2.1. 基因克隆、蛋白质表达和纯化

这个TTHA0266型如前所述，克隆基因并表达和纯化P60_tth蛋白（Wong&Blaise，2013). 将该基因在带有Trx标记、His标记和S标记的框架中克隆到pET-32 Ek/LIC表达载体中，该表达载体用作模板，使用以下引物生成截断突变体P60_2LysM（无催化域）、P60_1LysM和P60_cata（仅催化域）：，反向引物GAGGAGAGCCCGGTTACCGCCTCGCCCTTCGGAGAGAGCTCCAGGACCTGCCCCTTG；对于P60_1LysM，正向引物GACGACGACAAGATGGAGAATCTGTACTTCCAGGA公司TCGAGGGAAAGGACCACCGTGGCCCCGGGACCC；对于P60_cata，前向引物GACGACGACAAGATGGAGAATCTG公司TACTCCAGGA公司gaaagcccccctccccccgggccgtccccctctacctgggg。粗体序列对烟草蚀刻病毒（TEV）蛋白酶切割位点，其在蛋白质纯化过程中被引入以促进亲和标签的去除。上述截断突变体的基因均克隆到pET-32 Ek/LIC载体（Novagen）中。pET-44和pET-32 Ek/LIC载体（Novagen）中的P60_tth_LysM1_mut和P60_tth_LysM2_mut结合突变体分别是根据制造商的说明使用QuikChange Lightning Site-Directed Mutagenisation Kit（安捷伦科技）生成的。pET-44 Ek/LIC矢量在N端编码His标签、Nus标签、His标签和S标签。所有突变体均采用与野生型蛋白相同的程序进行生产和纯化。简言之，重组蛋白是在大肠杆菌BL21 Rosetta 2（DE3）活性细胞（Novagen），通过超声波溶解。净化步骤包括第一轮镍亲和性色谱法（IMAC）、TEV蛋白酶裂解、第二轮IMAC和尺寸排除色谱法使用Superdex 75 10/300 GL列（GE Healthcare）。对于P60_cata，在第一轮IMAC后进行凝血酶裂解。对于P60_tth_LysM1_mut构造，额外的阴离子交换色谱法在第二轮IMAC后引入步骤，将裂解标签与蛋白质分离；这是使用1执行的 ml HiTrap DEAE FF柱（GE Healthcare）。所有纯化步骤均在4°C下进行，在最后一步纯化后，所有蛋白质的纯度至少为95%。

2.2. 结晶和结构测定

如前所述，使用硒代蛋氨酸衍生物晶体求解全长蛋白质结构（Wong&Blaise，2013). 简言之，硒代蛋氨酸衍生物蛋白在19°C下在由1 24μl蛋白质溶液 毫克 毫升⁻¹和1 µl储液罐溶液，含0.1 M（M）柠檬酸钠pH 5.5，16%(w个/v（v）)聚乙二醇4000，15%(v（v）/v（v）)异丙醇与500平衡 µl储液罐溶液。将晶体浸泡在含0.1的低温保护剂溶液中 M（M）柠檬酸钠pH 5.5，16%(w个/v（v）)PEG 4000和20%乙二醇，然后在液氮中冷冻。数据采集在0.978波长下进行 瑞典隆德MAX-lab同步加速器的I911-3束线上的欧（Ursby等。, 2013)如前所述（Wong&Blaise，2013). 该结构通过单波长求解反常色散（SAD）阶段化（亨德里克森和蒂特，1981年)如Wong&Blaise（2013）所述).

P60_2LysM在19°C下在28%的条件下结晶(w个/v（v）)PEG MME 2000和0.1 M（M）硫氰酸钾。通过添加1设置坐垫 µl储液罐溶液至1 微升50 毫克 毫升⁻¹蛋白质溶液与500平衡 µl储液罐溶液。将晶体浸泡在含有34%的母液中(w个/v（v）)PEG MME 2000在液氮中低温冷却之前。数据收集在MAX-lab的I911-3波束线上。数据集由200帧组成，采集的振荡范围为1°，5 s曝光时间，波长0.98 以及204.8的晶体到探测器的距离 毫米。

