1.简介

葡聚糖调解过多的短暂的、特定的、非酶的生物接触，有时被称为“识别事件”。例如，白细胞沿着小静脉内内皮细胞滚动粘附，是由弱聚糖-蛋白质相互作用控制的，这种相互作用允许局部白细胞活化，并在外渗之前形成更紧密的相互作用（诺曼等。, 2000)。先天免疫中的自我/非自我区别可能触发不可逆免疫反应，提供了瞬态聚糖-蛋白质复合物（Blaum等。, 2015; 汉森等。, 2016)。蜂窝式聚糖通常参与细胞-细胞通信，也参与病毒与其靶细胞之间的识别，有时在其他高亲和力受体发挥作用之前。从生物物理的角度来看，大多数聚糖-蛋白质相互作用的特点是亲和力低（K（K）_天值>1 µM（M）)由芳香族氨基酸（通常是色氨酸）与氢键（包括结构水分子）之间的疏水相互作用产生。这种微弱的，因此经常是短暂的相互作用不容易用结构生物学的方法来研究。饱和传递差核磁共振（STD-NMR）实验（Mayer&Meyer，1999）, 2001)然而，在这种瞬态相互作用范围内工作得特别好。唯一的要求是调查中的相互作用可以近似在体外具有大的类蛋白实体（高达百万道尔顿或更高）和数百道尔顿至数千道尔顿范围内的小寡糖（或其他小配体）。例如，类蛋白相互作用伙伴可以是膜结合受体（Claasen等。, 2005)，一种病毒（贝尼等。, 2003)或整个细胞（Claasen等。, 2005)。通过STD-NMR研究了大量与聚糖结合相关的蛋白质。该清单包括与组织血型抗原结合的细菌毒素（Heggelund等。, 2012; 瓦西里等。2014年)、糖基转移酶（安古洛等。，2006年; 贾亚拉克什米等。, 2004)抗聚糖抗原抗体（Enríquez-Navas等。, 2015; 霍利斯顿等。2007年, 2009; 茨韦特科夫等。, 2012)、半乳糖凝集素（Kövér等。, 2010; 米勒等。, 2011; 永业等。, 2012)、植物糖苷酶（Kuntothom等。, 2010)，人类补体因子H（Blaum等。, 2015, 2016)以及先天免疫受体DC-SIGN和langerin（Mari等。, 2005; 穆尼奥斯·加西亚等。, 2015; 波尔科拉布等。, 2017)等等。STD-NMR实验在研究多糖受体病毒（如多瘤病毒（见下文）、呼肠孤病毒（Reiss等。, 2012)流感病毒（Haselhorst等。, 2008; 瓦西里等。2014年)，轮状病毒（Fleming等。2014年)、鼻病毒（贝尼等。, 2003)，诺如病毒（Rademacher&Peters，2008)和腺病毒（Lenman等。，2018年)。在这篇文章中，我们主要回顾了我们自己在多瘤病毒衣壳蛋白方面的工作，以说明结晶学和STD-NMR（Blaum）之间的协同作用等。, 2015; Neu公司等。, 2012, 2013).

2.通过“基于配体的”核磁共振探测相互作用

核磁共振波谱可以观察水溶液中生物分子及其相互作用和动力学。与其他形式的光谱学（如UV–Vis）一样，NMR使用电磁辐射来诱导和探测分子中不同能级之间的跃迁。与…对比光学光谱学技术，核磁共振中诱导的跃迁总能量较低，这就是为什么使用射频脉冲的原因。顾名思义，核磁共振依赖于原子核的性质，即它们的角动量（“自旋”）和耦合磁矩。NMR能级表示在强外部场的影响下的不同核自旋态，即永久核磁共振磁体。在核磁共振波谱仪的检测装置中，当原子核共振频率（核磁共振术语中的化学位移）与射频脉冲相匹配时，会记录微小电流，并引发能级跃迁。由于共振频率极易受化学环境变化的影响，因此可用于提取结构信息并表征导致所谓的结合事件化学变换`扰动'，即那些原子环境被配体结合改变的氨基酸的化学位移的变化。

