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剥离是一个术语,用于描述从western印迹膜中去除一级和二级抗体。当一个人想要在同一个印迹上研究多个蛋白质时,剥离是有用的,例如一个感兴趣的蛋白质和一个负荷控制。当探测多个靶点时,剥离和重新保护单个膜而不是运行和吸干多个凝胶,具有节省样品、材料和时间的优点。
不建议在剥离前后对探测目标进行定量比较,因为该程序会从膜上去除一些样品蛋白质。出于同样的原因,不应通过探测剥离的膜来证明蛋白质的缺失。
强烈建议使用PVDF膜,以尽量减少样品蛋白质的损失。还要注意,比色/显色检测试剂会在膜上留下永久可见的污点,这可能会干扰后续对类似分子量目标的检测。建议使用化学发光试剂,如ECL,因为它们不会留下污渍,并且比比色试剂更敏感。
以下两种方案在治疗的严厉性上有所不同。根据经验,如果仍有来自抗体的信号,则先尝试较温和的一种,然后再尝试较严厉的一种。尽管每一轮剥离后,潜在信号可能会减弱,背景可能会升高,但可以重复这些步骤,用几个抗体进行探测。一些研究人员报告,在剥离十次或更多次后,成功地将膜染色。
可通过将膜与化学发光检测试剂孵育来检查剥离效率。如果判断剥离符合要求,则用缓冲液冲洗膜几次,然后在进行抗体孵育之前进行封闭。
缓冲液,1 L
15克甘氨酸1克十二烷基硫酸钠10 mL吐温20溶于800 mL蒸馏水中将pH值调节至2.2用蒸馏水将体积增加至1 L
程序
在通风橱下准备缓冲膜和条状膜。
缓冲液,0.1 L
20 mL十二烷基硫酸钠10%12.5 mL Tris HCl,pH 6.8,0.5 M67.5 mL蒸馏水在通风柜下添加0.8 mLß-巯基乙醇
程序