通过将碳水化合物粉末直接溶解在蛋白质溶液中，并在冰上培养过夜，以1:2的蛋白与糖摩尔比将两个LysM结构域与甲壳己糖（Megazyme）共结晶，获得了与甲壳六糖结合的P60_2LysM的结构。该络合物在19°C的条件下结晶，条件为1.6 M（M）硫酸铵，0.1 M（M）MES pH 6.5和5%(v（v）/v（v）)1,4-二恶烷。添加0.5设置吊坠 µl储液罐溶液至0.5 32µl蛋白质溶液 毫克 毫升⁻¹相对于500 µl储液罐溶液。将晶体浸泡在含有1.6的溶液中 M（M）硫酸铵，0.1 M（M）MES pH 6.5，20%(v（v）/v（v）)1,4-二氧六环和5%(v（v）/v（v）)甘油，然后在液氮中冷冻冷却。在MAX-lab（Mammen）的I911-2光束线上收集数据等。2002年). 数据集由200帧组成，采集范围为1°，5.2 s曝光时间，波长1.04 以及晶体到探测器的距离为100 毫米。

所有三个结构都用菲尼克斯包装（亚当斯等。, 2011)模型的建立是用库特（埃姆斯利等。, 2010). 三个结构的质量通过摩尔概率（陈）等。, 2010)给出了Ramachandran图的以下核心/允许统计数据：全长结构为95.3/4.7%，P60_2LysM-壳聚糖结构为97.6/2.4%，P60_2 LysM结构为97.4/2.6%。

2.3. 尺寸排除色谱法

A类校准曲线使用凝胶过滤标记试剂盒获得蛋白质分子量6 500–66 000 Da（Sigma–Aldrich）通过绘制分配系数 K（K）_{av（平均值）}相对于标准蛋白质分子量的对数。将蛋白质加载到Superdex 75 10/300 GL柱上（GE Healthcare），并用含50 米M（M）Tris–HCl pH值8200 米M（M）氯化钠和5 米M（M） β-流速为0.5的巯基乙醇 毫升 最小值⁻¹.

2.4. 小角度X射线散射（SAXS）实验

SAXS数据是在法国格勒诺布尔的欧洲同步辐射设施（ESRF）获得的。数据记录在光束线BM-29上，并以牛血清白蛋白（BSA）和水为参考进行绝对刻度校准。使用BsxCuBE公司波束线上可用的软件套件（Pernot等。, 2010). 这产生了散射强度我(q个)，其中散射矢量q个由定义q个= 4π罪(θ)/λ，其中θ是散射角的一半λ是入射光束的波长。所有建模均采用珊瑚（佩图霍夫等。, 2012)所有结构的散射用CRYSOL公司（斯维尔贡等。, 1995).珊瑚跑步时没有任何强加的对称性CRYSOL公司已使用默认设置运行。这两个软件包都来自ATSAS公司套房v.2.4（Petoukhov等。, 2012).

2.5. 微尺度热泳结合研究

使用微型热泳法（MST；Seidel等。, 2013). 使用Monolith NT.115蛋白质标记试剂盒BLUE（NanoTemper Technologies）标记蛋白质，标记蛋白质与染料的摩尔比率约为2:1。制备了一个双重滴定系列，其中标记蛋白的浓度保持在200 n个M（M）滴定剂，壳六糖的浓度在152之间变化 n个M（M）至5 米M（M）在由50组成的热泳缓冲器中 米M（M）磷酸盐pH 7.5和0.1%吐温20。孵育1天后 使用Monolith NT.115仪器（NanoTemper Technologies）在室温下进行MST测量。使用标准毛细管，并将LED功率调节到50%。每种蛋白质的阴性对照使用200 n个M（M）在上述相同条件下，所有16条毛细血管的热泳缓冲液中的标记蛋白。每次测量时，激光器打开30 s，关闭5 s.结合曲线是在红外激光功率为20%的热泳相中获得的。对于每种蛋白质，制备了三组滴定系列，并用以下公式拟合了乙状剂量-反应曲线GraphPad棱镜6得出平均值K（K）_d日值。

2.6. PDB代码

与甲壳己糖结合的P60_tth、P60_2LysM和P60_2LysM结构的原子坐标和结构因子已保存在蛋白质数据库（Berman）中等。, 2000)作为条目4厘米，4个uz3和4个uz分别是。

3.1.晶体结构第60_tth页

如前所述，表达P60_tth蛋白并结晶（Wong&Blaise，2013）). P60_tth结构通过单波长求解反常色散（SAD）方法（Hendrickson&Teeter，1981）)如前所述，使用硒代蛋氨酸衍生物蛋白质（Wong&Blaise，2013).

