近。KNL-2定义了一个新的含有Myb DNA结合结构域的保守蛋白家族。人类KNL-2同源物也对CENP-A负载和动粒组装特别需要，但只有在有丝分裂退出后短暂存在于着丝粒。这些结果暗示着着丝粒染色质组装中存在一个新的蛋白质类，并表明全着丝粒和单着丝粒染色体共享CENP-a负载的共同机制。

介绍

着丝粒染色质，其中着丝粒蛋白A（CENP-A）取代组蛋白H3，在有丝分裂期间组织起来，形成一个表面，用于动粒组装(Palmer等人，1991年;Sullivan等人，2001年;克利夫兰等人，2003年). 对在无着丝粒染色体片段上低频自发形成的新着丝粒的研究表明，CENP-A核小体而不是特定的DNA序列定义着丝粒活性(Choo，2000年). 将CENP-A核小体装载到染色质上并保持其有限分布的机制是积极研究的主题(Henikoff和Dalal，2005年). 芽殖酵母和裂变酵母的研究已经确定了有助于CENP-A定位的蛋白质(Takahashi等人，2000年;梅隆和奥尔郡，2003年;Hayashi等人，2004年)包括一般染色质重塑复合物CAF-1。然而，由于CAF-1的抑制使CENP-A蛋白水平不稳定，因此尚不清楚CAF-1是否在CENP-A负载中起直接作用(Hayashi等人，2004年).

为了确定CENP-A定位所需的蛋白质，我们在线虫中采用了无偏见的功能基因组方法秀丽隐杆线虫。秀丽线虫具有全中心染色体，其中动粒沿着每个姐妹染色单体的整个长度形成，而不是局限于局部染色体区域。从DNA上的CENP-A到纺锤体微管界面的组分，高分辨率超微结构研究和组分蛋白质的保存都表明了全着丝粒和单着丝粒染色体有丝分裂动粒的基本相似性（有关综述，请参阅Maddox等人，2004年). 在这两种类型的染色体结构中，CENP-A仅限于组织在姐妹染色单体相对面上的染色质子集，以几何约束动粒组装并确保与纺锤体的正确连接(Buchwitz等人，1999年;Oegema等人，2001年). 这些相似性表明，CENP-A的负载机制可能在全着丝粒染色体之间保守秀丽线虫脊椎动物的单核染色体。在本研究中，我们通过鉴定和表征一个具有Myb-like DNA-binding结构域的蛋白质家族，为这一断言提供了证据，该结构域是线虫和哺乳动物细胞中CENP-a负载所特别需要的。这类蛋白质的鉴定为理解基因组遗传中这一关键步骤的机制提供了一个起点。

结果和讨论

在秀丽线虫，RNAi介导的蛋白质耗竭具有高度渗透性，并且在很大程度上独立于固有的蛋白质周转，因此有可能生成耗竭95%以上目标蛋白质的卵母细胞(Oegema和Hyman，2006年). 耗尽卵母细胞的受精触发了第一次胚胎有丝分裂，这是高度定型的，因此，可以进行定量实时成像分析（视频1，可在http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200701065/DC1). 在CeCENP-A缺失的胚胎中，动粒无法形成，导致独特的动粒无（KNL）表型，其特征是每个原核的染色体聚集、纺锤极过早分离、染色体排列缺陷和染色体分离失败(图1 A和视频2；Oegema等人，2001年).

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KNL-2是一种新型Myb结构域蛋白，其缺失导致CeCENP-a功能丧失表型。（A） 对照、CeCENP-A和KNL-2缺失胚胎的图像，表达GFP组蛋白H2b（箭头）以标记染色体，表达GFP–γ-微管蛋白（箭头）以标记纺锤极。时间是相对于核膜破裂（NEBD）的秒数。（B） 控制中的主轴分离动力学、CeCENP-A耗尽和KNL-2耗尽。误差条表示置信区间为0.95的SEM。（C） KNL-2的一级序列特征。发散的Myb结构域（氨基酸624-677）显示在底部，用于秀丽线虫，C.布里格斯、和C.还押KNL-2。预测的螺旋二级结构显示在序列下，保守的色氨酸（W）残基用红色框起来。（D）KNL-2和CeCENP-A在有丝分裂期间在动粒上共定位。（E） GFP–KNL-2表现出动粒定位。（F） KNL-2在胚胎分裂后期定位于动粒。图中显示了一个多细胞胚胎，其中DNA（红色）和KNL-2（绿色）被标记。棒材（A、D和E），5μm；（F） 10微米。

