过度表达裂解物
背景
概述
过度表达细胞裂解物是一种分子生物学工具，它通常是由特定基因过度表达的细胞混合而成，并进行了裂解处理。这些裂解物包含细胞中的所有蛋白质，包括靶蛋白的过度表达。这种裂解物在蛋白质研究中非常有用，特别是在蛋白质表达、功能分析、抗体生产和验证以及蛋白质相互作用研究中。
准备过程
选择合适的宿主细胞系，如昆虫细胞或哺乳动物细胞。这取决于目标蛋白的复杂性和所需的翻译后修饰。
将含有目标基因的表达载体转染或转化到宿主细胞中，使其在细胞中过度表达。
转化后的细胞进行培养以扩增和过度表达目标蛋白。
收集并切割细胞以释放细胞内的所有蛋白质，包括过度表达的靶蛋白。
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高度表达。它提供了高浓度的目标蛋白，便于生化实验和功能研究。
高效。它可以快速获得大量样品，加快实验过程。
生物相关性。与体外合成的重组蛋白相比，过表达细胞裂解物中的目标蛋白可能保留更多的生物活性和翻译后修饰，更适合于功能研究。
注意事项
背景蛋白：裂解液可能含有大量非目标蛋白质，这可能会影响特定蛋白质的检测和分析。
蛋白质稳定性：在切割和储存期间，需要特别注意目标蛋白的稳定性，以防止降解
再现性：应考虑潜在的批次可变性，这可能会影响实验的重复性和可靠性。
应用
- 蛋白质功能研究：通过过度表达细胞裂解物，研究人员可以研究目标蛋白的功能，包括其酶活性、结合特性或信号作用。
- 抗体生产和验证：裂解物可用于产生针对目标蛋白的特异性抗体，并通过Western Blot等技术验证抗体的特异性和效力。
- 蛋白质相互作用：使用过表达细胞裂解物的免疫共沉淀（Co-IP）实验可以识别与目标蛋白相互作用的其他蛋白质。
- 蛋白质纯化：所述裂解产物可作为纯化目标蛋白的起始材料，并且可通过亲和层析等方法进一步纯化目标蛋白。
案例研究
案例研究1：重组人SMN1 293细胞裂解液(SMN1-1660盐酸)
近年来，由于碳纳米材料的高导电性、机械强度和大表面积，将碳纳米材料集成到电化学传感器中引起了人们的极大兴趣。然而，还没有关于不同碳纳米材料适配体传感应用的对比研究报告。本研究报告了六种碳电极材料（碳、石墨烯（G）、氧化石墨烯（GO）、多壁碳纳米管（MWCNT）、单壁碳纳米管和碳纳米纤维（CNF））在物理吸附制备的血红蛋白A1C（HbA1c）apperomer传感器上的性能比较研究。对不同纳米材料的适配体吸附、传感器响应和选择性的比较表明，swcnts传感器具有更好的性能。对于HbA1c选择性实验，适配体修饰电极与20 1μL溶液 30 ng/mL CFTR、SMN、STAT3和DOCK8 伏安swcnts适配体传感器对总血红蛋白（tHb）和糖化血红蛋白（HbA1c）的检测显示出较高的灵敏度和选择性。对囊性纤维化跨膜传导调节器（CFTR）、存活运动神经元（SMN）、细胞质分裂奉献因子8（DOCK8）、信号转导子和转录激活物3（STAT3）等血液蛋白具有选择性。
（希马·艾萨，2019年）
图1.针对1的HbA1c适体测定选择性 纳克/毫升HbA1c、CFTR、SMN、STAT3和DOCK8。
案例研究2：重组人ATF1 293细胞裂解液(ATF1-8632HCL公司)
多个全基因组研究已确定人类免疫缺陷病毒（HIV）感染结果与编码HIV辅受体CCR5的基因及其周围的多态性之间的关联，但这些关联中最强的rs1015164A/G的功能基础尚不清楚。发现rs1015164标记了激活转录因子1结合位点的变异，该结合位点控制反义长非编码RNA（lncRNA）CCR5AS的表达。CCR5AS表达的下调或增强导致CD4+T细胞上CCR5表达的相应变化。CCR5AS干扰RNA结合蛋白Raly和CCR5的3'非翻译区之间的相互作用，保护CCR5信使RNA免受Raly介导的降解。通过在体外抑制CCR5AS来减少CCR5的表达，可以减少CD4+T细胞对CCR5-CR5-addited HIV的感染。在电泳迁移率转移分析中，使用转染重组人Atf1的HEK 293裂解液作为阳性对照。