结构优化至2.65 分辨率和细化统计如表1所示。最终模型中包含两个分子非对称单元（链条A类和B类). 分子在建模完成方面并不等价。在这两个催化结构域中，残基117–246可以构建成链A类链的残留物122–245B类四个LysM结构域中只有三个可以被追踪到；可以对两个N端LysM结构域（LysM1）进行建模，但对于第二个LysM域之一：链上的LysM2，没有观察到电子密度A类此外，链的LysM1和LysM2之间的连接器B类可追溯（图1b条和1c（c）).

晶体填料的分析国际学生成绩评估服务器（Krissinel&Henrick，2007）)表明晶体内形成稳定的同二聚体。二聚体的形成由两个催化结构域之间以及链的LysM1结构域之间的相互作用介导B类和催化域链的A类和反之亦然（图1b条和2). 催化域二聚通过表面积约为980 Ų该二聚界面包含17个残基，主要属于每个单体的链8（S8）和螺旋5（H5）（图2). Arg223和Glu230的侧链之间分别建立了两个盐桥催化域。此外，11个氢键和范德瓦尔斯相互作用稳定了二聚体界面（图2，上面板）。LysM1和催化域是593 Ų该界面涉及H6附近的残留物催化域以及LysM1的H1和H2的残留物。21种残留物催化域接触14个LysM1结构域残基。其中六种相互作用由氢键介导（图2，下部面板）。我们分析了沉积在PDB中的所有NlpC/P60结构，并观察到三种具有PDB编码的NlpC/P60蛋白4马力（结构基因组学联合中心，未发表的工作），3pvq系列（结构基因组学联合中心，未发表的工作）和2个虚拟现实（徐）等。, 2009)似乎能够形成稳定的同二聚体。然而，它们都没有与P60_tth结构中观察到的相同的二聚体界面（未显示）。

图2 P60_tth的二聚接口。中心图显示了通过催化域和LysM1与催化域之间的相互作用进行的整体二聚反应。上图显示了两个催化域之间二聚化界面的放大视图，如中央图背面所示。所有参与二聚化接口的残基均由氢键形成，盐桥或疏水相互作用用棒子表示，并用单字母氨基酸代码标记。下部面板显示了LysM1和催化结构域之间相互作用界面的放大视图。

该结构可分为两部分：N端的锚定域和催化域C端（图1一). 锚定域由连接到催化域通过无法追踪的聚脯氨酸连接物（图1c（c）).

这个催化域由一个中心组成β-由五个反平行组成的薄板β-被四条线包围的线α-螺旋（图1c（c）和3一). 使用DALI公司服务器（Holm&Rosenström，2010)表明催化域匹配NlpC/P60蛋白家族的结构。最相似的结构是推测的细胞壁水解酶艰难梭菌（PDB条目4马力; 结构基因组学联合中心，未发表的工作）Z轴-得分为16.3，平方根偏差（r.m.s.d.）为2.7 奥在C上^α116个残基的原子，以及D类，L（左）-来自蜡样芽孢杆菌（PDB条目3时41分; 徐等。, 2010)，带有Z轴-得分为16.1，r.m.s.d.为1.9 奥在C上^α 111个残基的原子。这两个催化域与催化域第60_tth页。与YkfC结构的比较很有趣，因为它是用结合配体解决的：L（左）-阿拉-D类-Glu肽（Xu等。, 2010). 因此，我们可以使用YkfC模型来识别P60_tth的假定催化残基，并提出其可能的功能。

图3 P60_tth与YkfC催化结构域的结构比较蜡样芽孢杆菌(一)P60_tth与YkfC的主序列比对蜡样芽孢杆菌指出了这两种蛋白质的二级结构。红色球体表示催化三联体，而蓝色球体表示预计会参与形成催化位点的其他残留物。(b条)P60_tth（紫色）和蜡样芽孢杆菌YkfC（灰色；PDB条目3时41分). 股线和螺旋线编号与P60_tth对应。(c（c）)两种晶体结构中活性部位的比较显示为对视立体图。颜色代码与中的相同(b条).