系统地识别秀丽线虫缺失导致KNL表型的蛋白质，我们使用基于荧光显微镜的分析，通过先前的全基因组筛查，重新筛选了约250个与染色体分离相关的基因。在最初的屏幕中，针对预测的~19000人中的98%秀丽线虫基因(Sonnichsen等人，2005年)用微分干涉对比（DIC）显微镜对胚胎存活所需的～1700个基因产物中的每一个单独缺失的胚胎进行拍摄。DIC视频数据的聚类分析显示，染色体分离通常需要一组～250个基因(Sonnichsen等人，2005年). 由于DIC无法识别KNL表型，我们使用高分辨率荧光延时成像分析了共存GFP-组蛋白H2b和GFP-γ-微管蛋白或GFP-α-微管素的活胚胎，这些活胚胎在这250个基因产物中的每一个都被耗尽（未发表的数据）。该方法有望揭示所有抑制导致KNL表型的非冗余基因产物，并鉴定出五种蛋白质：CeCENP-a、CeCENP-C、KNL-1、KNL-2和KNL-3。其中三个，CeCENP-C、KNL-1和KNL-3，在CeCENP-A下游发挥作用，因为它们需要CeCENP-A定位于动粒，并且它们的耗尽不会阻止CeCENP_A靶向(Oegema等人，2001年;Desai等人，2003年;Cheeseman等人，2004年). 剩余的KNL蛋白KNL-2（K06A5.4）特别以CeCENP-A为染色质靶点（参见图2)它代表了这一综合战略确定的唯一一种蛋白质。

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CeCENP-A需要KNL-2，但组蛋白H3不需要以染色质为靶点。（A） CeCENP-A和KNL-2在野生型、KNL-2缺失或CENP-A-缺失胚胎中的定位。（B） KNL-2缺失不能阻止组蛋白H3定位。注意染色质上的GFP-组蛋白H2b水平也未受影响(图1 A). （C） CeCENP-A定量和组蛋白H3定位。对于CeCENP-A分析，表达GFP-组蛋白H2b的胚胎中KNL-2被耗尽，并且在固定胚胎的去卷积图像中计算CeCENP-A与GFP-组蛋白H2b之间的荧光强度比。对于组蛋白H3，染色质上的信号被直接量化。误差条表示置信区间为0.95的SEM。（D） KNL-2缺失不影响CeCENP-A蛋白水平。免疫印迹比较系列稀释对照秀丽线虫CeCENP-A和KNL-2提取物耗尽秀丽线虫显示了提取物。α-管蛋白被用作负荷控制。棒材，5μm。

KNL-2的缺失导致有丝分裂染色体分离的缺陷，该缺陷与CeCENP-a缺失胚胎的缺陷基本相同(图1 A和视频3，网址为http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200701065/DC1). 纺锤体极的过早分离表明动粒微管附件的缺失，这两种消耗在数量上是相似的(图1 B). 与CeCENP-A消耗相比（视频2；Monen等人，2005年)KNL-2缺失还导致减数分裂染色体分离缺陷，从卵母细胞原核的异常性质可以明显看出（视频3中的胚胎前部/左侧）。KNL-2在全心分离中的减数分裂作用秀丽线虫染色体在这里不作进一步讨论，将作为单独研究的主题。KNL-2是一种约103-kD的碱性蛋白，具有短的卷曲螺旋延伸和二分核定位序列。序列分析显示，在其C末端存在一个不同版本的DNA结合域，该结构域最初在原癌基因Myb中定义(图1 C). Myb结构域以及相关的SANT结构域存在于大量与染色质动力学有关的蛋白质中，包括与组蛋白相互作用的转录因子和染色质重塑酶亚单位(Aasland等人，1996年;Lipsick，1996年;Mo等人，2005年). KNL-2的同源物存在于与之密切相关的线虫中秀丽线虫，但在最初的生物信息分析中，与其他生物体中Myb结构域蛋白的明确联系并不明显（参见图4有关此主题的更多信息）。

