1.简介

众所周知，红外光谱能够从分子振动光谱中识别分子成分。这种所谓的分子指纹是在红外光谱中被称为中红外区的部分发现的，几十年来，研究实验室和工业界一直在研究这种指纹。在生物样品中，主要成分包括脂质，蛋白质，核酸类和碳水化合物，所有这些都在中红外区具有独特的光谱特征。脂质光谱中的主要吸收特征出现在2800-3000区域 厘米⁻¹和被指定为CH的反对称和对称拉伸振动_三（2956和2874 厘米⁻¹)和CH₂（2922和2852 厘米⁻¹)酰基链的基团。此外，1736年的强力乐队 厘米⁻¹由脂质中的酯C=O基团产生。蛋白质谱有两个主要特征，酰胺I（1600-1700 厘米⁻¹)和酰胺II（1500–1560 厘米⁻¹)条带，由肽骨架的特定拉伸和弯曲振动产生。酰胺I带的频率对蛋白质二级结构特别敏感。核酸光谱也显示出嘌呤（1717）的C=O伸缩振动 厘米⁻¹)和嘧啶（1666 厘米⁻¹)基础。此外，1000至1500之间的地区 厘米⁻¹包含来自反对称（1224 厘米⁻¹)和对称（1087 厘米⁻¹)采购订单₂^-拉伸振动（米勒等。, 2000)。

在过去的20年里，为了在空间上分辨不均匀样品和小颗粒，人们用红外显微镜对生物样品进行了检测。当面积相对较大时，这种红外显微光谱技术提供了良好的光谱质量(即几十微米），在需要衍射极限的空间分辨率的应用中，传统热（球）源的吞吐量不足（Carr，2001). 这将生物标本的研究局限于组织水平。此外，球形光源也不足以进行远红外光谱实验，以检测生物动力学和金属-配体振动模式（谢等。, 1999). 全球辐射源达到峰值通量(即单位时间产生的光子数），当波长从1到1000变化时，输出下降四个数量级 µm（威廉姆斯，1990年)。

同步辐射红外光源是克服这些特殊困难的理想选择。同步辐射红外光的主要优点是亮度（定义为光子通量或每个源面积和立体角发射的功率），这是同步加速器源的100–1000倍（Duncan&Williams，1983). 这个亮度优点不是因为同步加速器产生更多的功率，而是因为有效光源尺寸较小，并且光线发射角度范围较窄。高亮度对于任何具有有限“吞吐量”的测量来说都是可取的，这意味着样品面积小、需要窄光束或两者兼而有之。微光谱仪也许是低吞吐量测量的最著名的例子，而同步辐射源非常适合这种技术。

激光红外光源也很亮，可以提供高光子通量在一个小光圈上。然而，与激光器不同的是，同步辐射源本质上是宽带的，因此可以很容易地进行光谱和曲线场分析。此外，由于光子通量当波长从1到1000变化时，同步辐射源的衰减仅为约一半 μm，使用新光源证明在远红外区域非常有效。虽然同步辐射作为红外光谱的光源是最近才出现的，但它已迅速成为新存储技术的一个重要应用。过去十年来，利用同步辐射源的红外辐射进行的研究稳步增长（Williams，1990）; 梅伦德斯，1998年). 如今，全球约40个运行中的储存环同步辐射源中，有一半以上至少有一条正在运行或正在建设中的红外光束线（例如，参见，https://www-ssrl.slac.stanford.edu/sr_sources.html,https://www-elsa.physik.uni-bonn.de/accelerator_list.html). 全世界都有红外同步辐射设施，为科学界提供照明。国家同步加速器光源（NSLS，布鲁克海文国家实验室）目前运行六条红外光束线，使其成为红外研究的首要同步加速器设施（卡尔等。, 1998). 在日本冈崎UVSOR也可以找到主动红外光束线；ALS，伯克利和SRC，斯托顿（美国）。在欧洲，SRS的IR活动仍在继续，Daresbury（英国）；奥赛卢雷（法国）；MAXLAB，隆德（瑞典）；在Daφne，Frascati（意大利）。其他正在规划或考虑IR项目的设施包括Diamond、卢瑟福实验室（英国）；ESRF，格勒诺布尔和索莱尔，巴黎（法国）；BESSY公司 二、 柏林、ANKA、卡尔斯鲁厄和德尔塔、多特蒙德（德国）；Duke-FEL，达勒姆（美国）；CLS，萨斯卡通（加拿大）；LNLS，坎皮纳斯，（巴西）；CAMD，巴吞鲁日，（美国）；SURF-3，盖瑟斯堡（美国）；NSRL，合肥（中国）；SPring-8，Nishi-Harima（日本）；和SRRC，新竹（台湾）。虽然红外显微术是与同步辐射红外研究相关的一种非常常见的应用，但其他活跃的项目，如真空和高压表面科学、电化学和生物学，正在迅速发展。

