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运行适当的控件可以帮助您准确地将正确的阳性结果与潜在的错误结果分开。如果您需要对协议进行故障排除,积极和消极控制也会很有用。这里我们解释了运行ELISA时应使用的各种类型的对照样品。
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使用已知含有所检测蛋白质的内源性可溶性样品或已知含有所用抗体免疫原序列的纯化蛋白质或肽。阳性对照的阳性结果,即使样品为阴性,也表明程序已优化且有效。它将验证任何负面结果是否有效。
我们建议检查抗体数据表,这通常会提供建议的阳性对照。如果不建议进行控制,我们建议采取以下措施:
这是一个你知道不表达你检测到的蛋白质的样本。这是为了检查非特异性结合和假阳性结果。为了验证结果,您使用的每个板都应该包含一个阴性对照样品。
这是一个含有已知目标蛋白浓度的样品,可从中获得标准曲线。例如,下面是我们的小鼠IL6 ELISA试剂盒浓度范围为15.6至500µg/mL。较差的标准曲线意味着抗体无法正确结合或无法捕获蛋白质标准。R2趋势线的值应大于0.99。
在ELISA中检测血清样本时,应像往常一样在正常稀释液缓冲液中加入标准液。但我们建议还包括一个标准稀释血清,从你正在测试的物种。然后可以比较两者,以确保血清中其他蛋白质对标准曲线没有影响。这就是所谓的峰值控制,告诉你目标蛋白在加入基质后是可以恢复的。可接受的结果是80-120%。
如果您正在测试重组蛋白样品,我们建议包括内源性阳性对照。这应该是你实验的重要组成部分。
重组蛋白的抗体检测存在固有的困难,需要考虑。重组蛋白的折叠可能不同于内源性天然形式,并可能阻止抗体进入表位。标记蛋白的情况尤其如此。始终确保标签位于重组蛋白的N或C末端。
最重要的是,始终确保重组蛋白包含您使用的抗体的免疫原序列。内源性阳性对照对于验证结果以及指示试剂(如抗体)和程序的工作情况非常重要。
ELISA指南
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