SNP阵列分析揭示癌症中的等位基因特异性扩增

正常样本的基因分型

我们将我们的方法应用于九个样本（见上文），这九个样本由国际HapMap项目联盟的中心独立进行基因分型。九个不同的中心参与了这些样本的基因分型。他们使用了多种平台，包括质谱、酶反应、杂交和基于聚合酶链反应（PCR）的技术。100K SNP阵列和HapMap工作中都有大约22000个SNP。在我们研究的9个样本中，共有1198个SNP由两个或多个不同的HapMap中心进行基因分型，导致10782个样本SNP调用。这些多重基因型样本SNP之间的一致性调用可以被视为非常接近“金标准”结果，我们将其用作评估调用准确性的基准。表1总结了比较。HapMap结果的呼叫率为98.7%。在这些呼叫中，中心之间的一致率超过99%。我们的基因分型算法表现很好，实现了99.27%的调用率，不符合1%的调用的共识HapMap基因分型。结果表明，我们的方法具有很高的准确率，并且很好地说明了模型的适用性。

表1

我们模型的呼吁与国际HapMap项目中多个中心的呼吁之间的一致性

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的一个功能表1值得进一步评论的是，我们的算法将16个样本SNP称为AA，HapMap联盟将其称为BB。所有16个差异均出现在两个SNP中的其中一个，即rs1323113或rs2284867。对这些SNP中的每一个处的40个探针的原始强度的仔细检查（数据未显示）揭示了所讨论的样品的强AA信号。一个可能的解释是，当Affymetrix将其标记与HapMap工作的等位基因匹配时，A和B标签无意间被这两个SNP转换。

癌症DNA样本中的ASCN和PSCN

通过考虑一个基因组区域中总拷贝数为5的四个连续SNP的假设示例，可以更好地理解ASCN和PSCN之间的区别。假设SNP的等位基因A拷贝数分别为4、0、5和1，而等位基因B拷贝数为1、5、0和4。这就是我们所说的ASCN。单独来看，第二和第三SNP的ASCN与PSCN无关，因为母染色体和父染色体都有相同的等位基因。然而，第一和第四个SNP都表明亲本染色体中的一条被扩增到拷贝数为4，而另一条没有改变。因此，我们推断包含四个SNP的整个基因组区域的PSCN为四个和一个。SNP位点的ASCN可被视为样本的广义基因型。

我们最初在一组12个肺癌样本上测试了我们的PLASQ算法，我们最近报告了这些样本的总拷贝数分析[25]在对12个正常样本进行了模型标定后。这些癌症样本包括一个小细胞原发肿瘤、两个非小细胞原代肿瘤和九个细胞系。请参阅[25]以及材料和方法，以了解更多详细信息。所有推断的纯合子缺失都在表2，而总拷贝数至少为5的所有推断扩增都在表3。推测的PSCN的全基因组视图显示为H2122和HCC95细胞系图3图中没有高水平的小染色体拷贝数（红条）表明扩增基本上是单等位基因。

表2

12份肺癌样本的所有血浆推断纯合子缺失

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表3

12份肺癌样本中至少5份总拷贝数的所有PLASQ推断扩增

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图3

H2122和HCC95细胞基因组中PSCN的描述

在这两个图中，绿色表示较高拷贝数的亲本染色体，红色表示较低拷贝数的父本染色体。每个红色/绿色条的总高度表示相应SNP的总拷贝数。黑色条表示纯合缺失，总拷贝数为零。

表3

继续的

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在所有12个样本中，总推断拷贝数至少为5的所有放大器如所示图4该图最显著的特点是，绝大多数扩增只涉及两条亲本染色体中的一条。也就是说，这里的扩增是单等位基因。从图中还可以清楚地看出，真实LOH（没有红色部分的条）和虚假LOH（部分为红色的条）之间的区别。我们对其他89个样本重复了我们的分析（数据未显示），在这些样本上我们同样得到了这样的结果：扩增子几乎完全由两条亲本染色体中的一条组成。

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图4

PLASQ推断总拷贝数至少为5的所有已发现扩增子的PSCN

每个条的高度表示该放大器的总拷贝数。亲本染色体的拷贝数由每个条的红色和绿色部分表示。如图所示，当没有红色部分时，会发生LOH。

为了使用一种独立的方法对我们的PLASQ方法进行实验验证，我们应用了等位基因特异性实时PCR。ASCN分析要求通过实时PCR对标准拷贝数分析进行更改。使用Taq聚合酶的标准条件导致目标等位基因扩增，以及其他SNP等位基因的延迟扩增。Taq聚合酶的Stoffel片段缺乏该酶正常的5′至3′核酸外切酶活性，增加了该酶对正确靶点的特异性[26,27]. 因此，这增加了扩增延迟，足以区分两个等位基因并计算准确的拷贝数。