P60_tth和YkfC结构的叠加表明，这两个催化域确实非常相似（图3b条和3c（c）). YkfC活性部位的Cys、His和His催化三联体在P60_tth中保守（图3c（c）). 此外，其侧链与L（左）-阿拉-D类-Glu产物要么是半保守的，要么是完全保守的（图3c（c）). 然而，我们注意到催化域与YkfC相比，P60_tth长一圈。因此，在P60_tth的H6和L（左）-阿拉-D类-两种结构叠加时YkfC中的Glu产物（图3c（c）). 这表明P60_tth的底物/产物可能与YkfC的底物/产物不同，和/或催化位点在结合其底物/产物之前需要一些结构重排。总的来说，与已知NlpC/P60结构的比较强烈表明，P60_tth也作为D类，L（左）-参与PGN水解的内肽酶。

尽管进行了大量的努力，但我们仍无法确定P60_tth蛋白在大肠杆菌，枯草杆菌或嗜热杆菌细胞或纯化的细胞壁。我们还试图评估在体外P60_tth对商用PGN片段和化学合成交联PGN的活性肽类从嗜热杆菌（支持信息）。这种缺乏活性的现象令人费解，但最近也有报道称，在建立NlpC/P60酶分析法方面也存在类似的困难（戈麦斯等。, 2014). 此外，不能排除的是，我们没有确定P60_tth活性的最佳条件和/或酶需要进行蛋白水解酶激活，如对结核分枝杆菌NlpC/P60蛋白RipA（Ruggiero等。, 2010; 赵等。, 2013).

锚定域由两个LysM域组成（图1一). 每个LysM域都采用βααβ折叠（图1c（c）和补充图S1）。LysM1和LysM2的一级序列非常相似，因为它们具有72%的序列同源性。LysM畴的叠加产生0.55的r.m.s.d 在42个残基的主链上。

这两个LysM域与PDB中沉积的LysM结构非常相似，特别是与枯草杆菌YkuD蛋白（Bielnicki等。, 2006; 勒科克等。, 2012)真菌Ecp6蛋白（Sánchez-Vallet）的LysM2结构域等。, 2013)和植物CERK1受体的LysM2结构域等。, 2012)（补充图S1）。主要区别在于AtCERK1和YkuD-LysM结构中H2和S2之间存在额外的螺旋转折；P60_tth LysM1的相应区域中仅存在一个回路（补充图S1）。

3.2. P60_tth是溶液中的同二聚体

为了研究溶液中是否存在同二聚体，我们首先使用尺寸排除色谱法（美国证券交易委员会）。这个色谱图表明全长蛋白（P60_tth）的表观分子量为58.5 kDa（图4一). 这相当于二聚体，因为单体的理论分子量为26.5 千帕。从晶体填充分析来看，似乎两个催化域之间建立了最强的相互作用。为了验证这一点，我们表达并纯化了该蛋白的截短版本，其中一个（P60_1LysM）或两个（P60 _cata）LysM结构域被删除。这两种蛋白质的预测分子量分别为21.4和18.3 kDa分别以表观分子量43.9和40.4洗脱 kDa分别对应于二聚体（图4一). 相反，一个结构体只拥有两个LysM域（P60_2LysM），即没有催化域，预测分子量为10.9 kDa，以11.2的表观质量洗脱 kDa，反映单体的存在（图4一). 总之，SEC实验表明，P60_tth是溶液中的同二聚体，催化结构域介导了二聚反应。