（希马·艾萨，2019年）
图2.使用32P标记的寡核苷酸进行电泳迁移率变化分析（EMSA），该寡核苷酸包含含有rs2027820的A或G变异体的ATF1的核心结合序列。
案例研究3：重组人SMN1 293细胞裂解液(SMN1-1660盐酸)
高免疫球蛋白E综合征（HIES）是一种罕见的遗传性出生缺陷，HIES是通过信号转导子和转录激活物3（STAT3）或细胞分裂奉献因子8（DOCK8）基因的杂合或纯合突变分别以常染色体显性和隐性形式遗传的。因此，早期检测人类DOCK8和STAT3蛋白水平将有助于这些疾病的早期诊断，从而有助于疾病的管理。本研究介绍了使用电化学阻抗谱法以无标签格式检测DOCK8和STAT3的免疫传感器的开发。用半胱胺/苯基二硫氰酸酯连接剂将DOCK8和STAT3特异性抗体共价连接到金电极上制备免疫传感器。这种检测是通过监测铁/铁氰化物REDOX对与免疫传感器表面结合后电荷转移电阻（Rct）的变化来实现的。这些生物传感器能够检测DOCK8和STAT3水平，检测极限分别为1.2和9.0 pg/ml。该免疫传感器还用于检测人血清样品中的DOCK8，显示出较高的回收率。
（希马·艾萨，2019年）
图3.DOCK8免疫传感器对1ng/mL BSA、STAT3、CFTR或SMN的传感器响应。
案例研究4：重组人SMN1 293细胞裂解液(SMN1-1660盐酸)
脊髓性肌萎缩是一种无法治疗的潜在致命遗传病，由编码SMN蛋白的存活运动神经元（SMN）1基因的功能丧失突变引起。目前迫切需要准确量化SMN蛋白水平，以便分别对有症状的新生儿和SMA患者进行筛查和治疗监测。在这里，研究团队开发了一种基于共价功能化碳纳米纤维修饰丝网印刷电极的伏安免疫传感器，用于SMN蛋白的灵敏检测。对六种不同的碳纳米材料修饰电极（碳、石墨烯（G）、氧化石墨烯（GO）、单壁碳纳米管（SWCNT）、多壁碳纳米管和碳纳米纤维（CNF））进行了比较研究。六种免疫传感器的电化学表征和分析性能表明，纳米碳纤维是一种较好的SMN免疫传感器电极材料。基于伏安法的SMN碳纳米纤维免疫传感器对囊性纤维化跨膜电导调节器（CFTR）和肌营养不良蛋白（DMD）等其他蛋白质具有较高的灵敏度（检测限为0.75pg/ml）和选择性。
（Shimaa Eissa，2018）
图4.随着SMN蛋白孵育时间的增加，CNF免疫传感器的响应。
优势
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工具书类
- Eissa S，Almusharraf AY，Zourob M.不同碳纳米材料修饰丝网印刷电极上糖化血红蛋白伏安适配体传感器性能的比较。材料科学与工程C材料生物应用. 2019;101:423-430.
- 库尔卡尼S。；等CCR5AS lncRNA变异对CCR5进行差异调节，从而影响HIV疾病结局[已发表的更正见Nat Immunol.2019年11月；20（11）：1555]。自然免疫学。2019;20(7):824-834.
- 艾萨，S。；等《诊断DOCK8和STAT3相关高免疫球蛋白E综合征的免疫缺陷传感器的开发》电分析. 2018;30:2021-2027.
- Eissa S。；等使用不同碳纳米材料修饰电极检测存活运动神经元（SMN）蛋白的电化学免疫传感器。Biosens生物电子. 2018;101:282-289.