阿尔伯特·爱因斯坦同步加速器生物科学中心的U2B光束线位于国家同步加速器光源的VUV-IR环上。U2抽吸口室于1996年12月安装在VUV环中。分光镜盒于1997年10月安装，用于两个相等的终端站（U2A和U2B），其余光束线于1998年3月安装。经过调整后，它于1998年5月15日达到全光束。随后建造了U2A和U2B终端站，每个终端站都于1998年11月亮灯。经过一年的调试，U2B光束线已全面运行，自2000年春季开始接受外部用户。虽然主要致力于生物科学测量，但其用户也在环境科学以及应用物理和化学领域进行测量。在本出版物中，我们报告了其目前的能力、可用仪器，并给出了U2B当前研究的几个示例，以证明该束线是一种宝贵的资源，并准备为国际科学界服务。

2.光束线描述、仪器和功能

U2是一个同步加速器IR端口，可传送～80 mrad水平增加40 mrad垂直。同步加速器光束由椭球镜和平面镜组合控制和聚焦，以提供源的1:1图像。光束通过一系列阀门和遮罩（见图1)然后通过楔形菱形窗进入镜盒，镜盒被分成两条等长的线（U2A和U2B）。朝向U2B光束线的光束继续通过粗糙的真空泵管，然后通过窗口（KBr或聚乙烯，取决于所需的频率范围）进入下面列出的氮气吹扫仪器。总角度验收为45 高×40 V（V） mrad先生。

图1 U2B光束线布局示意图。P1、P2：高真空泵；P3：粗泵；V1、V2等：阀门；G1、G2等：真空计；PS：光子快门；PM：光子掩模；D1、D2：外部探测器。

光束线配备了一个干式氮吹傅里叶变换红外（FTIR）光谱仪（Magna 860，Thermo Nicolet Instruments，Madison，WI，USA）、一个Nicolet NicPlan红外显微镜和一个定制的外部冷冻室。光谱仪配备了迈克尔逊干涉仪，该干涉仪具有快速扫描、步进扫描以及接受外部光束和利用外部探测器的能力。为了在其内部室中进行测量，可使用窄带碲化汞镉（MCT/a）和带聚乙烯窗口的氘化硫酸三甘氨酸（DTGS）探测器，范围从5000到100 厘米⁻¹.还可提供许多液体样品的传输单元（美国康涅狄格州谢尔顿市Thermo Spectra-Tech公司Sealed Precision Pathlength Cell）。样品温度可以通过使用再循环槽的加热/冷却试管架（HC-32型可拆卸试管套件，Thermo Spectra-Tech）进行调节。

双共焦NicPlan红外显微镜配备了全方位物镜，如10×和20×可见物镜、用于透射和反射红外测量的32×红外物镜（热谱技术）和衰减全反射（ATR）ZnSe物镜（热谱技术）用于高吸收和/或厚样品的反射测量。该显微镜具有衍射极限的空间分辨率。它配备了一个电脑控制的舞台，将样品置于物镜下。全自动红外显微实验可以使用亚特兰大μ秒软件（Thermo Nicolet），可以查看样品的视觉图像及其三维红外表示（红外图）。对于传输模式下的测量，全范围的IR-透明窗口（BaF₂，氟化钙₂、ZnSe等.）作为安装样品的支架，并提供了金刚石压砧电池（Thermo Spectra-Tech）。红外反射显微镜载片（Low-e显微镜载片，Kevley Technologies，Chesterland，OH，USA）和定制镀金显微镜载片可用于安装样品，以便在反射模式下进行测量。

为了扩大显微镜收集的振动光谱范围，在光路中引入了一个平面拾取镜，以允许使用外部探测器。镜子将光线导向7000–650中运行的内部窄带MCT/A探测器 厘米⁻¹范围或外部探测器。通过使用外部探测器，以牺牲信噪比为代价，扩大了通过显微镜获得的光谱的低频极限。显微镜后面放置了三个探测器：一个液氮冷却宽带MCT/B探测器（美国新泽西州新不伦瑞克市贝洛夫科技公司），在5000-450 厘米⁻¹传感器尺寸为0.25×0.25的光谱范围 mm，一种液氦冷却双探测器系统（美国亚利桑那州图森市红外实验室），将硅测辐射热计与覆盖远光谱范围（650–10）的楔形白色聚乙烯窗口结合在一起 厘米⁻¹)和一个Si:B光电探测器，带有一个KRS-5窗口，用于在中红外（3500–350）中进行测量 厘米⁻¹). MCT/A的信噪比最高（取决于频率，比MCT/B高3-8倍，而Si:B光电探测器的信噪比约为600 厘米⁻¹但在450左右提高了两倍 厘米⁻¹). 使用测辐射热计，频率下限可以扩展到约30 厘米⁻¹。显微镜后面放置了一组电动和手动平移台和准直光学元件，以精确对准外部探测器。从光谱仪到显微镜再到探测器的整个光路用干燥的氮气连续吹扫，以确保水蒸气吸收的显著减少，否则会导致部分中红外和远红外不可用。