在[25]，我们使用标准实时PCR来验证“重复”扩增和缺失的总拷贝数。如果一个事件发生在至少两个样本中，包含至少四个SNP，并且长度至少为5kb，我们将其定义为复发。我们的PLASQ分析与等位基因特异性和标准实时PCR的比较如下表4和​和55对于我们最初12个样本中发生的这些复发事件。PLASQ与纯合缺失的PCR测量结果基本一致(表4). 用于放大(表5)，我们的估计与等位基因特异性PCR结果之间有很强的一致性。四舍五入的次要等位基因估计值在除一个病例外的所有病例中最多相差一个拷贝。关于主要等位基因拷贝数推断表5，我们的估计值往往偏低，尽管PCR结果总是处于较高水平。这些差异可能是寡核苷酸阵列中众所周知的饱和效应的结果[28]. 只有一种情况下，总PCR估计值来自[25]低于血浆总量。这里，等位基因特异性PCR结果与我们推断的ASCN更为一致，表明这是标准实时PCR中的实验错误。

表4

推测ASCN与PCR缺失结果的比较

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表5

推断的ASCNs与扩增的PCR结果的比较

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一种类型的差异表5脱颖而出。在两种情况下，PLASQ推断ASCN为1，而实验确定的拷贝数基本上为零。一种可能的解释是，我们的推断是正确的，低PCR估计值归因于实验错误，如次优引物序列。另一方面，在基于杂交的强度测量中，我们的ASCN调用在一定程度上容易受到固有噪声的影响。在单个SNP级别上，由于这种噪声，一个拷贝号在两个方向上的偏差可能很难检测到，从而导致ASCN调用稍有不准确。然而，由于PSCN的局部常数特性，我们可以从相邻SNP的原始ASCN“借用强度”，因此PSCN调用中的这些不准确度得到了改善。因此，例如，即使单个ASCN调用稍有错误，区域的LOH调用也会非常精确。

值得注意的是，在所有情况下，我们的方法都可以清楚地检测到感兴趣的性质，即每个染色体中是否存在扩增或缺失，因为所有方法在这方面都是一致的。最后，为了评估我们确定扩增子和缺失边界的准确性，我们比较了在[25]使用dChipSNP计算平台中实现的算法[9]我们的结果。比较如所示表6对于中的事件表4和​和5。5在大多数情况下，我们估计的蚀变边界与dChipSNP推断的边界完全一致。两种方法推论不同的事件可能是由于程序上的差异，例如用于确定增益是否应称为放大的不同拷贝数阈值。

表6

血浆推断的病变边界与来自[25]

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DNA样本。

我们从分析的所有肺癌肿瘤和细胞系中获得了Affymetrix.cel文件[25]. 在我们的分析中，我们使用了与该研究中的实验产生的相同的原始Probelevel数据。为了进行初步分析，我们选择了细胞系H157、H2087、H2122、H2126、H2882、HCC95、HCC827、HCC1359和HCC1171，以及肿瘤S0177T、S0465T和S0515T。选择这12个样本是因为每个样本都被发现了[25]藏匿至少两个被认为是经常性的拷贝号变更。随后，我们将我们的方法应用于该研究中剩下的89个肿瘤和细胞系。此外，研究中使用了该论文中的12个正常样本。有关所有样品的制备、杂交和图像采集的详细信息，请参阅[25]，所有.cel文件都位于http://research2.dfci.harvard.edu/dfci/snp/。我们从Affymetrix网站获得了HapMap样本的.cel文件(http://www.affmetrix.com).

正常样本基因分型。

在这种情况下，对于每个样本C _一个SNP为零、一或二。的价值C _B类完全取决于C _一个，作为C _一个+C _B类= 2. 因此，我们可以认为每个样本SNP处于三种状态之一，对应于AA、AB和BB基因型。这些状态不是先验已知的，α，β的值也不是先验已知的₀、和β₁。我们使用期望最大化算法[24]在每个SNP中推断基因型并估计参数。简单地说，我们首先使用粗品初始化每个样本的三种基因型的概率t吨-测试方法。基于这些初始“猜测”，我们应用普通最小二乘法[37]对于我们的模型，求参数α，β的最大似然估计₀、和β₁（M步骤）。接下来，基于这些估计，我们使用三种可能基因型中每一种的指示变量的预期值重新传递每个样本的基因型概率（E步）。将最大化和期望这两个步骤迭代，直到所有未知值的近似值收敛。此过程的结果是每个基因型的估计概率以及参数估计。算法对每个样本SNP的调用是最终估计概率最大的基因型，除非最大值低于用户定义的阈值（默认值为99%），在这种情况下，会给出“No call”。我们随后使用最终参数估计$\stackrel{<trans\; data-src="̂">̂</trans>}{\mathrm{<trans\; data-src="\alpha ">\alpha </trans>}}$,$\stackrel{<trans\; data-src="̂">̂</trans>}{\mathrm{<trans\; data-src="\beta ">\beta </trans>}}$、和$\stackrel{<trans\; data-src="̂">̂</trans>}{\mathrm{<trans\; data-src="\beta ">\beta </trans>}}$₁α，β₀、和β₁分别将模型应用于来自癌细胞的数据（见下文）。

