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什么是CLIP?
随着我们开始认识到RNA的作用,人们对RNA-蛋白质相互作用的兴趣日益浓厚,不仅在转录、剪接和翻译等成熟过程中,而且在非编码RNA的RNA干扰和基因调控等新领域中。
CLIP是一种基于抗体的技术,用于研究与RNA免疫沉淀(RIP)相关的RNA-蛋白质相互作用,但与RIP不同的是,CLIP使用紫外线辐射将RNA-结合蛋白交联到它们所结合的RNA上。这种共价键是不可逆的,允许严格的纯化条件。与RIP不同,CLIP提供了RNA上实际蛋白质结合位点的信息。
存在不同类型的CLIP,高通量序列分析CLIP(HITS-CLIP)、光活化核苷增强CLIP(PAR-CLIP)和单个CLIP(iCLIP).
以下是iCLIP协议的摘要,改编自科尼格等.J.视觉。2011年到期。“iCLIP-蛋白质-RNA相互作用与单个核苷酸分辨率的转录组宽映射。”
进一步改编自赫伯茨等.方法。2014.“iCLIP:核苷酸分辨率下的蛋白质-RNA相互作用。”
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试剂
裂解缓冲液
50 mM Tris-HCl,pH 7.4
100 mM氯化钠
1%NP-40
0.1%十二烷基硫酸钠
0.5%脱氧胆酸钠
蛋白酶抑制剂(每次添加新鲜的)
高盐洗涤
1M氯化钠
1 mM乙二胺四乙酸二乙酯
低核糖核酸酶稀释高核糖核糖核酶稀释
用于文库制备的1/500 RNase I稀释液1/50 RNaseⅠ稀释液用于抗体控制
特异性
洗涤缓冲液PNK混合物
20 mM Tris-HCl,pH 7.4
10 mM氯化镁2
0.2%吐温-20
15μL水
4μL 5x PNK pH 6.5缓冲液[350 mM Tris-HCl,pH 6.5;50 mM MgCl2; 5 mM二硫苏糖醇];
0.5μL PNK酶
0.5微升RNasin
结扎混合物A热粉色混合物
9μL水
4μL 4x结扎缓冲液[200 mM Tris-HCl;40 mM MgCl2; 4 mM二硫苏糖醇]
1μL RNA连接酶
0.5μL核糖核酸
1.5μL预腺苷酸连接体L3[20μM]
4μL聚乙二醇400
0.4μL粉色
0.8μL 32P-γ-ATP
0.8μL 10x PNK缓冲液
6μL水
PK缓冲液PK尿素缓冲液
100 mM Tris-HCl pH 7.4
50 mM氯化钠
10 mM乙二胺四乙酸二乙酯
700万尿素
RNA/引物混合物RT混合物
6.25μL水
0.5μL Rclip底漆[0.5 pmol/μL]
0.5μL dNTP混合物[10 mM]
2μL 5x RT缓冲液
0.5μL 0.1M DTT
0.25μL上标III逆转录酶
连接混合物B寡核苷酸退火混合物
6.5μL水
0.8μL 10x环合酶缓冲液II
0.4μL 50 mM二氧化锰
0.3μL环化酶II
26μL水
3μL FastDigest缓冲液
1μL切割低聚物[10μM]
PCR混合物
19μL cDNA
1μL底漆混合物P5/P3 solexa
每个10μM
20μl Accuprime Supermix 1酶
CLIP协议
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1.组织培养细胞的紫外线交联
1.1. 移除培养基并将冰冷的PBS添加到细胞中(例如使用在10cm板中生长的细胞进行三次实验并添加6ml PBS)。
1.2. 取下盖子,放在冰上,用150 mJ/cm照射一次2使用Stratalinker在254 nm处。
在整个实验过程中,应保持一个或多个阴性对照。敲除细胞或组织以及非交联细胞是良好的阴性对照,而不建议使用敲除细胞。
注:。可选的4-硫尿苷预培养和UV-A交联可用于某些蛋白质。 4-硫尿苷可增强某些蛋白质的交联。(对于此可选步骤,请按照以下说明进行操作)。
可选–硫脲标记和UV-A交联(替代步骤1.2)
•将50μL 4SU(原液浓度:100 mM 4SU)添加到10 cm培养板中的细胞,该培养板由10 ml DMEM培养而成,DMEM补充有FBS和笔画,最终浓度为500μM 4SU。或者,添加10μL 4-硫代尿苷(储备浓度:100 mM),以获得最终浓度100μM 4SU。
•用4-硫代尿苷在500μM下培养细胞60分钟,或在100 mM下培养8小时。检查细胞活力。