U2B光束线还配备了一个定制的外部腔室，可以进行吹扫或抽空。它的6〃焦距聚焦镜照亮了约2个样品 直径为mm，并将部分吸收的光从样品引向检测器。该室配备了一个冷指（Janis ST-100），可将样品温度冷却至4.2 K（液-氦温度）。粉末、液体或晶体样品最多7个 直径为mm的可放置在支架中。结合温度控制器和计算机控制（Lake Shore，型号330），通过传感器尺寸为1×1的宽范围MCT/B探测器，可以在中红外和远红外中自动采集作为温度函数的连续光谱集 mm和上述液氦冷却双探测器系统。

3.微秒至毫秒红外光谱

这个亮度同步辐射源的光谱在较小的采样面积和相对较短的数据采集时间内具有良好的信噪比。利用时间分辨FTIR显微镜研究亚微秒级蛋白质折叠可以利用这一优势，其中空间和光谱分辨率以及数据收集时间是重要的实验限制。

许多光学技术（CD、UV/荧光、拉曼）与超快混合器相结合，已用于研究快速蛋白质折叠动力学（Eaton等。, 2000; 布罗克韦尔等。, 2000). 然而，FTIR显微镜与我们的快速搅拌连续流动装置相结合，也是检测蛋白质折叠早期阶段的有力技术。傅里叶变换红外光谱已被广泛用于研究蛋白质结构；酰胺I带剖面（1600–1700 厘米⁻¹)被认为是监测蛋白质二级结构变化的最灵敏探针（Haris&Chapman，1995). 通过检测细胞色素的重折叠动力学，我们开发了湍流快速混合FTIR显微技术-c（c）在各种化学条件下（马林科维奇等。, 2000; 布隆伯格等。, 2002). 应该注意的是，扩散混合器最近已与FTIR显微镜一起用于检测蛋白质折叠；它们的性能将通过使用同步辐射源而得到增强（考夫曼等。2001年)。

我们快速行驶的初始设计续流池（马林科维奇等。, 2000)已进行修改和优化，以允许在0.23至5.0范围内进行光谱采集 反应的ms时间窗口（图2). 流动池由ZnSe窗口包组成，其中包含一个观察通道（52×200 µm）连接到混合槽（100×100 微米）通过薄密封（120 µm厚）。混合溶液从密封件（254）的孔中溢出 µm直径）进入观测通道；这个停滞时间对于湍流混合和溶液通过密封件的情况加利福尼亚州. 200 微秒。使用FTIR显微镜，球状或同步加速器红外源通过100聚焦在凹槽的不同位置 µm或10 上孔径分别为µm。每个光谱的时间尺度由观测通道中的溶液速度、焦点和密封之间的距离以及停滞时间并密封在一起。实验的时间刻度误差由上孔径的大小决定。高信噪比的第一个观察点位于300 距密封件µm。因此，在我们的最高合理流量（3.0 毫升 最小值⁻¹), 230 µs是当前流动池可访问的最低时间尺度。可以使用128或64次扫描在4 厘米⁻¹分辨率，约10 0.5毫升或1毫升 米M（M）需要蛋白质溶液来获得具有多个数据点的信息动力学数据。

图2 红外光谱法时间分辨测量用快中子流动池示意图。变性蛋白质和复性剂分别进入混合槽（100 µm宽，100 µm深），所得溶液流入观察通道（200 µm宽，52 µm深）通过254 120中的µm宽孔 µm厚密封。