图4 测定溶液中P60_tth的低聚物状态和结构。(一)尺寸排除色谱法Superdex 75列上的P60_tth和截断突变。左侧面板显示校准曲线右边的面板显示了不同蛋白质的洗脱图谱。洗脱体积和计算的表观分子量显示在每个峰的上方。P60_tth是全长蛋白；在P60_cata中，只有催化域在场。在P60_1LysM中，N末端LysM域已被删除，在P60_2LysM催化域已被截断。(b条)根据SAXS数据计算的分子量。左边的面板显示了SAXS数据，右边的表格将根据一级序列计算的理论分子量与根据SAXS的数据确定的表观分子量进行了比较。(c（c）)溶液中P60_tth的建模。左图表示CRYSOL公司对右侧面板中显示的三种模型进行评估。曲线图清楚地表明，二聚体模型比单体模型更符合SAXS数据，并且珊瑚将连接体建模为二聚体模型进一步改进了拟合。

此外，还收集了全长和LysM截短形式蛋白质的小角度X射线散射（SAXS）数据（图4b条). 全长蛋白质的估计分子量为56.7 kDa，支持我们的观察，即P60_tth在溶液中形成稳定的二聚体。P60_1LysM和P60_cata截断突变体在溶液中也表现为二聚体。因此，SAXS实验证实了溶液中存在稳定的二聚体。

此外，我们结合我们的SAXS和晶体学数据来模拟完整的P60_tth二聚体。为此，我们从晶体结构不太完整的分子，即链B类叠加在链条上A类该二聚体模型（二聚体）、单体模型（单体）和二聚体模式，包括代表在晶体结构根据SAXS数据评估（二聚体+连接体+C-t）（图4c（c）).珊瑚（佩图霍夫等。, 2012)用于对缺失残基建模，并使用CRYSOL公司（斯维尔贡等。, 1995). 由此产生的配合（图4c（c）)显示出单体的明显改善(χ值97.34）转化为二聚体(χ值10.97）。当含有伪残基的二聚体模型时，拟合得到进一步改善(χ值7.29）用于评估（图4c（c）). 进一步精细化模型的拟合没有显著提高，从而证实溶液结构与晶体结构高度相似。

3.3. LysM结构域协同结合长碳水化合物

由于我们旨在了解LysM域如何锚定催化域在PGN上，我们试图获得共晶全长P60_tth的结构与配体结合，不幸的是没有成功。将甲壳素和PGN碳水化合物聚合物浸泡到P60_th晶体中的尝试也是徒劳的。或者，我们尝试共结晶只包含两个LysM结构域的结构体，P60_2LysM（图1一). 由于很难获得长MurNAc-GlcNAc链的PGN片段，我们尝试将P60_2LysM与GlcNAc聚合物共结晶。这种方法是相关的，因为我们之前已经证明细菌LysM结构域以相似的亲和力结合MurNAc-GlcNAc和GlcNAc聚合物（Wong等。, 2014). 使用此策略，我们成功地确定并解决了晶体结构与壳六糖结合的P60_2LysM（图5一和5b条).

图5 与壳聚糖结合的P60_2LysM的晶体结构。(一) 2F类o个−F类c（c）OMIT地图。地图在1处形成等高线σ用以下公式计算液位菲尼克斯汽车来自菲尼克斯在省略甲壳己糖分子后包装非对称单元。箭头表示α和β 阳极聚合物，其占用率计算为0.5。(b条)的组成非对称单元。这个非对称单元由五个LysM结构域和三个壳聚糖分子组成。(c（c）)甲壳己糖的识别。左边的面板显示了甲壳己糖是如何被对称性相关分子识别的。两个右面板是GlcNAc 6到GlcNAc3（上面板）和GlcNAc-3到GlcNAc 1（下面板）识别的放大视图。以海蓝或板岩蓝表示的残留物分别来自LysM1和LysM2。虚线表示氢键。

结构求解为1.75 分辨率（表1). P60_2LysM的三个分子（单体1-3）存在于非对称单元（图5b条). 单体1和2是相同的，而单体3的LysM2结构域没有观察到电子密度。然而，所有可以追踪到的LysM结构域都与甲壳己糖分子结合（图5b条).