•吸入培养基,向10 cm培养板中生长的细胞中添加6 mL冰镇PBS(足够三次免疫沉淀)。取下盖子并放在冰上。
•用2×400 mJ/cm照射一次2在Stratalinker 2400中使用365 nm灯泡或同等仪器。
1.3. 用细胞刮板收集细胞,并将细胞悬浮液转移到微管中(例如,将2 mL转移到三个微管中的每一个)。
1.4. 沉淀细胞(在4°C下以最高速度旋转10秒),然后去除上清液。
1.5. 在干冰上快速冷冻细胞颗粒,并在-80°C下保存,直至使用。
实验可能需要长达一周的时间。避免多次冻融循环。
1.6珠子制备
1.6.1将蛋白质A或蛋白质G珠(例如每次实验100μl磁珠)添加到新鲜的微管中,并用裂解缓冲液清洗2倍的珠。
1.6.2在裂解缓冲液(100μL)中重新悬浮小球,添加抗体(2-10μg),并在室温下旋转试管30–60分钟。
所需的抗体量可能需要优化。无抗体样本是良好的阴性对照。
1.6.3. 用裂解缓冲液(900μL)清洗珠子3x,并保留在最后一次清洗中,直到准备好进行免疫沉淀(步骤3.1)。
如果抗体在IP中起作用,这是一个很好的迹象,表明它将在CLIP中发挥作用。
2.细胞裂解和部分RNA消化
2.1. 用蛋白酶抑制剂(1 mL)将细胞颗粒重新悬浮在裂解缓冲液中,并转移到1.5 mL微管中。
注:。在这里你可以尝试一个可选的超声波步骤。超声波剪切DNA,从而从染色质中释放蛋白质,增加蛋白质-RNA复合物的回收。
可选–样品超声处理
使用探头声波仪在冰上对样品进行声波检测。探针不应接触管侧,以避免起泡。以5分贝的速度发出两次10秒的声音。通过超声波H清洁探针2O样品处理前后。
或者
使用Biolruptor plus五个周期,在低强度下交替开启30秒或关闭30秒。
2.2. 向细胞裂解液中添加低RNase稀释液(10μL)和Turbo DNase(2μL),并在37°C下培养3分钟,以1100 rpm的转速摇晃,然后立即转移到冰中。
2.3. 在4°C、22000 g的温度下旋转10分钟,并仔细收集清除的上清液(将约50μL的裂解液与颗粒一起保留)。
实验室的每个成员都应该使用自己的一套缓冲液和试剂,以便于识别潜在的污染源。RNase消化的理想条件可能需要针对每批新RNase进行优化。
3.RNA 3'末端的免疫沉淀和去磷酸化
3.1. 从珠中除去裂解缓冲液(步骤1.1.3),并加入细胞裂解物(来自步骤2.3)。
3.2. 在4°C下旋转样品2小时。
3.3. 丢弃上清液,用高盐缓冲液(900μL)洗涤2次珠子,然后用洗涤缓冲液(90μL)清洗2次。在4°C下旋转这些清洗液至少1分钟。
优化和严格的清洗条件非常重要。
注:。如果标准iCLIP条件不够严格,无法专门纯化感兴趣的蛋白质,可以使用尿素变性的双重免疫沉淀来代替此处描述的方案。有关更多信息,请参见Huppertz等人的方法。2014.“iCLIP:核苷酸分辨率下的蛋白质-RNA相互作用。”
3.4. 丢弃上清液,将珠子重新悬浮在PNK混合物(20μL)中,并在37°C的温度下在热混合器中培养20分钟。
3.5. 添加洗涤缓冲液(500μL),用高盐缓冲液洗涤1x,然后用洗涤缓冲液洗涤2x。
4.RNA 3’端的连接子连接和RNA 5’端标记
4.1. 小心去除上清液,将珠子重新悬浮在结扎混合物A(20μL)中,并在16°C的温度下在热混合器中培养过夜。
4.2. 添加洗涤缓冲液(500μL),用高盐缓冲液(1 mL)洗涤2次,然后用洗涤缓冲液清洗2次(1 mL)。在4°C下进行这些清洗,每次5分钟。
4.3. 去除上清液,在热的PNK混合物(4μL)中重新悬浮珠子,并在37°C下培养5分钟。
4.4. 取出热的PNK混合物,并在1x SDS-PAGE加载缓冲液(20μL)中重新悬浮珠子。
4.5. 在70°C的热混合器上培养10分钟。
4.6. 立即放在磁铁上沉淀空珠,并将上清液加载到凝胶上(参见步骤5)。
5.连接剂SDS-PAGE和膜转移
5.1. 将样品和预先保存的蛋白质尺寸标记物(5μL)装载在预制的4-12%Bis-Tris凝胶上,并在1x MOPS运行缓冲液中以180 V的电压运行凝胶50分钟(根据制造商的说明)。
建议使用pH值恒定为7的凝胶。
5.2. 取出凝胶正面并作为固体废物丢弃(含有游离放射性ATP)。
5.3. 使用湿转移装置将蛋白质-RNA复合物从凝胶转移到硝化纤维素膜(根据制造商的说明,在30 V下转移1 h)。