大量研究涉及蛋白质受体与配体的相互作用，配体比受体蛋白质小得多（分子量<1–2 kDa）。一般来说，有两种核磁共振方法可以产生蛋白质-配体相互作用的信息。一种方法是基于蛋白质并监测蛋白质化学变换配体滴定的扰动（Williamson，2013)。这种方法需要蛋白质受体的稳定同位素标记（通常¹⁵N） 以及二维核磁共振谱的记录，并且受到蛋白质大小的限制。而配体本身在化学变换扰动实验，即它的化学位移没有被记录，它与¹⁵N标记蛋白以残留物特异性的形式显示化学变换随后用于描述配体结合位点和/或变构结合效应的变化。另一方面，STD-NMR实验属于“基于配体”的NMR实验，其中使用小分子配体而不是蛋白质作为复合物形成的探针（Meyer&Peters，2003)。在基于配体的核磁共振实验中，蛋白质仍然“不可见”，只观察到配体的化学位移。作为配体检测的结果，基于蛋白质的NMR的许多缺点被规避了：通过STD-NMR，大分子量的蛋白质不是问题，不需要同位素标记，并且蛋白质浓度通常在低微摩尔范围内。由于小配体的核数有限，其核磁共振谱包含的核数很少光谱重叠，无处不在的共鸣¹可以使用H核（核磁共振术语中的质子）。因此，STD-NMR实验可以在任何NMR光谱仪上进行，通常只需要测量时间的一小部分化学变换扰动实验，以及未标记的蛋白质。在有利的情况下，在不到1 h.另一方面，STD-NMR没有提供任何关于蛋白质的直接结构信息。相反，完全从配体的角度观察到蛋白质与配体的相互作用。

3.STD-NMR实验是结晶学的简单而漂亮的补充

STD-NMR依赖于饱和转移从蛋白质质子共振到配体的质子在蛋白质结合态和自由态之间交换。简言之，蛋白质的质子共振在远离任何配体共振频率的射频下选择性饱和（图1一)。在络合物的寿命期间，这种饱和度传递给结合配体的质子。如果是这样饱和转移发生这种情况时，产生的质子光谱在化学位移方面类似于自由配体光谱，但个别峰强度会因配体质子在结合位点的位置不同而不同地衰减（图1一)。在非常肤浅的层面上，该实验与FRET实验有一些相似之处，因为两者都是光谱技术，其中一个实体被选择性激发能量传递只有在满足某些要求（例如距离范围或相对方向）时，才能观察到另一个实体。核磁共振的距离截止饱和转移位于4-5 奥兰治。如果配体化学变换范围不同于蛋白质化学变换范围，通常是这种情况（图1b条).

图1 STD-NMR技术示意图。(一)顶部：蛋白质质子的直接激发（饱和）导致快速自旋扩散和饱和转移结合小配体（浅蓝色）。解离后，大的直接激发的蛋白质迅速返回基态（灰色），而配体保持在络合物寿命期间转移的质子特异性激发模式（浅蓝色，带有差异激发的质子）。底部：具有同等强度共振信号（顶部，黑色）的自由配体光谱和具有相对峰值强度的STD-NMR差异光谱（底部，蓝色）的示意图，代表蛋白质结合囊中每个配体质子的位置。(b条)150的质子共振谱窗 kDa蛋白（顶部）和a 970 Da四糖（底部）。HDO信号为4.8 p.p.m.在两个光谱中都被截断。光谱记录在288 K，参考298 K（Clore&Potts，2012年)。蛋白质光谱中相对清晰的信号 下午3点至4点 p.p.m代表具有更大灵活性的N-糖基化链，因此其线宽减小。