癌症DNA样本中的总拷贝数。

在异常样本中，A和B等位基因的拷贝数不再局限于每个SNP的总和为2。如上所述在正常样本上校准模型后，我们替换参数α、β₀、和β₁在我们的模型中，他们对每个SNP的估计。我们直接应用最小二乘估计找到每个SNP的A和B拷贝数的原始推断（“原始”，因为我们尚未利用总拷贝数的局部恒常性）。这些粗略的度量称为原始ASCN。虽然ASCN在样本中不是局部常数，但它们的两两总和C _一个+C _B类是。因此，我们将每个SNP处原始ASCN的成对和输入到循环二进制分割算法中[38]推断总拷贝数。这种平滑算法利用了这样一个事实，即染色体改变通常发生在包含多个SNP的片段中。简单地说，循环二进制分割通过递归地将染色体分裂成候选子段并计算最大值来搜索局部恒定截面t吨-反映子段之间平均总原始拷贝数差异的统计信息。此统计的参考分布通过排列估计，用于决定是否在每个阶段永久拆分。结果是对样本中的每条染色体进行分割，其中总拷贝数在每个片段中被认为是恒定的。一个片段的原始总拷贝数是该片段中所有SNP的原始ASCN的成对和的平均值。

PSCN和ASCN。

循环二进制分割算法将每个样本的基因组划分为多个片段，每个片段假设具有相同的总拷贝数。考虑一个带有n个SNP和原始总拷贝数T型 _{未经加工的}。我们推断该段的PSCN如下。如果n个<4，我们认为T型 _{未经加工的}由于观测次数较少，噪声过大，并推断PSCN（1，1）。对于n≥4，如果T型 _{未经加工的}≤0.35，该片段被称为纯合缺失，给出PSCNs（小染色体，大染色体）=（0，0）。如果为0.35<T型 _{未经加工的}≤1.35，我们称之为PSCNs杂合缺失（0，1）。如果T型 _{未经加工的}>1.35，我们推断的总拷贝数T型很简单T型 _{未经加工的}四舍五入为最接近的整数（如果为1.35，则为二<T型 _{未经加工的}≤2.5），我们按以下步骤进行。

让一个 ₁,一个 ₂,…,一个_n个和B类 ₁,B类 ₂,…,B类_n个表示原始ASCNn个细分市场中的SNP。我们认为SNP我如果最小，则为纯合子(一个_我，B_我) ≤ 0.5. 我们必须首先考虑亲本染色体中的一条被删除而另一条被扩增的可能性，即SNP可能是纯合的，因为它在正常细胞中是纯合子，或者因为LOH。由于阵列上SNP的平均杂合度为0.3[39]，随机选择的SNP纯合子的概率为0.7。因此，我们将没有染色体缺失的片段中纯合子SNP的数量建模为二项式(编号：，0.7）随机变量X（X）.如果出现以下情况，则由此产生的假设检验将拒绝α水平无LOH的无效假设

针对分段总数的多次测试进行保守的Bonferroni修正第页，如果无效假设在α=0.05处被拒绝，我们假设一条染色体缺失/秒级别。在这种情况下，我们推断的PSCN为（0，T型). 否则，请注意（如结果所述）纯合SNP位点与PSCN无关。因此，我们暂时忽略了这些SNP米苏格兰民族党（m≤n）我们重新标记其原始ASCN一个 ₁,一个 ₂,…,一个_米和B类 ₁,B类 ₂,…,B类_米我们推断的小染色体PSCN是

四舍五入到最接近的整数。为了确保总拷贝数T、，推断的主要染色体PSCN是T型−（推断的小染色体PSCN）。

一旦确定了PSCN，ASCN将立即从这些和原始ASCN中得出。纯合子SNP（如上文所述确定）被分配给具有较大原始ASCN的等位基因。杂合SNP被分配给ASCN，因此具有较大原始ASCN的等位基因具有主要亲本染色体的拷贝数。

本项目得到了以下拨款的支持：国防部拨款PC040638（RB）、Claudia Adams Barr癌症研究计划（CL）、美国国家变态反应和传染病研究所拨款2R01 AI052817（DH）、国家癌症研究所拨款R01CA109038（WRS）、Damon Runyon癌症研究基金会，美国癌症协会授予RSG-03–240–01-MGO（MM）和空乘研究所（MM）。作者们感谢埃里克·兰德（Eric Lander）的有益评论，也感谢裁判，他们的仔细阅读和评论使手稿得到了很大的改进。