5.4. 转移后,在PBS缓冲液中冲洗膜,然后将其包裹在贴膜中,并在-80°C下将其暴露在薄膜中30分钟、1小时,然后过夜。
之后,靠近薄膜的荧光贴纸可以使薄膜与薄膜对齐。实验的成功可以通过膜转移后蛋白-RNA复合体的放射自显影来监测。
图1:典型自动射线照片
*控制实验应在放射自显影上无信号。在低核糖核酸酶样品的放射自显影中,在蛋白质分子量以上应能看到弥漫放射性。对于高核糖核酸酶样品,这种放射性更接近蛋白质的分子量。
6.RNA分离
6.1. 使用步骤5.4中的放射自显影仪作为掩膜,从膜上分离蛋白质-RNA复合物。将这片膜切成几小片,然后放入1.5毫升的微管中。
6.2. 向膜片中添加PK缓冲液(200μL)和蛋白酶K(10μL),并在37°C下以1100 rpm摇晃20分钟。
6.3. 添加PK尿素缓冲液(200μL),并在37°C下培养20分钟。
6.4. 收集溶液,将其与RNA苯酚/氯仿(400μL)一起添加到2 ml锁相凝胶重管中,并在30°C下以1100 rpm摇晃培养5分钟。
6.5. 在室温下以13000 rpm的转速旋转5分钟,以分离相位。
6.6条。小心地将水层转移到新管中。
6.7、。加入糖蓝(0.75μL)和3M乙酸钠(pH 5.5)(40μL)并混合。然后添加100%乙醇(1 mL),再次混合并在-20°C下沉淀过夜。
7.逆转录
7.1. 在4°C下以15000 rpm转速旋转20分钟,然后去除上清液并用80%乙醇(0.5 ml)清洗颗粒。
7.2. 在RNA/引物混合物(7.25μL)中重新悬浮颗粒。对于每个实验或复制,使用包含单个条形码序列的不同Rclip引物(见11)。
7.3. 在70°C下培养5分钟,然后冷却至25°C。
7.4. 加入RT混合物(2.75μL),在冷却至4°C之前,在25°C下培养5分钟,在42°C下培育20分钟,在50°C下孵化40分钟,在80°C下孵育5分钟。
7.5. 加入TE缓冲液(90μL)、乙醇蓝(0.5μL)和pH 5.5的醋酸钠(10μL)并混合;然后添加100%乙醇(250μL),再次混合并在-20°C下沉淀过夜。
8.cDNA的凝胶纯化
8.1. 旋转并清洗样品(见7.1),然后将颗粒重新悬浮在水中(6μL)。
8.2、。添加2x TBE-尿素加载缓冲液(6μL),将样品直接加热到80°C 3分钟,然后加载到预制的6%TBE-脲凝胶上。同时加载低分子量标记以进行后续切割(见下文)。
8.3. 根据制造商的说明,将凝胶在180 V下运行40分钟。这导致凝胶中cDNA和染料(浅蓝色和深蓝色)的可复制迁移模式。
注:。你也可以在这里尝试进一步的苯酚/氯仿萃取步骤,因为尿素和聚丙烯酰胺的夹带会降低环连接酶II的效率。结扎混合物B中存在CircLigase II(步骤9.1)。
图2:cDNA迁移模式示意图。
8.4. 使用剃须刀片在120-200℃时切割(红线)三条cDNA片段纳特(高(H)),85-120纳特(中等(M))和70-85纳特(低(L))。首先切割淡蓝色染料的中间部分,将中低部分分开,并修剪高部分和低部分。使用由口袋和染料引导的垂直切口来分隔不同的车道(在本例中为1-4)。可以对标记车道(m)进行染色和成像,以控制切割后的尺寸。碎片大小显示在右侧。
8.5. 添加TE(400μL),并使用1 mL注射器柱塞将凝胶片压碎成小块。在37°C下以1100 rpm的转速摇晃培养2小时。
8.6. 将两个1 cm的玻璃预滤器放入Costar SpinX柱中,并将样品的液体部分转移到柱中。以13000转/分的速度在1.5毫升的试管中旋转1分钟。
8.7. 添加糖蓝(0.5μL)和pH 5.5(40μL)的醋酸钠,然后混合样品。添加100%乙醇(1 mL),再次混合并在-20°C下沉淀过夜。
9.引物与cDNA 5'端的连接
9.1. 旋转并清洗样品(见7.1),然后在结扎混合物B(8μL)中重新悬浮颗粒,并在60°C下培养1小时。
9.2. 添加低聚退火混合物(30μL),并在95°C下培养1分钟。然后每隔20秒将温度降低1°C,直到达到25°C。
9.3条。添加BamHI(2μL)并在37°C下培养30分钟。
9.4. 添加TE(50μL)和乙醇蓝(0.5μL)并混合。添加pH 5.5(10μl)的醋酸钠并混合,然后添加100%乙醇(250μl)并再次混合,然后在-20°C下沉淀过夜。
