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通过本实用的故障排除指南,为您的ELISA实验探索实用解决方案。
在执行定量ELISA之前,您需要标准曲线表现良好。这确保您可以可靠地测定样品的浓度。
注释:如果使用我们的ELISA试剂盒,测量值可能与数据表或方案手册上显示的示例有很大差异。这通常是可以预期的,只要曲线拟合良好,如回归系数(R2). 只要R20.9,则可以放心使用标准曲线。
设置标准曲线时遇到的常见问题包括:
标准解决方案的问题
可能的原因
解决方案
标准溶液未正确稀释。
确认稀释正确。
标准品重新配制不当。
打开前,快速旋转小瓶;重构后检查未溶解的物质。
标准可能会降级。
按照建议储存和处理标准。
移液错误。
使用校准过的移液管和适当的移液技术。
曲线拟合模型无法使用数据
解决
您可能需要不同的曲线拟合模型。
首先,您应该始终遵循制造商的说明。然而,如果曲线fit似乎不起作用,请尝试使用不同的模型.
返回页首
这个变异系数(CV)指示两次运行之间信号的变化程度。它是标准偏差与平均值的比值,以百分比表示。
你的目标应该是简历<20%。
井内气泡
在读取铭牌之前,确保没有气泡。你可以试着用吸管轻轻地上下吸出气泡。
通过练习正确的移液技术,可以避免气泡形成的风险。
洗井不均匀/彻底
检查洗板机的所有端口是否畅通。按照建议清洗井。
自动清洗系统可以帮助改善对洗涤步骤的控制。
移液不一致。
使用校准过的移液管和适当的移液技术
轻轻上下移液,确保所有试剂完全混合。
样品制备或储存不一致。
确保按照建议一致地储存和制备所有样品。
板材处理不当造成的边缘效应。
当不同的微孔暴露于温度和湿度的微小变化时,ELISA中会出现边缘效应。外部(或“边缘”)井通常最先对环境的任何变化做出响应,导致它们在内部井之前变干或蒸发。
在某些情况下,边缘效果清晰可见。试着从侧面看盘子——如果外面的缓冲液液位较低,则部分缓冲液已经干燥。为了防止井变干,用密封膜或胶带覆盖所有井。
您还应该确保培养皿和所有试剂都在左侧,以便在培养前平衡到室温。不要直接使用冰箱里的盘子;内井需要更长的时间才能达到室温。
返回页首
靶点或抗体对
板。
尝试通过井的预处理增加对板的吸附。你也可以试试具有“增强约束力”的盘子。
表位识别受阻于
吸附到板上(直接或间接
ELISA)。
为了通过直接或间接ELISA增强对肽的检测,在将肽涂覆到微量滴定板上之前,将肽与大载体蛋白偶联。
感兴趣的蛋白质不存在
运行阳性对照查阅科学文献,看看你的样品中是否含有这种蛋白质。
没有足够的抗体与
蛋白质
添加较高浓度的一级抗体将样本与抗体孵育更长时间(如过夜)。
检测不够灵敏
考虑切换到更灵敏的检测系统,例如从比色检测切换到荧光检测,或从直接检测切换到间接检测。信号放大,如生物素化,可用于进一步增强信号。
用于检测的过滤器设置不正确。
确保平板读取器/仪器设置为读取正确的吸光波长或荧光检测的激发/发射波长。
色度学发展缓慢
反应。
一些比色反应发展缓慢。如果你读得太早,反应可能不完整,因此你可能会错过一些信号。
尝试使用“动态模式”读取信号,以在较长时间内测量信号。
一级抗体和二级抗体不相容。
确保您使用的是针对一级抗体种类的二级抗体。确保一级和二级的同型是相容的。
缓冲区可能与检测方法不兼容。
一些缓冲液含有可能干扰检测的试剂。例如,叠氮化钠是HRP的抑制剂,因此不适合与HRP结合抗体一起使用。检查缓冲液中没有任何不相容的试剂,必要时更换缓冲液。
样本类型可能不兼容。
检查您使用的ELISA试剂盒是否与您的样本类型(例如细胞裂解物)兼容。
混合不同套件中的组件。
每个试剂盒都设计用于特定条件下的特定应用,因此混合成分可能会导致无法按预期进行分析。通常应避免混合成分。
抗体的过度使用降低了其效力。
确保每次实验都使用新鲜的一级和二级抗体;每次使用后抗体的有效浓度降低。
抗体、试剂或扩增试剂盒可能因储存和处理不当而失去活性。
查看数据表上产品的存储说明。避免过度冷冻/解冻。在黑暗中储存和处理荧光团和荧光团偶联抗体,并通过用箔纸包裹小瓶来最大限度地减少光暴露。运行阳性对照。
培养温度可能过低
确保在正确的温度下执行所有步骤。查看制造商指南以获取具体建议。
所有试剂,包括平板,在继续操作之前,通常应保持平衡至室温。
台阶之间清洗过多
步骤之间有必要使用缓冲液清洗,但有时过度清洗可能会去除检测试剂。减少清洗步骤的持续时间和/或次数。
如果使用吸管,请确保用温和的压力清洗。如果可用,可以将自动清洗系统设置为施加更温和的压力。
清洗或培养缓冲液是
被细菌污染
使用新鲜、无菌的缓冲液(如我们的无菌缓冲液美国公共广播电视公司).
二级抗体可能结合
非特定地
在没有任何初级抗体的情况下进行对照。确保使用不同物种的二级抗体作为样本。尝试一种二级抗体,它已经被预先吸附在样品的lg中。确保已对井进行预处理,以防止非特定附着。
初级抗体浓度可能是
太高了。
将抗体进一步稀释至最佳浓度。
阻止非特异性结合可能是不足的
增加阻塞潜伏期,并考虑更换阻塞剂。我们推荐5-10%的同种正常血清作为检测抗体。
底物过多(如果使用酶-
结合抗体)
稀释基质并缩短基质培养时间。
信号放大可能过高(如果使用信号放大技术)
减少信号放大量(例如,如果使用生物素化,将较少的生物素偶联到二级抗体)。
台阶之间清洗不足
残留在步骤之间的未结合抗体会产生假阳性信号。在所有步骤之间的缓冲区内广泛清洗井。增加洗涤时间。
添加基底后,井内形成沉淀。
检查井内是否有明显的降水迹象。降低基质浓度
添加停止溶液后等待时间过长,无法读取板。
添加停止溶液后,立即读取铭牌。
如果可能,从停止溶液添加到井中的那一刻起,在不同的时间点进行测量。
板可能被污染或弄脏。
按照制造商的说明清洁板。
如果您仍然遇到问题,请考虑使用新的盘子。
ELISA指南
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