STD-NMR数据与相应络合物的高分辨率结构的定性匹配提供了许多有价值的见解，并有力地补充了结构数据。一个典型的STD-NMR实验需要不到1 h，需要5–20分 µM（M）未标记蛋白质和一个或多个小（潜在）配体的10–1000倍过量的水溶液。典型样本量为200 µl（如果NMR管内径为3 使用mm）。在获得有关配合物的结构信息之前，该方法可作为从候选配体混合物中识别结合配体的筛选工具。然后进行共结晶或结晶浸泡实验。当蛋白质-配体复合物的结构信息已经可用时，STD-NMR是测试基于结构的预测的直接工具，例如测试结构相关配体的结合模式或评估基于结构的突变中的配体结合。因为饱和转移蛋白质和配体之间的距离依赖（大致与第页⁻⁶)，一个简单的一维质子STD-NMR谱包含有关络合物几何结构的信息。STD-NMR光谱中的相对强度直接转化为与蛋白质表面紧密接触的配体部分（图1一)。在定性解释中，STD-NMR谱中的相对强度因此提供了结合表位原子分辨率（Mayer&Meyer，2001)。这对于表征蛋白质-聚糖相互作用特别有用，因为即使对于复杂的分支低聚糖该方法可以很容易地阐明糖链中那些重要的结合决定簇。在糖生物学中，我们通常不处理单个配体。相反，一些结构上相关的聚糖和一个普通人表位通常可以与给定的蛋白质发生相互作用，STD-NMR是分析（或预测）所有蛋白质的合适工具聚糖包含基本的装订主题（菲格等。, 2012)。由于STD-NMR光谱包含了有关配合物中配体-蛋白质距离的信息，因此可以使用它来评估从晶体结构在解决方案中，可能有助于解决由晶体接触引起的歧义。最后，它可以为混合动力汽车提供结构约束精炼协议。因此，STD-NMR数据可以直接与相应的晶体数据进行协同比较，如下所示。

从概念上讲，STD-NMR实验的物理可以分解为不同的过程，这些过程有助于理解其关键特征，例如分子量和K（K）_天实验表现最佳的范围。假设大多数读者更喜欢应用性而非理论，我们现在将首先讨论STD-NMR实验的应用，然后在本综述的第二部分中回到对该方法的逐步理论描述，为那些正在考虑自己应用该方法的读者解释诸如饱和和饱和转移机制之类的物理概念。

4.多瘤病毒展示

多瘤病毒（PyV）是一类小型双链DNA病毒，可在哺乳动物、鸟类和鱼类中引起轻微到致命的疾病（包括癌症）。大多数PyV与唾液酸结合聚糖在宿主细胞质膜上呈现为鞘糖脂头部基团或聚糖分支糖蛋白。在一些PyV中聚糖作为唯一的受体，而在其他受体中，已经确定了其他受体。最著名的PyV之一是猿猴病毒40（SV40），早期脊髓灰质炎活疫苗的污染物，由恒河猴肾细胞产生。幸运的是，SV40与人类疾病无关（Sweet&Hilleman，1960; Strickler公司等。, 1998)。SV40受体是一种小的唾液酸化糖脂，即神经节苷脂GM1（Tsai等。, 2003)，其结合直接引发膜弯曲和内陷，并最终引发病毒的细胞摄取（Ewers&Schelhaas，2012)。每个PyV衣壳主要由360个主要衣壳蛋白VP1拷贝构成，该蛋白采用所谓的胶状卷曲折叠（Liddington等。, 1991; Stehle&Harrison，1997年; 施特勒等。1996年)衣壳内部覆盖着不同数量的小衣壳蛋白。五个VP1单体组装形成五聚体VP1 capsomer，其中72个组成二十面体衣壳。在大多数已知结构的PyV中，五个唾液酸结合位点围绕VP1五聚体的中心五倍轴对称排列（图2)。尽管VP1五聚体的整体结构保持不变，唾液酸结合位点在三个暴露环之间的位置也经常保持不变，但结合位点的结构、环中的氨基酸残基和聚糖特异性在不同的PyV（Neu等。, 2011, 2012; 施特勒等。, 1994; 斯特罗赫等。, 2015)。虽然非还原末端唾液酸（Neu5Ac）“帽状物”是迄今为止大多数PyV的主要接触物，但Neu5Aic配位以外的一些额外相互作用赋予了不同的聚糖特异性，反映在不同的聚糖微阵列图谱中，转导实验中的血凝模式和受体使用（Neu等。, 2008, 2012, 2013)。而SV40结合支链的、单唾液酸化的GM1五糖（图2)人类PyVs BKPyV（可导致肾脏移植患者肾病）和默克尔细胞PyV（MCPyV，默克尔细胞癌的病原体）不与GM1结合（埃里克森等。, 2009; 低等。，2006年)。相反，BKPyV特别参与α2–8个二乙酰化神经节苷脂，例如GD3，以及包含线性GD3四糖作为分支聚糖结构的一部分的更复杂的神经节苷酯（例如GD1b和GT1b聚糖；见图2; 低等。，2006年; Neu公司等。, 2013)。迄今为止，MCPyV的功能性受体尚不清楚，但已经证明MCPyV-VP1五聚体结合GT1b神经节苷脂和较短的线性唾液酸化物聚糖包含α2–3链接Neu5Ac（埃里克森等。, 2009; Neu公司等。, 2012).