LysM结合裂缝与描述的植物CERK1受体的晶体结构相似（Liu等。, 2012)和真菌Ecp6蛋白（Sánchez-Valet等。, 2013)以及细菌AtlA autolysin（Mesnage）的NMR溶液结构等。, 2014)和真菌CVNH-LysM凝集素（Koharudin等。, 2011). 植物几丁质酶A（Ohnuma等。, 2008). 装订袋由S1和H1之间的回路和H2和S2之间的环路分隔。单体1和2以相同的方式结合甲壳己糖，但与单体3不同。对于单体1和2，碳水化合物与对称相关分子诱导分子间二聚（图5c（c）).

单体1的LysM1A类（图5c（c）)主要接触GlcNAc 6至GlcNAc3。Gln53的侧链接触GlcNAc 6的O3，而Gly24和Leu52的主链接触其N个-乙酰基。此外，Val21的侧链调节疏水相互作用使用N个-GlcNAc 6的乙酰基。Phe50的主链识别GlcNAc 5的O6。Phe50还介导与GlcNAc 4的氢键通过由Leu27主链稳定的水分子。此外，Phe50侧链介导疏水相互作用使用N个-GlcNAc 4的乙酰基，也被Tyr28的主链识别。最后，Thr26介导氢键通过GlcNAc 3的O4。

单体1的LysM1和LysM2实现了对GlcNAc 3、GlcNAc 2和GlcNAc 1的识别A类对称性相关单体1的LysM2B类。Val69的侧链调节疏水相互作用使用N个-GlcNAc3的乙酰基，而Ile100的主链和Glu99的羧基与GlcNAc 2的O6形成氢键。Pro98和Leu75的主链稳定一个水分子，该水分子与GlcNAc 1的O3形成氢键，而Leu75和Phe76的主链识别GlcNAc1的O7N个-乙酰基。Thr74结合GlcNAc 1的O1基团。最后，单体1的LysM1和LysM2中的Arg32和Arg80A类分别识别GlcNAc 2通过两个水介导的氢键。

总之，我们观察到单体1的LysM1A类主要接触最后四个GlcNAc残基（GlcNAc6到GlcNAc-3），而单体1的LysM2B类主要接触前三个GlcNAc残基（GlcNAc3到GlcNAc-1）；如果存在更长的几丁质聚合物，则该LysM2结构域也可能与第四个GlcNAc残基相互作用。这种分子间二聚化模式与在晶体结构与几丁质结合的真菌Ecp6（图6; 桑切兹瓦莱特等。, 2013). 在Ecp6结构中，四个GlcNAc残基夹在两个链内LysM结构域之间。最近，这种三明治结合模式也被提出用于参与水稻免疫反应的CERK1–OsCEBiP复合物对甲壳素的识别（Hayafune等。, 2014). 我们的结构提供了一种替代的结合模式，可以解释LysM受体如何二聚并在识别长甲壳素低聚物时发出信号。

图6 细菌和真菌LysM结构域二聚模式的比较。(一)真菌Ecp6蛋白中几丁质结合的分子内二聚化模式（PDB入口4b8伏; 桑切兹瓦莱特等。, 2013). 参与碳水化合物结合的LysM1和LysM3分别为浅绿色和深绿色。(b条)细菌P60_2LysM蛋白中几丁质结合的分子间二聚模式；颜色代码与图5中的相同.

非常有趣的是，壳己糖被来自不同单体的两个LysM结构域识别，这一事实支持了对不同门（Wong等。, 2014; Hayafune公司等。, 2014; 线路接口单元等。, 2012). 我们和其他人最近提出，多个含有LysM的蛋白质中的LysM结构域协同作用，增强这些蛋白质与长链的结合碳水化合物（王）等。, 2014; 网格等。, 2014). 然而，我们无法解释这是因为每个LysM结构域都可以结合甲壳素分子，还是因为几个LysM域可以结合同一个甲壳质分子。与我们晶体结构，我们现在声称这两个事件都发生了，因为非对称单元结合甲壳六糖分子，该分子也可能被来自不同单体的LysM结构域结合。

LysM域的二元化碳水化合物也被证明对参与植物防御和共生机制的LysM受体非常重要（Hayafune等。, 2014; 线路接口单元等。, 2012; 马德森等。, 2011)，并提出了二聚化模型。我们的晶体结构现在为这些观察提供了结构基础，因此有助于设计在这一研究领域非常重要的受体-异构化模型。