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KNL-2是无脊椎动物和脊椎动物中CENP-a负载所需的一个广泛保守的蛋白质家族的创始成员。（A） 的Myb域B.马来语KNL-2同源物与两个杆状体KNL-2 Myb结构域对齐，用于鉴定假定的人类KNL2同源物（c14或f106）。阴影表示保护程度。（B） 使用Myb/SANT结构域序列对Myb/SANT-结构域蛋白超家族的一个小子集进行对齐的树。SANT域蛋白（红色）与染色质重塑活动有关。创始的典型Myb原癌基因（A–C指人类的三种亚型；gold）是一种直接结合特定DNA序列的转录因子。一个新的亚科（蓝色）由KNL-2 Myb结构域定义，除线虫成员外，还包括每个已测序脊椎动物中的明确同源物。在真菌或果蝇属假设脊椎动物KNL2的GenBank/EMBL/DDBJ登录号如下：Hs、人类106年第14页; 嗯，老鼠C79407号; Gg，鸡肉XP_421481号; 和Xt，青蛙AL873597.2号（C）HsKNL2在HeLa细胞中的定位。所选区域包括处于不同有丝分裂阶段的细胞，并突出了细胞周期后期/末期着丝粒染色的显著增加。（D–F）HsKNL2缺失显著降低了CENP-A在着丝粒的定位，并相应降低了内侧（hDsn1）和外侧（Hec1）动粒蛋白的靶向性。抗着丝粒抗体染色用于识别所有病例中的着丝粒区域，但未显示其简洁性。在每种条件下，都会显示荧光强度测量的动粒（kts）和细胞总数。正如动粒组装缺陷所预期的那样，HsKNL2缺失细胞的染色体分离受到严重干扰（图S4和视频10，可在http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200701065/DC1). 误差线代表SEM。（G）HsKNL2缺失不影响磷酸组蛋白（S10）H3染色。棒材（C），10μm；（D、E和G）5μm。

为了确定KNL-2的亚细胞定位，我们制备了亲和纯化抗体和稳定的秀丽线虫表达GFP与KNL-2融合的菌株（视频4，网址：http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200701065/DC1). 这两种工具都显示KNL-2在有丝分裂期间定位于着丝粒/动粒区域(图1、D和E). 利用RNAi介导的蛋白质缺失建立抗体定位的特异性(图2 A). 因为我们的筛选策略侧重于第一次胚胎分裂，所以KNL-2的功能可能仅限于受精后基因组结构的特殊变化。然而，在整个胚胎发生过程中，KNL-2在动粒处被观察到(图1 F)以及基于RNAi的策略，其中KNL-2在早期胚胎发生后才被抑制(Maddox等人，2005年)表示开发期间对KNL-2的持续需求（图S1）。

KNL-2的缺失阻止了CeCENP-A定位于染色质(n个=29个一次分裂胚胎；图2，A和C)但不影响CeCENP-A蛋白的稳定性(图2 D). 反过来，KNL-2的染色体靶向性需要CeCENP-A(图2 A)表明这两种蛋白质在定位上是相互依赖的。与对CeCENP-A定位的影响相反，KNL-2的缺失并不影响组蛋白H3的染色体靶向性(图2、B和C)或GFP组蛋白H2b(图1 A)，表明KNL-2是装载CeCENP-A的特殊要求。使用表达GFP–KNL-2或GFP–CeCENP-1的胚胎的实时成像进一步证实了KNL-2和CeCENP-A定位的相互依赖性（视频4-7，可在http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200701065/DC1).

相互耗竭和定位实验将CeCENP-A置于动粒组装层次的顶部(Oegema等人，2001年;Desai等人，2003年;Cheeseman等人，2004年). KNL-2和CeCENP-A在染色体靶向方面的相互依赖性(图2 A)预测KNL-2和CeCENP-A一样，应该位于其他动粒组分的上游。为了验证这一预测，我们检测了有丝分裂动粒亚结构中不同位置的三种广泛保守的蛋白质的募集：CeCENP-C（内部）、KNL-1（内部）和BUB-1（外部）。正如预期的那样，所有三种蛋白质都未能定位到KNL-2缺失胚胎的染色体上(图3 A). 在相互消耗中，CeCENP-C、KNL-1或BUB-1缺失的胚胎的染色体上存在GFP–KNL-2(图3 B以及视频8和9，可在http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200701065/DC1)，将KNL-2与CeCENP-A放在动粒组装层次的顶部(图3E).

