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这一阶段的蛋白质可视化有助于确定蛋白质是否均匀迁移。如果您打算将分离的蛋白质转移到膜上,请使用铜染色剂考马斯染色是不可逆的。仅使用考马斯染色在凝胶转移后检查转移的效率,或者如果您没有转移计划,只想观察SDS-PAGE分离的结果。
考马斯染色
一旦电源关闭,分离的蛋白质带将开始扩散(它们在水溶液中可自由溶解)。为了防止蛋白质的扩散,用40%的蒸馏水、10%的乙酸和50%的甲醇溶液处理凝胶,这会导致几乎所有的蛋白质沉淀(变得不溶)。
为了观察固定的蛋白质,将凝胶置于水/乙酸/甲醇的相同混合物中,但加入0.25重量%考马斯亮蓝R-250。在室温下在摇床上培养4小时至过夜。将凝胶(保存染料混合物;可以多次重复使用)转移到67.5%蒸馏水、7.5%乙酸和25%甲醇的混合物中,放在摇床上,用新鲜的冲洗混合物替换,直到去除多余的染料。
污渍不会与丙烯酰胺结合,会被洗掉(留下一个透明的凝胶)。然而,它仍然与凝胶中的蛋白质紧密结合,呈现出深蓝色。
铜染色
在蒸馏水中短暂冲洗新鲜电泳凝胶(最多30秒),然后转移到0.3 M CuCl的溶液中25–15分钟。在去离子水中短暂清洗凝胶,并在暗场背景下观察。蛋白质在半透明的蓝色背景中呈现出清晰的区域。凝胶可通过在0.1–0.25 M Tris/0.25 M EDTA pH 8.0中反复洗涤而完全去除污渍。按照转移设备制造商的说明,在继续转移之前,将凝胶移到转移缓冲盘中。
传输过程的详细说明可以在传输设备制造商的网站上找到,并且会因系统而异。不过,每种情况下的原理都是一样的。正如带电荷的蛋白质(由与之结合的SDS提供)可以在电场中通过凝胶传播一样,蛋白质也可以在电场中将其从凝胶转移到坚固的支撑物上,该支撑物是一种“吸附”凝胶中蛋白质的膜。早期的方法依赖于扩散;电场中的吸墨剂现在是标准的。
可以使用湿式或半干式系统进行转移。由于膜的干燥,湿传递不太容易失败,尤其推荐用于大型蛋白质。对于这两种转移,膜放在凝胶旁边。两者夹在吸收性材料之间,夹心夹在固体支架之间,以保持凝胶和膜之间的紧密接触。
在湿转印中,凝胶和膜夹在海绵和纸之间(海绵>纸>凝胶>膜>纸>海绵),并将它们紧紧夹在一起,以确保凝胶和膜之间不会形成气泡。夹层被淹没在施加电场的传输缓冲器中。带负电荷的蛋白质向带正电荷的电极移动,但被膜束缚,阻止它们继续运动。
湿传递的标准缓冲液与用作凝胶流动缓冲液的1x三甘氨酸缓冲液相同,但不含SDS,并添加甲醇至最终浓度20%。对于大于100kDa的蛋白质,建议以0.1%的最终浓度加入SDS。
在半干式转移中,将由纸>凝胶>膜>在转移缓冲液中润湿的纸组成的三明治直接放置在正极和负极(阴极和阳极分别)之间。至于湿传递,重要的是膜最靠近正极,凝胶最靠近负极。
转移缓冲液中Tris和甘氨酸的比例不一定与湿转移相同;查阅仪器制造商的协议。标准配方为48 mM Tris、39 mM甘氨酸、0.04%十二烷基硫酸钠、20%甲醇。
有两种类型的膜:硝化纤维素和PVDF(带正电的尼龙)。选择是个人的,两者都很好。PVDF膜需要仔细的预处理:将膜切割到合适的尺寸,然后将其浸泡在甲醇中1-2分钟。将膜在冰镇转移缓冲液中培养5分钟。如果在冰镇传递缓冲液中未能使膜平衡,则会导致转移时收缩和转移模式扭曲。
大蛋白和小蛋白的转移
SDS和甲醇在转移缓冲液中的平衡、蛋白质大小和凝胶百分比会影响转移效率。以下修改将鼓励有效转移:
大蛋白(>100 kD)
小蛋白质(<100 kD)
以下参考文献讨论了一种凝胶和缓冲系统,该系统可转移高达500 kD的蛋白质:
Bolt MW和Mahoney PA(1997年)。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳后不同大小蛋白质的高效印迹。 Ana Biochem公司,247, 185–92.