图2 多瘤病毒VP1五聚体的结构，以及文本中使用的典型聚糖结合位点和神经节苷脂寡糖的位置。左：SV40 VP1五聚体（灰色卡通表示），五个GM1聚糖结合位点中有三个被占领（Neu等。, 2008)。GM1使用3D-SNFG（甘氨酸图形表示的符号命名法）表示法显示。右、顶行、左至右：3D-SNFG中的GM1聚糖、3D-SNFG图标和SNFG表示。右、下一行、左至右：b系列神经节苷脂GD3、GD1b和GT1b低聚糖在SNFG代表中。这个绘图聚糖-SNFG服务器（Cheng等。, 2017)和3个D-SNFG公司脚本（Thieker等。, 2016)的供应商管理部（汉弗莱等。1996年)用于生成SNFG类型表示。

PyV家族衣壳-聚糖相互作用的结晶分析相对简单，因为N端和C端截短的VP1结构可以在大肠杆菌并形成VP1五聚体，无法组装成完整的衣壳，重量约为150 kDa（Stehle&Harrison，1997）; 图2)。虽然由于晶体接触，VP1五聚体中的一些暴露的聚糖结合位点可能无法接近，但VP1五聚合体中的五个相同位点仍然允许通过结晶学测定VP1-聚糖复合物。为了确定不同多瘤病毒之间聚糖特异性的差异，我们对一些PyV VP1–glyan复合物进行了X射线结晶学和STD-NMR光谱分析，阐明了该病毒类（Neu等。, 2011, 2012, 2013; Ströh&Stehle，2014年; 斯特罗赫等。, 2015).

4.1. BKPyV：寻找正确的结合构象，尽管存在晶体接触

在晶体结构在BKPyV VP1和GD3四糖之间的络合物中，晶体中的四个配体分子之间存在着很大的差异非对称单元（图3)。GD3聚糖与Neu5Ac二烷基化α2–8Neu5Acα非还原端的2-3个“帽”（图2)。而终端（非还原端）Neu5AcαGD3的2-8环在四个被占据的结合位点中的每一个内采用基本相同的取向，观察到其糖苷键的三个不同取向，导致第二个Neu5Ac的取向显著不同α异径端的环（Neu5Acα2–3圈）。此外，只观察到两个吡喃糖在两个结合位点中，在另一个位点中有三个环，在第四个占据的结合位点中有完整的GD3四糖。BKPyV VP1和末端Neu5Ac之间的许多保守相互作用α2-8反映在这种单糖在STD-NMR差异光谱中的显著作用（图4)。有趣的是，在晶体结构与该复合体的STD差谱不兼容。对于这两个具有足够电子密度的结合位点，可以建立Gal环的模型（图3b条和3c（c）)，其H5和H6质子落入≤4 与蛋白质最近的脂肪族C原子的ω，这意味着很好饱和转移这些质子是可以预期的。这同样适用于支持全GD3聚糖建模的结合位点内Glc环的H6质子（图3c（c）)。然而，这些质子都没有在BKPyV VP1–GD3 STD差谱中产生强峰值（图4)，使得构象不太可能是真正的结合构象。此外，三种Neu5Ac中只有一种α2–8Neu5Acα糖苷连接方向（图3一和3b条)与核磁共振谱完全兼容，而其他两个方向（图3c（c）和3天)被排除在外。在后一个方向（图3c（c）)强可观测Neu5AcαSTD光谱中预计不会出现2–3环甲基，因为其质子将超过5 Å来自最近的脂族蛋白质C原子。在另一个方向（图3天)由于同样的原因，H5和H6质子不会出现在STD光谱中，但光谱中包含两个质子的贡献（图4)。仔细评估晶格（未显示）也支持这样的观点，即晶体中的四个配体结合位点中只有一个真正反映了BKPyV VP1对GD3聚糖的识别（如图3所示一)而其他三个位点反映了晶体填充偏倚[在图3所示的结合位点中(b条)仅限于Neu5Acα2–3加仑β悬挂机构的灵活性降低，但Neu5Ac不会变形α2–8Neu5Acα发生联动]。