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KNL-2和CeCENP-A在动粒组装和染色体凝集方面的功能相当，并且在染色质上的物理位置接近。（A） 与CeCENP-A一样，需要KNL-2将CeCENP-C、KNL-1和BUB-1定位到动粒。（B） CeCENP-C、KNL-1或BUB-1的缺失并不能阻止GFP-KNL-2定位于染色质。（C） CeCENP-A和KNL-2缺失的胚胎表现出类似的染色体凝聚缺陷。核膜破裂前−370和−210秒精子原核的代表性图像（定量请参见图S2，网址：http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200701065/DC1). （D） KNL-2和CeCENP-A在染色质上接近。细胞核纯化自秀丽线虫对表达GFP–KNL-2的胚胎进行超声处理，产生约500–1500 bp的染色质片段。超声处理的染色质被用作抗GST（对照）和抗GFP免疫沉淀的输入。对输入染色质和免疫沉淀物的稀释液进行KNL-2、CeCENP-A和组蛋白H3的印迹。富集KNL-2的染色质片段与CeCENP-A共富集，但与组蛋白H3共富集（图S3）。（E） CeCENP-A和KNL-2协同直接着丝粒组装和染色体凝聚。棒材（A和B），10μm；（C） 2微米。

含CENP-A的核小体在有丝分裂的凝聚中起着重要的结构作用秀丽线虫独立于其在引导着丝粒组装中的作用的染色体(Maddox等人，2006年). 为了确定在有丝分裂进入期间，KNL-2是否也需要用于染色体凝集，我们使用最近开发的定量分析来比较CeCENP-a、KNL-2或CeCENP-C缺失后的凝集。KNL-2的耗尽导致严重的冷凝缺陷，该缺陷与CeCENP-a耗尽后观察到的缺陷基本相同，与CeCENP-C耗尽的更微妙影响不同(图3 C和图S2，可在http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200701065/DC1). 缩合分析仅对精子原核中的染色质进行，该染色质在引入抑制性双链RNA（dsRNA）之前形成，因此不存在减数分裂缺陷引起的并发症(Maddox等人，2006年). 这一结果进一步证实了KNL-2是CENP-A染色质组装所必需的。

上述结果表明，KNL-2与CeCENP-A核小体物理结合，以促进其负载和功能。为了验证这一想法，我们从表达GFP–KNL-2的菌株中分离出胚胎间期细胞核，将染色质超声处理成500–1500-bp片段，并用抗GFP抗体免疫沉淀KNL-2融合蛋白(图3 D). 免疫沉淀物分析表明，CeCENP-A而非组蛋白H3通过该程序与KNL-2共富集(图3 D). 作为对这种生化方法的补充，高分辨率成像显示KNL-2与间期细胞核中分散的CeCENP-A病灶部分共定位（图S3，可在http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200701065/DC1). CeCENP-A和KNL-2是秀丽线虫迄今为止，在整个细胞周期中都存在于细胞核中。累积起来，这些结果表明KNL-2和CeCENP-A在染色质上物理上非常接近（并可能直接结合），在那里它们协调地维持着丝粒结构，启动动粒组装，并直接分离染色体。

我们最初鉴定线虫以外的KNL-2同源物的努力失败了，因为基因组测序的三种线虫是密切相关的杆状体。寄生虫丝虫病最新基因组序列的搜索马来丝虫(http://www.tigr.org/tdb/e2k1/bma1/)发现了一种更遥远的线虫KNL-2同源物(图4 A). 通过将丝虫KNL-2的Myb结构域序列与三种杆状体蛋白的类似区域进行比对，我们生成了一个图谱，使我们能够将含有Myb/SANT结构域的KNL-2相关蛋白超家族与所有已测序脊椎动物的成员进行鉴定(图4 B). 根据KNL-2与Mis18的物理联系，最近的一项研究独立发现了KNL-2的人类同源物(Fujita等人，2007年). Mis18首次在裂变酵母中发现，真菌Mis18及其人类同源物都与CENP-A负载有关(Hayashi等人，2004年;Fujita等人，2007年). 线虫中没有明显的Mis18同源物，真菌中也没有可识别的KNL-2同源物。

为了确定人类KNL-2同源物（我们称之为HsKNL2）是否是CENP-A负载所必需的，我们使用针对氨基酸661-899产生的亲和纯化抗体来表征其定位，并进行siRNA-介导的缺失。HsKNL2主要定位于染色体着丝粒区域，位于后期/末期和G1早期之间(图1 C)，这与HeLa细胞中CENP-A加载的时间一致（参见Jansen等人第。795）。目前尚不清楚KNL2在线虫胚胎和培养的哺乳动物细胞之间定位时间不同的原因。最重要的是，HsKNL2的缺失降低了CENP-A的着丝粒水平以及核心动粒组分hDsn1的水平（人类Mis12复合物的一个亚单位；Kline等人，2006年)和Hec1（Ndc80复合物的Ndc80样亚基；图4，D–F;DeLuca等人，2005年). 相反，磷酸组蛋白H3（S10）染色未受影响(图4 G). HsKNL2缺失不会影响CENP-A蛋白水平（未描述），这与秀丽线虫胚胎(图2 D). HsKNL2缺失的细胞表现出严重的染色体分离缺陷，这与其显著的动粒组装缺陷一致（图S4和视频10，可在http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200701065/DC1). 这些结果表明，KNL2蛋白家族参与CENP-A染色质组装，在线虫的全中心染色体和脊椎动物的单中心染色体之间保守。