时间分辨FTIR显微镜已用于评估酸变性细胞色素的重折叠动力学-c（c）分别由暴露于高盐和pH跳跃引起的熔融球状物和自然状态（Bromberg等。, 2002). 动力学分析包括测量分配给溶剂暴露线圈的酰胺I组分带的时间依赖性（1669 厘米⁻¹)，已掩埋α-螺旋（1655 厘米⁻¹)，无序结构（1645 厘米⁻¹)、和溶剂化α-螺旋（1633 厘米⁻¹). 螺旋形成的速率与使用类似湍流混合装置和化学条件的其他光学技术获得的速率相当，说明快速时间分辨FTIR显微镜作为检测蛋白质重折叠亚微秒事件的辅助工具的实用性。然而，与其他光学技术不同，FTIR也适用于检测更复杂的生物混合物。因此，快速测量时间分辨FTIR显微镜可能有助于识别与生物学相关的各种双分子反应的动力学和机制(即酶-底物结合动力学、蛋白质-脂质相互作用、蛋白质-核酸相互作用等。)假设反应的动力学速率常数在5000和200之间 秒⁻¹此外，如果窗口封装由石英构成，则细胞设计可能适合与其他光谱仪（例如同步加速器CD）一起使用，以研究蛋白质的构象变化，碳水化合物和核酸。

4.细胞和组织的红外成像

虽然传统的红外显微光谱仪已被证明对解析生物样品中的化学成分非常有价值，但使用传统红外源的现有仪器在孔径将红外限制在20–30范围内时会遇到信噪比限制 直径为µm。这限制了对生物标本的分析仅限于组织层面。单个生物细胞通常为5-30个 直径为µm，使得它们太小，无法用传统的红外光源进行探测。高亮度同步加速器源的发射允许以可接受的信噪比探测较小的区域（Reffner等。, 1995; 卡尔等。, 1995). 实际上，可以使用小于光波长的孔径设置，但在这种情况下，衍射控制可用的空间分辨率（Carr&Williams，1997). 因此，对于典型的生物样品，初级脂质（C-H拉伸）、蛋白质（酰胺I）和核酸（P-O拉伸）吸收特征的衍射限制空间分辨率约为3、6和12 μm。因此，同步辐射源允许在单个细胞内进行化学成像，从而可以检测亚细胞水平的化学变化。尽管同步辐射源很明亮，但总功率为10×10 µm小于5 mW（马丁等。, 2001)在另一个NSLS束线（Jamin等。, 1998一,b). 在以下章节中，我们将介绍U2B最近进行的两个实验示例，以证明同步辐射FTIR显微光谱学在研究微观生物系统方面具有优势。

4.1. 动物癫痫和神经变性的红外显微镜研究

慢性颞叶癫痫患者的海马组织显示了一种称为内侧颞叶硬化症（Sloviter等。, 1996; 斯佩克，1994年). 这种疾病的主要特征包括海马终叶和Sommer区锥体神经元的选择性丢失，即CA3和CA1区域。相反，锥体细胞位于两个区域之间的过渡区（CA2区），以及颗粒细胞层、副室和纤维正在通过保持完整（斯佩克，1994; 施佩克等。, 1994). 海康酸通常用于诱导动物癫痫发作。24岁时神经缺失明显 h、 最大值为48 海人酸癫痫持续状态发作后h。在细胞中观察到与发育过程中死亡或毒性损伤后死亡相关的多种形态变化。二元分类方案表明，生理上适当的死亡是由于凋亡，病理机制涉及坏死（Charriaut-Marlangue等。, 1996). 坏死，或意外或病理性细胞死亡，其特征是细胞膜因肿胀而破裂细胞器，使细胞质内容物释放到细胞外空间。相反，细胞凋亡或生理性细胞死亡的特征是核浓缩和细胞膜收缩。据报道，细胞凋亡在多种病理状态后增加，如神经退行性疾病（Charriaut-Marlangue等。, 1996)，肾上腺切除术（斯洛维特等。, 1996)和癫痫发作（Piekut等。, 1997)。

我们使用健康和患病神经组织的可见光和红外图像来观察CA3和CA1区锥体神经元的变化。样品制备如下。将一只成年大鼠暴露于严重癫痫持续状态并通过经心灌注处死48 发作后h。正常大鼠进行了假注射。将大脑固定在相同的灌流液中过夜，并置于30%蔗糖溶液中。当大脑沉没时，它迅速被甲基丁烷（233 K） 并在低温恒温器中切开背部海马（255 K） 到12 µm厚截面。组织被安装在BaF上₂并放置在红外显微镜下。采用64次扫描采集CA1、CA2和CA3锥体细胞及其周围组织的红外图谱，共4次 厘米⁻¹分辨率。孔径为10 µm，大致相当于锥体细胞的大小（见图3)舞台在10分钟内移动 µm增量。检测蛋白质、脂质、二硫化物、酮和磷酸盐的中红外区，以评估组织样品中的生化差异。

图3 大脑组织的光学（顶部）和假彩色红外图像(一)正常大鼠和(b)癫痫发作严重的老鼠。组织被安装在BaF上2窗户。孔径为10 微米×10 µm（见正常大鼠组织光学图像中心的绿色方框）。对于红外图中的每个数据点，使用64个共同添加和Happ-Genzel切趾在4 厘米−1分辨率。通过没有样品的斑点收集背景光谱，作为吸光度参考。该图谱是使用1654和2922条带的酰胺I与脂类峰高之比生成的 厘米−1，并且颜色表示该比率的强度。