图3 BKPyV VP1–GD3晶体（Neu）中的四个GD3聚糖结合位点等。, 2013)。只有GD3方向出现在(一)和(b条)与图4所示的STD-NMR差谱兼容.残留物Lys68突出显示在(一)。§中明确讨论了附加质子的C原子4.1在建模处贴上标签。

图4 MCPyV和BKPyV VP1与GD3聚糖复合物的独特结合表位。(一)GD3参考光谱（顶部）、BKPyV和MCPyV VP1 STD-NMR差异光谱（从顶部起第二个和第三个）和单个的TOCSY光谱吡喃糖在GD3四糖中，用SNFG表示标记，如图2所示图中显示了还原端Glc环的两种不同形式的TOCSY光谱（底部和从底部算起的第二个）。杂质用星号表示。标记TOCSY光谱中的选定共振。Neu5Ac的H3–H6质子共振α2–3环和Gal环的H1和H4质子共振在MCPyV VP1 STD差谱中可清楚识别（4.48和3.90 p.p.m.）。这个表位相比之下，在BKPyV VP1差谱中可以看到，主要包括两个Neu5Ac环的共振。截断峰值在2 p.p.m.（带框）属于Neu5Ac甲基，在(b条)。HDO和甲基组信号被截断。两种STD差谱的更详细赋值可在Neu中找到等。(2012, 2013)。核磁共振波谱记录在283 K，参考298 K；STD饱和时间为2 第条(c（c）)GD3的3D-SNFG（顶部，灰色）表示表位按照MCPyV VP1–GD3的规定晶体结构（底部，GD3中间二糖为浅橙色；Neu等。, 2012)。将脂肪族H原子添加到晶体结构在里面PyMOL公司.

4.3. SV40和BKPyV：点突变导致受体切换

人BKPyV和猴SV40 VP1蛋白的序列同源性为74%。尽管它们的聚糖特异性不同（BKPyV中的二乙酰化神经节苷脂与SV40中的GM1），这两种病毒各自聚糖结合位点的结构相似。特别是，非还原端Neu5Ac环在两个结合位点上的取向是相同的，并且由一组类似的疏水和极性相互作用（Neu等。, 2013)。在SV40–GM1聚糖复合物中，与其他四种聚糖中任何一种的唯一额外定向相互作用吡喃糖在GM1中，Ser68侧链和非还原端Gal的C6位Gal羟基之间的氢键覆盖了支链五糖（Neu）的第二臂等。, 2008)。在BKPyV VP1中，残基68是赖氨酸，其侧链与GD3（GD1b…）聚糖中的第二个Neu5Ac环羧基配位（图3一)。这里，这又是观察到的该环的唯一直接接触。该观察结果使我们将SV40和BKPyV的不同聚糖特异性仅归因于VP1氨基酸68，并假设用丝氨酸（BKPyV-K68S）替换BKPyVVP1-Lys68将使该突变病毒使用GM1，不是GD3和其他带有二乙酰化“帽”的神经节苷脂作为受体。事实上，在细胞培养中发现设计的突变病毒与GM1结合，并且相应的VP1五聚体产生了一个被突变显著改变的聚糖微阵列结合谱（Neu等。, 2013).晶体结构未尝试测定BKPyV K68S VP1–GM1聚糖复合物，但获得了STD-NMR光谱，并与野生型BKPyV和SV40 VP1光谱进行了比较。令我们惊讶的是，K68S突变体的STD-NMR差异谱不仅显示出与GM1聚糖的明确结合，而且与参考SV40 VP1–GM1聚糖谱没有区别，而GD3结合不再被观察到（图5)。一般来说饱和转移可能是由非约束性和低速关闭引起的（参见§9） 因此，很难就是否仅从“负”STD-NMR差谱中发生相互作用得出明确结论，这是该方法的明显局限性。然而，可以合理地假设饱和转移基于结构的必需氨基酸突变更有可能代表结合受损，而不是脱落率降低。