总之，通过使用功能基因组方法秀丽线虫基于第一次胚胎分裂期间标志性CENP-A功能表型丢失，我们确定了一个保守的含有Myb结构域的蛋白家族，该家族对CENP-A负载至关重要。KNL-2的缺失会导致CENP-a负载因子的所有缺陷，经过广泛的功能基因组学分析，KNL-2是迄今为止在秀丽线虫符合这一基本标准。KNL2包含Myb结构域这一事实增加了一种令人兴奋的可能性，即识别短而特异的DNA序列可能在CENP-a沉积中发挥作用。虽然对新着丝粒的研究表明着丝粒同一性并不是由DNA序列严格定义的(Choo，2000年;克利夫兰等人，2003年)短序列仍有可能延伸偏向着丝粒染色质组装。进一步研究KNL2蛋白家族的Myb结构域如何参与CENP-A负载，将有助于阐明这种广泛保守的蛋白质类指导着丝粒染色质形成的机制。

材料和方法

RNAi和抗体生成

如前所述，通过针对靶基因注射dsRNA进行RNAi(Desai等人，2003年). 对注射后在20°C温度下保存48小时的成人胚胎进行分析。对于KNL-2，通过标准方法使用寡核苷酸AATTAACCCTCACTATAAAGGTCGGACTTGGTCGGACAGATT和TAATACGCACTAGGTGATATGTGGTGTGTGTGGCGTGTGT创建一个～1000-bp dsRNA；所有其他dsRNAs之前都有描述(Desai等人，2003年). 如前所述进行siRNA治疗(Kline等人，2006年)使用从Dharmacon购买的寡核苷酸鸡尾酒。生成KNL-2的氨基酸2-153和HsKNL2的氨基酸661-899的多克隆抗体，并与GST融合，并进行亲和纯化。如前所述，使用直接标记的多克隆抗体进行免疫荧光(Oegema等人，2001年). 使用DeltaVision改良倒置显微镜（IX70；Olympus）和Softworx软件（Applied Precision）获取所有免疫荧光图像，并进行解卷积。在MetaMorph软件（Molecular Devices）中对使用固定曝光条件获得的图像进行免疫荧光定量。

赫拉和秀丽线虫文化

如前所述，HeLa细胞在DME中培养(Kline等人，2006年).秀丽线虫在标准条件下生长(Oegema等人，2001年).

活体成像和GFP融合

所有实时图像均通过安装在倒置显微镜（TE2000e；尼康）上的旋转圆盘共焦显微镜（CSU10；McBain Instruments）获得。使用60×1.4 NA平面Apo物镜和1.5倍辅助放大率和2×2冷却CCD相机（Orca ER；Hamamatsu）对共表达GFP-组蛋白H2b和GFP-γ-微管蛋白的菌株TH32进行成像。在37°C的类似成像条件下对HeLa细胞进行实时成像。表达GFP–KNL-2的菌株OD31以相同的方式成像，无需1.5倍的辅助放大。为了构建OD31菌株，使用寡核苷酸CGCTTCCACTAGTGATACGAAATTGTCC和CGCTTCACAGTTTAGATGGTGTTCCA从cDNA（日本静冈国立遗传研究所Y.Kohara提供）中PCR KNL-2，并用SpeI消化得到的片段，克隆到pIC26中以创建pPM3。pPM3被生物转化为秀丽线虫产生稳定的综合应变。HCP-3–GFP菌株OD101表达HCP-3，其内部GFP融合在HCP-3的N末端末端和组蛋白核心之间。通过用Sac-I消化GFP-PCR产物（正向寡核苷酸GCGCGGAGCTCCATGAGTAAAGGAAGAACATTTTCAC和反向寡核苷酸CGCGAGTCGCTTTGTATAGTTCCATCCATGCACAT），并在HCP-3编码区内的Sac-I限制位点插入残基173，构建HCP-3–GFP轰击的DNA结构。然后将HCP-3–GFP构建物插入pAZ132的Bam-HI位点，并将其生物转化为秀丽线虫产生稳定的综合应变。YFP–CENP-A克隆细胞系是D.Foltz（加州圣地亚哥路德维希癌症研究所；Foltz等人，2006年).