我们发现酰胺I带与脂质带（1654和2922 厘米⁻¹）提供了疾病的指示。如图3所示，条带的IR图像紧跟光学图像，表明在正常组织中的CA3细胞中发现了最高的酰胺与脂质峰比率。相反，患病动物组织样本的红外图像显示，不仅细胞内的酰胺I与脂类的比率很高，而且在远离细胞壁几十微米处扩散。看来，患病的神经细胞失去了完整性，将其生物材料扩散到周围组织。这似乎表明海马组织中诱导了坏死。然而，为了清楚地证明诱发性癫痫大鼠海马组织中发生的过程，还计划进一步研究远红外区（低于650）的磷酸和核酸特征 厘米⁻¹)凋亡导致的损伤是已知的。

4.2。骨质疏松症的骨化学分析

骨质疏松症以骨密度降低、骨结构改变和骨折易感性增加为特征，是困扰数百万女性的常见且代价高昂的疾病（Rodan&Martin，2000年). 虽然骨密度在骨质疏松症中的作用已经得到了很好的证实，但随着疾病的进展，对骨化学的变化知之甚少。骨的几种化学成分的改变，包括碳酸盐、磷酸盐和胶原蛋白，可能会影响骨强度。此外，在异种骨组织的研究中，骨不同部位的化学变化，即皮质的对骨小梁在决定骨的整体力学性能方面可能很重要。

先前已经描述了同步辐射红外显微光谱仪在检测骨质疏松猴子模型中的骨化学变化中的应用（Miller等。, 1999). 通过研究酰胺I（1700-1600）的红外光谱峰，监测骨质疏松骨的微观基质和矿物化学 厘米⁻¹)，碳酸盐(ν₂一氧化碳_三²⁻, 825–905 厘米⁻¹)和磷酸盐(ν₄警察₄³⁻, 500–650 厘米⁻¹). 已经证明，磷酸盐（或碳酸盐）和酰胺I带的积分面积之比代表了骨中矿物质相对于基质的数量（Paschalis等。, 1996; 卡马乔等。, 1999). 三个区域的曲线拟合产生了关于矿物和基质成分组成的信息，这些成分可能在疾病过程中发生改变（Miller等。1999年; 帕沙利斯等。, 1996; 卡马乔等。, 1999; 普列什科等。, 1991). 为了进一步分析这些变化，我们使用两种光谱数据收集方法评估了整体和局部骨骼质量：（i）绘制广泛的随机选择的骨骼区域以获得大量光谱，以及（ii）使用荧光色素标记的特定年龄段的个人点对点（Miller）等。, 1999)（图4). 在这两种情况下，同步加速器光源对于在衍射极限（3–20）附近的空间分辨率下进行数据采集是必要的 µm）（米勒等。, 2001). 我们研究了动物胫骨近端三个不同的解剖区域：皮质骨、软骨下骨和小梁骨。将一种骨密度增强药物癸酸南卓龙（nandrolone decanoate）应用于一组去卵巢猴子，与未经治疗的受试者进行比较，以证明该药物在疾病进展过程中对骨化学的影响。

图4 (一)一只卵巢切除动物胫骨近端软骨下区域的100×光图像。网格内的方块表示数据收集区域受到20的限制 微米×20 映射期间的µm孔径。白色正方形对应于图中所示荧光标签处的数据收集(b). 在这种情况下，孔径大小被限制为20 微米×20 微米。对于每个数据点，使用64个联合添加和Happ-Genzel切趾在4 厘米−1分辨率。收集通过空气的背景光谱（无样品）作为吸光度参考。(b)同一场的荧光图像。钙化蛋白（绿色）和阿利嗪复合物（红色）分别表示卵巢切除术后一年和两年骨形成。

59只成年雌性食蟹猴被分组饲养，并以相同的方式喂食。试验的细节已经在前面描述过了（杰罗姆等。, 1997). 简单地说，受试者被随机分为四个治疗组，每组24人 月研究：（1）假手术（Sham）(n个= 15); （2） 卵巢切除，用安慰剂治疗两年（OVX）(n个= 15); （3） ovx+癸酸南卓龙2年（NAN）(n个= 15); （4） ovx+癸酸南卓龙在ovx后一年开始（dNAN）(n个= 14). 给治疗组（NAN和dNAN）25 每三周肌注癸酸南卓龙mg，非治疗组（SHAM和OVX）每三周肌肉注射无菌溶媒。在卵巢切除（或假手术）时、手术后一年和尸检前两周，所有动物均按1-7-1-7的时间表静脉注射荧光色素标签（分别为四环素HCl、钙黄绿素和茜素复合物）（Jerome等。, 1997). 研究结束时，从每只动物身上取下一块胫骨。每个胫骨近端的中冠状切片嵌入甲基丙烯酸甲酯/邻苯二甲酸二丁酯中。这些石块的切片厚度为5 使用雪橇切片机对5只SHAM、7只OVX、6只NAN和6只dNAN动物的µm切片和组织切片进行空气干燥，并将其安装在IR样品室中。