通过在空间上分离PCR前和PCR后步骤,避免受到之前实验中PCR产物的污染。理想情况下,PCR产物分析和所有后续步骤应在单独的房间进行。
10.PCR扩增
10.1. 旋转并清洗样品(见7.1),然后将颗粒重新悬浮在水中(19μL)。
10.2. 准备PCR混合物并运行PCR程序:
94°C持续2分钟,
[94°C 15秒,65°C 30秒,68°C 30秒钟]x25–35个循环,
68°C持续3分钟,
永远保持4°C。
使用的引物序列用于solexa测序,其他系统可能需要调整引物。
10.3. 将PCR产物(8μL)与5x TBE加载缓冲液(2μL)混合,并加载到预制的6%TBE凝胶上。用Sybrgreen I染色凝胶,并用凝胶成像仪分析PCR产物;这样可以在对iCLIP库进行排序之前监控实验的成功。
PCR产物的凝胶图像应显示与步骤8.4中纯化的cDNA部分(高、中或低)相对应的大小范围。请注意,PCR引物P3Solexa和P5Solexa为cDNA的大小增加了76 nt。引物二聚体产物可在约140 nt处出现。
10.4. Rclip引物中的条形码允许在提交高通量solexa测序之前复用不同的样本。
10.5. 提交15μL的文库进行测序,并保存剩余的文库。
提示:控制实验应在PCR扩增后不产生产物,并且控制库的高通量测序应返回很少的独特序列。
11.连接子和引物序列
11.1. 预脱乙酰化3'连接子DNA(20μM DNA适配器的等分):L3/5rApp/AGATCGGAGCGGTTCAG/3ddC/
11.2. 不同条形码的Rclip逆转录酶引物(脱盐和未凝胶纯化):
Rclip1 X33NNAACCNNNAGATCGAGAGCGTCGTGGATCTGAACCGC
Rclip2 X33NNACAANNANNAGATCGAGAGCGTCGTGGATCTGAACCGC公司
Rclip3 X33NNATTGNNAGATCGAGAGAGCGTGATCGACCGC(连接3 X33N)
Rclip4 X33NAGGTNNNAGATCGGAAGAGCGTCGTGgatcTGAACCGC
Rclip5 X33NNCGCCNNNAGATCGAGAGCTGTGGATCTGAACCGC
Rclip6 X33NNCCGGNNAGATCGAGAGCTGTGGATCTGAACCGC
Rclip7 X33NNCTAANNNAGATCGAGAGCGTCGTGGATCGACCTACCGC(Rclip7X33NNCT)
Rclip8 X33NNCATTNNNAGATCGAGAGAGCGTGatcCTGAACCGC(Rclip8X33NNCatTNNNAGACTCGGAAGAGCGCGTGatccCTGACCGC)
Rclip9 X33NNGCCANNNAGATCGGAAGCGTGatcCTGACCC(Rclip9X33NNGC)
Rclip10 X33NNGACCNNNAGATCGAGAGCGTCGTGGATCGAACCGC(参考文献10)
Rclip11 X33NGGTTNNNAGATCGGAAGCGTCGTGgatcTGAACCGC
Rclip12 X33NNGTGGNNAGATCGAGAGCGTCGTGGACCTGACCGC(12号线夹)
Rclip13 X33NNTCCGNNNAGATCGAGAGCGTCGTGGATCGACCTGCGCGAGAGCGC
Rclip14 X33NNTGCCNNNAGATCGAGAGCTGTGGATCTGACCGC
Rclip15 X33NNTATTNNAGATCGAGAGAGCGTGATCGACCGC(连接15 X33N)
Rclip16 X33NNTTAANNNAGATCGAGAGCGTCGTGGATCTACCTGACCGC
11.3. X33=5’磷酸盐
11.4. 切割寡糖:GTTCAGGATCCACGACGCTCTTCaaaa
11.5. P5Solexa:AATGATACGGCGACCGAGATCTACCTCTTCCCTACACGACCTCTCTCCCGATCT公司
11.6条。P3Solexa:CAAGCAGACGGCATACGATCGTCCGGCATTCCTGCTACCTGGAACGCTTCCGATCT公司
有关iCLIP协议的更多信息,请参阅以下参考资料:
Konig等人J.Vis。2011年到期。“iCLIP-蛋白质-RNA相互作用与单个核苷酸分辨率的转录组宽映射。”
Huppertz等人。方法。2014.“iCLIP:核苷酸分辨率下的蛋白质-RNA相互作用。”