生物化学

从成年OD31中分离出细胞核秀丽线虫简言之，OD31的同步液体培养一直培养到每个成人有5-10个胚胎。通过漂白分离胚胎，并通过几丁质酶处理（最终浓度0.5μg/ml；RT时30分钟；Sigma-Aldrich）分离卵裂球。在低离子强度的缓冲液（0.35 M蔗糖、15 mM Hepes-KOH、pH 7.6、0.5 mM EGTA、5 mM MgCl）中通过均匀化法从卵裂球中分离细胞核2、10 mM KCl、0.1 mM EDTA和蛋白酶抑制剂混合物）和洋地黄素（0.125%最终浓度；Sigma-Aldrich）。在裂解缓冲液中清洗细胞核（50 mM Hepes，pH 7.4，5 mM EGTA，1 mM MgCl2、300 mM KCl、10%甘油、0.1%Triton X-100、0.05%NP-40和蛋白酶抑制剂）并进行超声处理以产生染色质片段。如前所述，将超声混合物澄清，并将上清液用于免疫沉淀(Cheeseman等人，2004年). 使用标准方法进行蛋白质印迹。

冷凝分析

如前所述，对有丝分裂染色体凝集进行量化(Maddox等人，2006年)使用应变TH32和实时成像和GFP融合部分中描述的成像条件。

在线补充材料

图S1显示，KNL-2功能并不局限于秀丽线虫图S2表明，KNL-2在缩合过程中对CeCENP-A的贡献相当，并且在秀丽线虫胚胎。图S3显示，人类细胞中的染色体分离需要HsKNL2。视频1显示了对照组中的染色体分离秀丽线虫胚胎共表达GFP-组蛋白H2b和GFP-γ-微管蛋白。视频2和3显示CeCENP-A（视频2）和KNL-2缺失（视频3）中的染色体分离秀丽线虫共表达GFP-组蛋白H2b和GFP-γ-微管蛋白的胚胎。视频4显示控件中的GFP–KNL-2秀丽线虫胚胎，视频5显示了CeCENP-a缺失的GFP–KNL-2秀丽线虫胚胎。视频6显示对照中的GFP–CeCENP-A秀丽线虫胚胎，视频7显示KNL-2缺失的GFP–CeCENP-A秀丽线虫胚胎。视频8和9显示了CeCENP-C中的GFP–KNL-2（视频8）和KNL-1–耗尽（视频9）秀丽线虫胚胎。视频10显示DIC和YFP–CENP-A控制时间延迟（顶部）和HsKNL2缺失（底部）有丝分裂HeLa细胞。在线补充材料可在http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200701065/DC1.

致谢

我们感谢托尼·海曼（Tony Hyman）分享功能基因组学筛查数据，并感谢他的支持，感谢小原由纪夫（Yuji Kohara）对cDNA的支持，感谢伊恩·齐斯曼（Iain Cheeseman）和艾米·肖布·马多克斯（Amy Shaub Maddox）对批判性阅读的支持，谢谢丹·福尔茨（Dan Foltz）对YFP–CENP-A细胞系的支持，也感谢拉尔斯·詹，以及Oegema和Desai实验室的成员进行有益的讨论。

P.S.Maddox是Damon Runyon癌症研究基金会（DRCRF；授予DRG-1808-04）的Fayez Sarofim研究员，K.Oegema是Pew生物医学科学学者，a.Desai是DRCRF的Connie and Bob Lurie学者（授予DRS 38-04）。这项工作得到了美国国立卫生研究院对a.Desai的拨款（R01-GM074215）以及路德维希癌症研究所对K.Oegema和a.Desai.的工资支持。

笔记

本文中使用的缩写：CENP-A，着丝粒蛋白A；DIC、差分干涉对比；双链RNA；KNL，动粒为零。

工具书类

  • Aasland，R.、A.F.Stewart和T.Gibson。SANT结构域：SWI-SNF和ADA复合物、转录共抑制因子N-CoR和TFIIIB中的假定DNA-结合结构域。生物化学趋势。科学。 21:87–88.[公共医学][谷歌学者]
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文章来自细胞生物学杂志由以下人员提供洛克菲勒大学出版社