骨切片固定在一个压缩室（Thermo Spectra-Tech）中，中心部分暴露在光束路径中。为了研究ν₄警察₄³⁻频带（500–650 厘米⁻¹)，我们使用了外部MCT/B探测器（贝洛夫技术），其工作范围为5000至450 厘米⁻¹.为了将水蒸气吸收率降至最低，从光谱仪开始到外部探测器结束的光束路径被氮气密封并持续吹扫。在数据采集的映射模式中，红外光谱被采集到x个–年坐标使用Atl公司μ秒控制电动舞台的软件（Thermo Nicolet）。在每次数据采集之前，将摄像机安装在显微镜上以捕捉可见光图像。在物镜之前的光路上放置一个可调节的光圈，以将每个数据点的红外照明面积限制在20×20 用于绘图的µm和10×10 µm用于定点拍摄。光圈的大小是使用其焦点处的可见光图像进行校准的。对于每只动物，分别从随机选择的皮质、软骨下和小梁骨区域收集900、600和400个光谱。在所有选定的区域，数据采集以矩形大小的地图格式进行，使用亚特兰大μ秒带有20的软件 使用x个–年机动舞台。使用64个共添加和Happ-Genzel切趾在4 厘米⁻¹分辨率。在开始绘制地图之前，使用与地图相同的坐标拍摄地图区域的光照图像，以便在随后的数据过滤中进行视觉引导，并收集空气背景光谱（无样品），以将数据转换为吸光度。

在数据处理之前，这些地图被分解成由坐标标记的单独光谱文件。每个光谱的许多光谱带必须由峰位拟合从而最大限度地提取化学信息。对于涉及的扫描次数，需要一个自动化程序来可靠地分析每个光谱。我们在克3.2自动化这些程序的软件（Galactic Industries Corporation，Salem，NH，USA）。在运行宏之前，确定宏中曲线设置例程的初始条件。三个区域内的子峰的中心位置是根据之前的分配确定的（Miller等。, 2001; 雷伊等。, 1989, 1990)，并且通过使用二阶导数峰值分析检查一组收集的光谱来确认这些分配。测试了几个初始条件，以确保每次分析最终拟合的再现性和有效性。在宏观常规中，首先对酰胺I的一个红外吸收光谱进行基线校正，ν₂一氧化碳_三²⁻和ν₄警察₄³⁻区域（图5)使用三次函数来解释潜在的吸光度（米勒等。, 2001). 然后使用曲线拟合子程序分别分析这三个区域。使用高斯函数之和拟合所有峰值，中心位置限制为±2 厘米⁻¹宽度限制为30 厘米⁻¹（对于宽带，40 厘米⁻¹）以避免替代收敛解。收敛标准由简化的χ²统计和根平方噪声级。每个拟合子程序最多执行50个重复优化算法，直到满足收敛标准。然后，curve-fit子程序输出中心位置、宽度和高度值、积分面积和χ²每个拟合峰值的值。由克3.2宏的命名依据相同x个–年坐标作为处理后的光谱。我们使用Borland C++开发了一个数据转换程序，将宏的输出文件解析为Microsoft Excel可读的CSV格式的单个文件。使用Excel中的过滤工具，我们首先通过非过度拟合消除光谱，然后识别并丢弃1700到1760之间吸收强度较高的非骨区域的光谱 厘米⁻¹由于甲基丙烯酸甲酯（包埋材料）的存在。积分峰面积表示为比值，以消除样品厚度不均匀性造成的影响。对于每幅图，计算出的综合峰面积比率被制成直方图，并拟合成正态分布曲线。使用定点拍摄方法收集的光谱通过相同的曲线-射线宏程序进行分析，并分别对每种动物的每种标签类型的结果比率进行平均。