3.4. 不同门LysM中几丁质结合位点的比较

尽管甲壳己糖分子在单体3的LysM1结构域中占据相同的结合囊，但观察到第二种结合类型（图7一). 该LysM1结构域将GlcNAc 5识别为GlcNAc 1，而GlcNAc 6不接触。Gln53侧链与GlcNAc 5和GlcNAc4结合，Gly24和Leu52主链与N个-GlcNAc 4的乙酰基。Phe50和Leu52的主链介导与GlcNAc 3的O6基团的相互作用，而Leu27和Phe50的主链与GlcNAc 2的O3结合。最后，Tyr28的主链与N个-GlcNAc 2的乙酰基，而侧链与GlcNAc1堆叠。

图7 在不对称单元中观察到第二种结合模式。(一)甲壳己糖的相互作用如单体3所示非对称单元。(b条)P60_2LysM和AtCERK1的LysM结构域中几丁质结合位点的比较。在我们的P60_2LysM-甲壳己糖单体1和3中观察到的甲壳素分子的重叠晶体结构AtCERK1的LysM2域（绿色）和几丁质戊糖晶体结构。来自单体1和3的甲壳素分子分别显示为粉红色和黄色，而来自AtCERK1的甲壳质分子显示为紫色。

通过比较在LysM1结构域（单体1）中观察到的甲壳己糖分子的两个不同位置A类和3）P60_tth与在植物AtCERK1受体LysM2结构域中观察到的几丁质五糖分子的位置晶体结构（刘）等。, 2012)，我们发现GlcNAc 6位于单体1的LysM结合位点A类（图6)对应于单体3中的GlcNAc 4位置和AtCERK1 LysM2中的Glc NAc 3位置（图5c（c）和7一). 因此，很容易提出LysM结构域可能能够沿着碳水化合物“滑动”。

3.5. LysM结合位点的突变影响壳聚糖离解常数

为了进一步验证在晶体结构由于具有生物学相关性，我们使用丙氨酸扫描方法来突变结合位点中的残基。随后，微尺度热泳（MST；Seidel等。, 2013)用于测量溶液中甲壳六糖的结合亲和力，因为之前已经证明它适合测量这种相互作用（Wong等。, 2014; 毛拉农等。, 2014; 布罗格哈默等。, 2012).

我们比较了全长P60_tth与两种突变蛋白P60_th_LysM1_mut（Y28A、R32A、F50A、Q53A）和P60_th_LysM2_mut（F76A、R80A、E99A）的结合能力，其中残基参与碳水化合物结合通过侧链相互作用突变为Ala（补充图S2）。全长P60_tth蛋白具有明显的K（K）_d日第页，共90页 ± 19.8 µM（M）用于壳己糖（补充图S2）。P60_tth_LysM1_mut和P60_tth_LysM2_mut具有类似的K（K）_d日值320.7 ± 112.3和292.1±86.5 µM（M）分别约为野生型蛋白质的三倍（补充图S2）。看来，碳水化合物和蛋白质主链之间的大量相互作用可能足以保持结合。虽然这些突变并没有消除蛋白质与碳水化合物的相互作用，但结合亲和力的降低有助于验证甲壳己糖结合位点的生物学相关性晶体结构。考虑到细菌内肽酶LysM结构域中确定的结合位点与植物和真菌LysM（Sánchez-Valet）结构域中观察到的结合位点的相似性等。, 2013; 线路接口单元等。, 2012; Ohnuma公司等。, 2008; 科哈拉丁等。, 2011)，我们得出结论，LysM–碳水化合物结合位点在门之间是保守的。

3.6. 多个LysM域是灵活的

我们还成功地解决了晶体结构不含任何配体的P60_2LysM（表1). 通过将该结构中的LysM结构域与全长P60_tth和P60_2LysM–壳聚糖结构中的LysM结构区进行比较，我们观察到碳水化合物的结合仅触发结合囊中的微小结构重排。只有Gln53和Arg32的侧链在碳水化合物结合时重新定向（未显示）。