更多传送提示:
要检查转移是否成功,请在TBST中清洗膜。将原液稀释为1:100。该原液由2%的胭脂红S、30%的三氯乙酸和30%的磺基水杨酸制成。
在搅拌器上培养5分钟,然后在水中广泛清洗,直到水变清,蛋白质带清晰。通过在TBST或水中反复清洗,可以彻底去除膜的污染。使用PVDF膜时,用甲醇重新激活膜,然后在TBST中再次清洗。
TBS 10倍
对于1 L;24.23克盐酸Trizma80.06克氯化钠溶于800 mL蒸馏水中用盐酸将pH值调至7.6加满至1L
TBST(待定)
对于1 L;100毫升TBS 10x900 mL蒸馏水1毫升吐温20
吐温20非常粘稠,会粘在测量吸管的尖端。确保向Tris缓冲液中添加适量的清洁剂。10%的溶液比未稀释的吐温20更容易分配
阻断膜可防止一级和/或二级抗体与膜的非特异性背景结合(膜具有结合蛋白质和抗体的高能力)。
传统上使用两种封闭溶液:脱脂奶或BSA(科恩馏分V)。牛奶更便宜,但不推荐用于研究磷酸蛋白;牛奶中含有酪蛋白,酪蛋白是一种磷酸蛋白,由于磷酸特异性抗体检测牛奶中的酪蛋白,因此背景值较高。
由于未知原因,一些抗体在被BSA阻断的膜上发出更强的信号,而不是牛奶。如果有关于如何堵塞膜的具体说明,请查看数据表上的应用说明。
为了制备5%的牛奶或BSA溶液,用吐温20(TBST)缓冲液每100 mL TBS称量5 g。充分混合并过滤。如果不进行过滤,可能会发现微小的黑色颗粒会在发育过程中污染斑点。
在4°C下搅拌培养1小时。孵育后,在TBST中冲洗5秒。
孵化缓冲液
在TBST中按建议的稀释度稀释抗体。如果数据表中没有推荐的稀释度,则尝试一系列稀释度(1:100–1:3000),并根据结果优化稀释度。抗体过多会产生非特异性条带。
传统上,某些实验室在封闭缓冲液中培养抗体,而其他实验室在TBST中培养抗体时不使用封闭剂。结果因抗体而异,您可能会发现在抗体缓冲液中使用非阻断剂或使用与阻断缓冲液相同的试剂会有所不同。
如果高背景不是问题,那么一些抗体如果在低浓度(0.5–0.25%)牛奶或BSA的缓冲液中稀释,或者根本没有,就会产生更强的信号。
孵化时间
时间可以在几个小时到一夜之间变化(很少超过18小时),并且取决于抗体对蛋白质的结合亲和力和蛋白质的丰度。我们建议使用更稀释的抗体并延长培养时间,以确保特异性结合。
培养温度
最好是冷的。如果在封闭缓冲液中培养过夜,必须在4°C下培养,否则会发生污染,从而破坏蛋白质(尤其是磷酸基)。
建议搅拌抗体,以使膜充分均匀覆盖,并防止不均匀结合。
在TBST中搅拌清洗膜数次,每次清洗5分钟或更长时间,以去除残留的一级抗体。
培养缓冲液和稀释液
在TBST中按建议的稀释度稀释抗体。如果数据表没有推荐的稀释度,请尝试一系列稀释度(1:1000–1:20000),并根据结果优化稀释度。抗体过多会产生非特异性条带。你可以在阻断缓冲液中培养二级抗体,但背景的减少可能会以较弱的特异信号为代价,可能是因为阻断蛋白阻碍抗体与目标蛋白的结合。
培养时间和温度
在室温下搅拌1-2小时。
哪个共轭词?
我们推荐辣根过氧化物酶(HRP)结合二级抗体。碱性磷酸酶(ALP)结合的二级抗体不太敏感,不推荐使用。
检测工具包
HRP结合抗体增强化学发光(ECL)试剂盒传统上用作底物。我们提供具有不同检测限的HRP基板。
X射线胶片
自动x射线胶片显影剂应用广泛,使用方便。请记住,过度曝光的薄膜不适合进行分析,因为无法测定蛋白质的相对含量。过度曝光的胶片显示出完全没有对比度的黑色条带和/或许多非特异性条带。
数字图像
新一代的胶片开发人员是在一个外壳内装有摄像头的单元,不需要暗室。摄像头检测膜发出的化学发光,将信号转换为数字图像,以便使用检测机提供的软件进行快速分析。
一系列机器现已上市。在下一代的前沿是不使用HRP结合抗体的系统(即化学发光)。例如,STORM分析仪检测荧光铬结合二级抗体的荧光。奥德赛红外成像系统检测红外荧光。