图5 一个数据采集点的基线校正红外光谱。用曲线填充法分析的区域显示出来，它们的赋值如下图所示。

为了进行不同比率之间的视觉比较，使用Microcal Origin 5.0（马萨诸塞州北安普敦，美国）以与数据收集字段中相同的坐标生成比率强度的等高线图。例如，碳酸盐与基质比率的等高线图（图6)从图4所示的同一字段表明低强度区域对应于茜素标记区域（红色标记），表明新形成骨中碳酸盐矿化较少。通过将患病猴子的结果与完整受试者和治疗受试者的结果进行比较，我们能够检测到由于疾病和治疗导致的骨化学的特定变化。到目前为止，已经报道了通过IR图谱检测宏观化学变化的结果（Huang等。, 2002一)在卵巢切除动物中观察到碳酸盐显著减少，酸性磷酸盐含量增加。结合FTIR和荧光显微镜的显微结果进一步证明了磷酸盐和碳酸盐的数量以及胶原蛋白交联程度的局部变化（黄等。, 2002b). 这些结果表明，同步辐射FTIR显微光谱仪可以用于研究骨组织化学，其细节程度是其他技术无法实现的。特别是，它能够同时监测骨骼的矿物质和基质成分。此外，自动拟合程序可以快速提取红外光谱的化学信息，从而实现定量绘图。

图6 的等高线图ν2一氧化碳三2−/图4所示相同区域的酰胺I比率图是通过将通过曲线拟合分析获得的比率制表生成的x个–年图4中定义的坐标(一). 强度由图右侧的列指示的颜色渐变表示。

5.嘌呤核酸化合物的温度依赖性远红外研究

利用远红外光谱研究大分子动力学已有30多年的历史（伊藤等。, 1968; Koenig&Sutton，1969年). FTIR方法的出现和同步辐射源的可用性使得远红外光谱在生物研究中的应用增加。氢键相互作用、金属-配体相互作用和蛋白质的集体模式，以及大的动态分子运动，通常出现在200以下的光谱区域 厘米⁻¹分子动力学模拟表明，大约15%的所有振动模式都在这个范围内（Moritsugu等。, 2000). 此外，低频模式的温度依赖性揭示了它们的非谐耦合，这是由于基态布居相对于所有激发态的变化（Xie等。1999年, 2002). 对于非简谐跃迁，任何两个连续振动态之间的能隙随着振动量子态的增加而变小，因此振动跃迁的频率随着基态布居数的增加而增加。我们研究了振动频率的温度依赖性，以分析非简谐耦合。

化合物的红外光谱通常包含大量可由正常坐标分析解释的谱带，这是由于组合谱带、溶质和溶剂谱带的混合和分裂以及由于非谐性而允许的泛音。中心和外围原子的稳定同位素替代提供了一种改变振动模式的方法，以便于与计算进行比较。这种方法允许我们识别与低频氢键合模式非谐波耦合的模式。通过这种方式，我们可以在计算核酸中氢键相互作用的势能表面上进行检查。

天然丰度腺嘌呤和2-脱氧腺苷购自美国密苏里州圣路易斯的西格玛化学公司¹³C位于位置C（2）和C（8）¹⁵N位于外环氨基[N（6）]和N（9）处，并用¹³C（8）和¹⁵N（6）和N（9）时为N。同位素2-脱氧腺苷被单独标记为¹⁵N位于外环氨基[N（6）]和N（9）处，用双标记¹³C（8）和¹⁵N（9）处为N，并三次标记为¹³C（8）和¹⁵N（6）和N（9）时为N。这两组同位素化合物均来自洛斯阿拉莫斯国家实验室的稳定同位素资源。腺嘌呤及其同位素的氘化衍生物是通过氢交换回流的方式制备的，至少需要4 h、 在313 D中的K₂O（美国威斯康星州密尔沃基市奥尔德里奇；99.9%）。去离子18 M（M）Ω作为对照，对所有六个腺嘌呤样品进行水交换。

将多晶样品放置在两个直径为7的聚乙烯窗口之间 mm和厚度0.8 mm，然后安装在液氦冷指（Janis ST-100）的样品架中。温度由湖岸低温电子温度控制器（DRC-82）监测，该控制器使用安装在样品架上方的硅二极管传感器。冷手指被放置在隔热板底座上，隔热板底座安装在一个真空箱中，真空度保持在大约100 mtorr。将真空箱连接到FTIR光谱仪（Thermo Nicolet）上，该光谱仪以633的镜面速度运行 Hz，并连接到液氦冷却的掺硼硅测辐射热计（红外实验室）。光束线U2B的同步辐射束是这些实验的光源。该实验装置提供的有效光谱窗口为40 厘米⁻¹至600 厘米⁻¹.