然而，两个LysM结构域的相对位置在束缚态与非束缚态之间存在显著差异（图8). 连接体似乎允许LysM结构域之间具有一定的灵活性，但我们不能肯定地声称这种运动是由碳水化合物结合触发的，因为这种运动可能是由于晶体堆积引起的。尽管如此，我们最近通过SAXS实验表明枯草杆菌CwlS蛋白在溶液中是柔性的（Wong等。, 2014). 我们的结构数据加强了这一观察，并清楚地表明，P60_tth中的两个LysM结构域是柔性的，尽管被一个只有四个氨基酸的短连接体分隔开。

图8 比较三种晶体结构中LysM2畴的相对位置。该图显示，两个LysM域之间的链接器赋予LysM领域之间的灵活性。比较了全长P60_th（灰色）、与壳聚糖（绿色）结合的P60_2LysM和不含配体（蓝色）的P60_2 LysM的LysM2结构域的位置。

3.7. P60_th与肽聚糖相互作用的模型

虽然我们无法获得晶体结构在与PGN片段结合的P60_tth中，全长P60_th和壳己糖结合P60_2LysM的结构使我们能够提出一个模型，表明具有多个LysM结构域的NlpC/P60蛋白如何识别PGN。

首先，我们叠加了一个MurNAc肽（Hoyland等。, 2014)从我们的P60_2LysM–壳六糖结构到壳六糖的GlcNAc 6、GlcNAc-4和GlcNAc2。使用最少的额外建模（仅旋转L（左）-Ala和MurNAc），我们可以在不诱导任何空间位阻含有LysM结合位点的残基（图9一). 这表明MurNAc-GlcNAc寡糖可能以与GlcNAc寡糖相似的方式相互作用，并且PGN的肽部分可能根本无法被LysM结构域中的残基识别。然而，我们并不排除PGN肽部分可能触发的可能性空间位阻在LysM凹槽中粘合时。Mesnage及其同事在最近的一项研究中证实了这一假设，他们提出PGN的肽部分降低了粪肠球菌PGN的AtlA单个LysM域（Mesnage等。, 2014).

图9 提出了基于P60_tth的PGN识别模型。(一)描述LysM域如何与PGN片段相互作用的PGN识别模型。每个MurNAc与一个肽相连[L（左）-阿拉-γ-D类-格林-L（左）-赖氨酸-(D类-Asn）]；MurNAc肽分子是从L（左），D类-羧肽酶晶体结构（PDB条目4牛; 霍伊兰等。, 2014). (b条)在三维模型中观察到交联PGN链和肽茎长度之间的距离金黄色葡萄球菌Meroueh提出的PGN等。(2006). P60_tth全长中两个LysM结合位点之间的距离晶体结构在P60催化域的两个活性位（红色）入口之间也有指示。(c（c）)解释P60_th同源二聚体如何将蛋白质锚定在PGN上的方案。PGN GlcNAc-MurNAc链由六角体和嗜热杆菌由三个氨基酸编码表示；氨基酸组成已在前面描述过（昆特拉等。, 1995). `Cys’代表催化半胱氨酸，红色箭头表示肽茎中假定的裂解位点。

两个LysM结构域的结合位点之间的距离约为35 有趣的是，在Meroueh提出的PGN三维模型中，与PGN肽链交联的MurNAc-GlcNAc链之间的距离相同等。(2006). 此外，两个假定的催化半胱氨酸之间的距离催化域大约27岁 嗯，而肽茎的长度约为25 PGN模型中的φ（图9b条). 这些简单的距离观察使我们提出了一个相互作用模型，其中单个LysM结构域与PGN相反的碳水化合物链结合，从而使催化结构域的有利位置能够裂解肽茎（图9c（c）). 鉴于P60_tth表现为同二聚体，并假设蛋白质裂解第二和第三氨基酸之间的肽臂，我们假设这两个催化结构域可能同时裂解两个键。这可能会带来优势，因为PGN重塑期间释放的PGN碎片可以回收（Reith&Mayer，2011）; 布德劳等。, 2012; 约翰逊等。, 2013). P60_th同源二聚体可释放两个GlcNac-MurNac肽类在每个水解步骤而不是一个，因此提高了PGN的回收效率。