图5 BKPyV VP1中的K68S突变改变了从GD3到GM1聚糖的聚糖特异性。前三个光谱：GD31H参考谱、野生型BKPyV VP1–GD3聚糖STD-NMR差谱和K68S突变型BKPy V VP1-GD3 STD-NMR差谱。底部四个光谱：GM11H参考谱、SV40 VP1–GM1聚糖STD-NMR差谱、K68S突变型BKPyV VP1–GM 1 STD-NMR差谱和野生型BKPy V VP1-GM 1聚糖STD NMR差光谱。HDO和甲基组信号被截断。核磁共振波谱记录在283 K，参考298 K；STD饱和时间为2 第条。

5.非极性相互作用过滤器

图4所示的蛋白质“指纹”和5特别是SV40–GM1和BKPyV K68S–GM1光谱的惊人相似性，突显了配体-蛋白质复合物的一个方面，仅从晶体结构分析来看，这一方面往往被低估了：疏水相互作用。高分辨率（<2.0 蛋白质-聚糖复合物的晶体结构允许直接分析氢键和盐桥的自由能贡献，非极性相互作用的贡献更难从纯视觉分析中提取（更不用说量化）。在复杂晶体结构中观察到的一些极性相互作用取代了与所研究的溶剂化未连接蛋白质中有序水分子提供的相互作用类似的相互作用，这是一个同时具有焓和熵部分的因子，其对络合物形成自由能的净贡献很难估计。尽管有许多羟基和其他极性基团吡喃糖，最碳水化合物具有非极性表面，因此，蛋白质-聚糖复合物的形成可以通过疏水效应合理化。最近，碳水化合物-碳水化合物和碳水化合物-蛋白质复合物中的非传统CH…O氢键受到了越来越多的关注（埃施巴赫等。, 2017; 齐尔克等。, 2013)以及聚糖结合囊中芳香侧链和相关CH–π相互作用已被很好地记录在案（哈德森等。, 2015; 拉米雷斯-瓜利托等。, 2009)。在这里，STD-NMR光谱补充了晶体学的一个自然缺陷，因为大多数STD-NMR分析仅限于在绝大多数X射线数据集中看不见的原子：质子。更准确地说，因为光谱是在水溶液中收集的，即极性、缓冲区、只有脂肪族配体质子共振可见，而极性/酸性H原子组聚糖（羟基、胺基和羧基的一部分）与周围的溶剂分子迅速交换。因此，STD-NMR光谱中缺少了从晶体结构目视检查中容易发现的极性相互作用。相反，光谱仅提供从脂肪族质子获得的信息，这些质子与水分子的交换速率不高，也无法通过X射线晶体学进行可视化。

6.结构精炼基于STD-NMR

STD-NMR光谱提供了瞬时蛋白质-配体接触的个别“指纹”，个别质子共振的STD强度可能是结构再精细化协议的限制。事实上，控制蛋白质和配体-蛋白质复合物中自旋扩散（见下文）和其他形式NMR典型能量交换的物理原理已经被很好地理解，并且可以通过完全弛豫和构象交换矩阵（CORCEMA）理论进行分析描述（Rama Krishna和Jayalakshmi，2008; 莫斯利等。, 1995)。在核磁共振术语中，“构象交换”包括复杂的形成和解离。CORCEMA理论最初是为分析相互作用分子的二维NOESY光谱而开发的，后来扩展到饱和转移（ST）实验（贾亚拉克什米和拉玛·克里希纳，2002）)。使用CORCEMA-ST公司软件，运行于MATLAB软件，STD峰值强度不仅可以用于半定量分类结晶学和核磁共振结果，因为它们大致符合相同的配体结合表位，如我们的PyV示例中所示，但要定量检查结晶学模型中的结合配体构象。这可以执行通过根据晶体络合物模型预测STD强度和累积曲线，并与实验STD-NMR光谱进行定量比较（便于用户使用CORCEMA-ST公司协议，参见Enríquez-Navas等。, 2015)。STD强度也可以输入混合精炼旨在改进对接结果或基于apo蛋白质结构和配体的某种构象知识生成初始配体-蛋白质结构的其他方法的协议通过实验约束模拟退火扭角优化（Jayalakshmi&Rama Krishna，2004).