一系列温度相关的远红外吸收光谱，从80到300 K、 腺嘌呤的含量如图7所示需要注意的重要特征是温度变化导致的频带移动和锐度。同样有趣的是80年代新乐队的出现 300中分辨率较差的K光谱 K光谱。这些新带的出现被认为是这种多晶材料中低频模式非谐波耦合的结果。

图7 多晶天然丰度腺嘌呤的远红外吸收光谱的温度相关系列。温度范围为10 K从80开始递增 K至300 K.110的光谱 K和100 为了清楚起见，省略了K。星号表示的波段在300中分辨率很低 K光谱，但在80 K光谱。数据未针对源强度的变化进行校正。

2-脱氧腺苷的远红外吸收光谱的温度依赖系列如图8所示虽然由于核糖的存在，2-脱氧腺苷的峰数大于腺嘌呤的峰数，但在104、139、247、336和542处的谱带 厘米⁻¹在这两种化合物中是相同的。与10的实验振动频率吻合良好 K可以通过密度泛函理论计算得到。这些计算和广泛的同位素标记都用于确定图7所示模式的非简谐耦合强度和8.

图8 多晶天然丰度2-脱氧腺苷的远红外吸收光谱的温度依赖系列。温度范围为10 K从10到300递增 K.星号表示的波段在300中分辨率很低 K光谱，但在10 K光谱。数据不会因源强度的变化而进行校正。

鉴于对其他生物分子中非谐耦合的研究，如此多的低频模式似乎具有强烈的温度依赖性，这一事实有些令人惊讶(例如血红素蛋白质中血红素铁的轴向振动）。我们计划确定氢键相互作用特有的关系，并在寡核苷酸以晶体和玻璃形式，以确定氢键模式对远红外区振动光谱的影响（Lappi等。, 2002)。

6.化学和环境测量

固体物质（如蜡和沥青质）在石油生产设备中的沉积是世界各地石油和天然气生产地区的主要问题（Lira-Galeana等。, 1996; Lira-Galeana和Hammami，2000年). 固体沉积物导致油井设备和管道直径减小和堵塞，最终导致采油和天然气成本增加。关于液-固相转变、这些复杂混合物在环境变化时的成核、聚集和沉积机制的许多问题，人们仍然知之甚少，这减缓了高效预防和修复技术的发展。

从组成上看，蜡沉积物是高分子量碳氢化合物和非碳氢化合物（树脂和沥青质）的复杂混合物，以及不同比例的其他捕集油、水和无机物质。由于生产过程中温度、压力和油成分的变化，不同化学成分和性质的成分可以达到过饱和在不同阶段，开始结晶、聚集和堆积，通常围绕沥青质和精细无机颗粒等核心。

本研究说明了同步辐射FTIR显微光谱实验，以表征产油井中在最高深度（或温度）形成的蜡沉积物，试图阐明沉积物中有机物质与无机相之间的物理关系。将沉积物放置在红外反射显微镜载玻片上，通过64次扫描（4次扫描）收集红外图谱和随机点射光谱 厘米⁻¹不同矿床的分辨率，使用10×10 µm孔径。

在图9所示的光谱中发现了两种不同类型的聚集体：主要为非极性（I型）和极性（II型）。然而，在同一骨料中也发现了I型和II型之间的混合类型或中间产物，这清楚地表明了使用同步辐射红外光谱法来阐明蜡沉积物与无机相的物理和化学键的优势。

图9 从油井最深处提取的蜡沉积物样品中观察到不同聚集物的红外光谱。在主要为非极性聚集体（I型）、主要为极性聚合体（II型）和混合或中间聚集体（I+II型）中观察到明显特征。

I型光谱的特征是长直亚甲基链在720和730时的同相摆动 厘米⁻¹和SH拉伸振动约2800 厘米⁻¹单I型聚集体的FTIR图谱进一步揭示了酸性羰基，这些羰基似乎主要分布在聚集体的外围（未显示）。这可能与微乳液中的油水界面现象和相互作用相关的过程有关。相比之下，II型聚集体含有较高相对浓度的无机材料。CaCO光谱的比较_三和II型骨料（图10)提供了关于最深矿床中微量金属可能的化学状态的独立证据，并与X射线荧光研究（Chouparova等。, 2002). 此外，这种骨料中也存在Si-O拉伸振动。需要进一步研究以了解这种复杂的聚集形成机制，这显然是化学和环境科学以及石油工业感兴趣的。

图10 I型和II型聚集体与CaCO聚集体的光谱比较三标准。所有碳酸盐带均出现在极性聚集体中。

7.结论

正如本报告中的示例所示亮度同步加速器红外光及其高亮度通量在远红外地区，它成为生物科学的宝贵工具。国家同步辐射光源VUV-IR环上的光束线U2B旨在为科学界提供这些独特的能力，并基于同步辐射红外线的使用继续开发新的应用和技术。