7.将结构生物学扩展到大型复杂系统

迄今为止，结构生物学中高分辨率技术的一个主要缺点是需要高纯度和均匀的样品。对于多域蛋白质，截短的结构体通常更容易结晶，但这种结构体的发现最好在全蛋白的背景下进行仔细研究。多组分系统也是如此，它们通常按照“分而治之”的策略被分解成更小的部分进行晶体研究。然而，将一种蛋白质从其生物背景中剔除可能会导致其功能失活。对于膜蛋白来说，这尤其是一个问题，在结构研究或重新整合到脂质体中之前，膜蛋白通常会溶解在洗涤剂中。在这两种情况下，STD-NMR都可以填补实验空白，因为NMR样品中的“蛋白质”部分实际上可能是一个复杂、不均匀、含蛋白质的实体，它本身会抵制高分辨率技术。使用完整的病毒或带有聚糖受体的病毒样颗粒（Benie等。, 2003; 哈塞尔霍斯特等。, 2008; Rademacher&Peters，2008年)。我们利用该技术筛选了一种具有19个不同柔韧性的连接子的多糖基化20域蛋白中潜在的低聚糖配体，并将结果应用于两域结构体的结晶（Blaum等。, 2015)。事实上，可以使用活的哺乳动物细胞作为选择性激发成分（Claasen）来记录STD-NMR光谱等。, 2005; 马里等。, 2005; 瓦西里等。，2018年)。未经修饰的细胞和过度表达特定膜蛋白的细胞（或者相反，含有一个蛋白的敲除）的组合可以产生小分子与膜包埋蛋白（Vasile）结合的结论性结果等。，2018年)。例如，使用类似的策略来评估脂质体整合的整合素的功能完整性：记录此类脂质体和整合素结合肽的STD-NMR光谱，并将其与天然血小板获得的光谱进行比较（Claasen等。, 2005)。或者，被调查系统的复杂性也可能源于“缓冲区”，而不是选择性激发的实体。例如，检测和表位抗GM1抗体的特性通过经证实，在补充GM1聚糖后，直接从格林-巴利综合征和费希尔综合征患者的血清中获得STD-NMR（霍利斯顿等。2007年)。在这样的样品复杂性水平上，可以使用一个额外但简单的“过滤器”：虽然激发可能仍然是选择性的，只要没有激发配体共振（可以用只包含配体的单独样品进行检查），激发可能对单个蛋白质不具有选择性，由此产生的STD-NMR差谱可能包含来自与研究中配体或溶液中其他小分子的额外相互作用的信号。然而，这个问题可以简单地通过减去使用对照获得的STD-NMR差异光谱来解决，例如，没有过表达的感兴趣的膜结合蛋白的细胞悬浮液或没有添加所述配体的血清光谱，从而产生所谓的饱和转移双差（STDD；Blaum等。, 2015; 克拉森等。, 2005)。或者，可以使用一种完全不以天然形式表达所研究膜蛋白的细胞类型。例如，在293T细胞中表达的人和禽流感病毒株血凝素可以根据流感病毒受体部分Neu5Ac进行研究α2–6加仑β1–4GlcNAc，无任何细胞背景（Vasile等。，2018年)。不用说，STD-NMR实验也可以用于评估特定蛋白质批次的质量脂质体当在与具有良好特征的参考批次相同的条件下记录光谱时，对STD强度进行比较。与任何配体结合分析的质量控制类似，给定制剂中折叠/活性蛋白的百分比可以通过STD-NMR（Da Veiga等。, 2016).

8.STD-NMR的更复杂变体

当然，STD-NMR适用于更复杂的设置：例如，选择性激发也可以通过同位素标记混合物中的一个伙伴来实现，在混合物中，两个相互作用伙伴的质子共振频率范围比蛋白质-聚糖场景中更相似，或实现差分预饱和（Kövér等。2007年, 2010; 瓦格斯塔夫等。, 2010)。该方法也可以扩展到多维光谱（Wagstaff等。, 2010; Mayer&Meyer，2001年)。由于与大蛋白的相互作用可作为一种光谱过滤器，STD-NMR可用于筛选与潜在配体混合物的结合，以确定离解常数（Angulo等。, 2010)和复杂的结合等温线（Mallagaray等。, 2017)，或评估两种配体对共同结合位点的竞争并确定IC₅₀价值观（Mayer&Meyer，2001)。甚至有一个实验的扩展版本，其中两种独立配体类型与给定蛋白质的相对结合位置是相关的通过 磁化转移首先从一个配体到一种蛋白质，然后到同一蛋白质的另一种配体类型（Orts等。, 2008).

9.STD-NMR实验逐步解释

从概念上讲，从更物理的角度来看，STD-NMR实验期间发生的事情可以分为不同的步骤，如下所述。

10.如何执行STD-NMR波谱：实际考虑、建议和结论

对于一个开始使用STD-NMR波谱来研究蛋白质-碳水化合物复合物的结构生物学家来说，有一些挑战和考虑。首先，当然，结构生物学家通常手头没有核磁共振仪器或不知道如何操作它。这实际上是一个相当小的障碍，因为任何（合成）化学部门的分析部分都可以使用仪器进行实验，并且通常具有与其操作关联的服务。信噪比和光谱分辨率随场强增加而增加，但为400–500 如果没有更高的磁场，MHz仪器也可以。用于操作核磁共振光谱仪的软件附带一组标准实验（射频脉冲序列），至少对于Bruker仪器而言，该组包含STD实验。

在使用蛋白质-碳水化合物相互作用的标准脉冲序列之前，需要考虑的一个重要方面是水分抑制。水共振是迄今为止所有液体生物核磁共振样品中浓度最高的组分，在生物核磁共振应用和相应的脉冲序列中通常会受到抑制。使用时碳水化合物，这一事实需要仔细考虑：水抑制技术对物质没有选择性；相反，它们抑制了水质子共振频率范围。碳水化合物，不幸的是，往往含有在水质子频率附近共振的质子，尤其是异聚质子（图4和5)。当使用水抑制时，这些信号也至少部分地与水共振一起被抑制，并且从光谱中消失或被人为地减少。这个问题可以通过使用高纯度的氘化水而不是氢来解决₂O（5–10%D）₂出于技术原因，O也用于水基核磁共振样品中），并从脉冲序列中去除水抑制方案。因此，碳水化合物和蛋白质需要溶解或缓冲交换成基于高纯度D的缓冲溶液₂O.缓冲液交换在旋转浓缩器或旋转柱中最可行，因为透析可能会使用太昂贵的D₂O。

另一个重要问题是缓冲液的组成：大多数生物缓冲物质含有与低聚糖（和其他小分子配体）共振重叠的质子共振，并且在配体上存在大量过剩。这可能导致STD-NMR差分光谱中重要配体共振的位置出现丑陋的减法伪影。同样，最好通过选择其他化学物质作为缓冲液来克服这一障碍，即那些不含脂肪族质子（核磁共振波谱学家最喜欢的缓冲液是磷酸盐）或定量氘化的化学物质，如HEPES（d₁₈)或Tris（d₁₁)比磷酸盐更贵。综上所述，结构糖生物学实验室转入STD-NMR的初始费用是非常可控的。虽然高纯度D₂O和氘化缓冲液很昂贵，核磁共振管（3 mm内径MATCH管）和磷酸盐是便宜的。

最后，但并非最不重要的是，了解STD-NMR谱中的共振是什么很重要。各种分配低聚糖在数据库和文献中也可以找到其他小分子，但当缓冲条件和温度发生变化时应小心，因为质子共振对这种变化非常敏感。如果你找不到你喜欢的配体的共振分配，你可能需要向你喜欢的核磁共振波谱师寻求帮助。通常，对于小配体，会有一系列一维光谱，例如¹H TOCSY和¹H COSY光谱如图4所示足够了，每一个都不到一分钟就可以录制。如果¹³需要C谐振来解决由于在¹H尺寸和¹³C无法标记，a 1 米M（M）需要记录配体样品和几个小时的测量时间¹H、，¹³C HSQC或HMBC光谱¹³C核（1.1%）。

不管你正在研究的系统是什么，也不管性病实验是否适用于特定的系统，实验还有另一个有用的方面：你有没有想过你的宝贵聚糖或其他昂贵的配体是它的标签上写的？或者它可能有多纯净？核磁共振会告诉你。