2.1、。蛋白质表达和纯化

使用谷氨酰胺合成酶系统（Casasnovas等。, 1997). 这些构建物包含ICAM-5 cDNA，编码指示的IgSF结构域，随后是凝血酶识别序列、剪接信号和人类IgG1 Fc区域的基因组DNA。

通过多步骤纯化ICAM-5 D1-D4（IC5-4D）和D1-D5（IC5-5D）片段色谱法。之后亲和层析使用蛋白质A Sepharose（GE），将洗脱的ICAM-5-Fc融合蛋白在30°C下凝血酶处理过夜。Fc片段用蛋白A Sepharose去除，ICAM-5片段通过尺寸排除色谱法在Superdex 200色谱柱（GE）上 米M（M）HEPES pH值7.5100 米M（M）氯化钠。IC5-4D和IC5-5D片段的最终纯化通过阴离子交换。蛋白质浓缩到20 毫克 毫升⁻¹用于结晶试验。

2.2. 结晶和衍射数据收集

使用含有10%PEG 4000的结晶溶液和两种缓冲液（100 米M（M）Tris–HCl pH值8.5P（P）4₃22晶型和100 米M（M）乙酸钠pH 5.6R（右）3晶型；这些晶体衍射到低分辨率（表1). 此外，一些比P（P）4₃22种形式出现在用Tris–HCl缓冲液制备的结晶滴中。这些晶体随后在相同的结晶条件下通过微进给进行复制；他们属于空间组 P（P）2₁衍射至～2.5 分辨率（表1). 在ESRF的BM16和ID14.2光束线上收集衍射数据之前，用25%乙二醇对IC5-4D晶体进行结晶溶液透析并闪蒸冷却。衍射数据用XDS公司（卡布施，2010年)和缩放比例标量来自中央处理器4套房（优胜者等。, 2011). 数据统计见表1.

使用含有10%PEG 4000、100的溶液结晶IC5-5D蛋白 米M（M）pH值7.0的二甲氨基甲酸缓冲液和10%的1,3-丁二醇或1,4-丁二醇。用含有25%乙二醇的结晶溶液对晶体进行低温保护，并进行闪蒸冷却以收集数据。IC5-5D晶体衍射到非常低的分辨率（～10 Å).

2.3.结构确定和精细化

IC5-4D结构由单斜晶系确定P（P）2₁使用多重晶体同晶置换和分子置换（MR）方法。通过在K中浸泡制备衍生晶体₂Pt（中国）₄和溴化钠。重原子位置由不同的Patterson图确定，并用MLPHARE公司来自中央处理器4套房（优胜者等。, 2011)这给了0.376的低评分。或者，我们对ICAM-2（D1；PDB条目）的单个IgSF域进行MR1zxq个; 卡萨斯诺瓦等。, 1997)和ICAM-1（D2、D3和D4；PDB条目国际商会和1第53页; 卡萨斯诺瓦等。, 1998; 杨等。, 2004). 使用以下方法获得了具有四个串联域的单个MR解相位器在里面中央处理器4.MR和重原子相结合使用西格玛在里面中央处理器4来获得电子密度图。刚体精炼对于单个区域，笛卡尔模拟退火最初应用于结构精炼使用菲尼克斯（亚当斯等。, 2010)生成了高质量的电子密度图，用于手动重建结构库特（埃姆斯利和考坦，2004年). 后面的步骤包括精炼具有菲尼克斯，应用非多面体孪生法律小时, −k个, −我，这减少了细化统计显著（表1).

IC5-4D结构以低分辨率测定P（P）4₃22和R（右）使用高分辨率MR测量3个晶体P（P）2₁结构，有利于低分辨率结构精炼（布鲁格等。, 2009). 此外，我们在菲尼克斯定义以改进精炼低分辨率（头部等。, 2012). 刚体循环后精细化，我们使用MLHL目标函数应用扭角动力学模拟退火，然后使用共轭梯度最小化循环，使用二级结构和Ramachandran图约束进行坐标精细化；采用约束各向同性程序细化原子位移。这些精炼循环与手动构建的迭代轮次相结合库特（Emsley和Cowtan，2004年). 为了改进低分辨率的电子密度图，我们使用了热B类-因子锐化，增加了侧链构象的细节（Brunger等。, 2009). 这个P（P）4₃22晶体结构在不对称单元；它的精炼包括非晶体对称性限制。分析R（右）3晶体衍射数据phenix.x分类识别出一个merohedral的基于L（左）-测试（亚当斯等。, 2010)，已与确认SFCHECK（SF检查）中的程序中央处理器4.估计双胞胎分数为0.12（Britton分析）或0.14(H（H）-测试）。这个merohedral的双操作员k个,小时, −我已应用于精炼的R（右）3晶体结构，这显著改善了流程。细化统计信息如表1所示.

坐标和结构因子已作为条目保存在蛋白质数据库中4个oi9(P（P）2₁),4年一遇(P（P）4₃22）和4伊布(R（右）3).

2.4. ICAM-5和ICAM-1 D1–D5片段的建模和分子间界面分析

我们基于ICAM-1 D3-D5结构（PDB入口）对ICAM-5 D4-D5域间结和D5进行了建模2盎司4; 陈等。, 2007)使用奇梅拉/建模师（佩特森等。, 2004). IC5-5D模型结合了IC5-4D结构、D4-D5畴间结模型和D5模型。ICAM-1 D1–D5模型结合了D1–D2（PDB条目1个1)和D3–D5（PDB条目2盎司4)基于IC5-4D晶体结构的结构。

晶体中分子间接触的埋置表面和残留物用国际学生成绩评估服务器(https://www.ebi.ac.uk/msd-srv/port_int/pistart.html).

3.1. 这个晶体结构ICAM-5（IC5-4D）的四个最N端结构域

IC5-4D片段是在D2–D3（～130°畴间角）和D3–D4（～140°畴内角）处两个急弯导致的弯曲分子（图1一). ICAM-5 D1-D2模块在结构上与ICAM-1的关系比与ICAM-2的关系更密切，平方根偏差（r.m.s.d.）为1.75 对于178个残留物和2.7个 分别代表174个残基。ICAM-5 D2序列（66%同一性）和结构与ICAM-1 D2相似，但C′E回路除外（补充图S1一¹). 在ICAM-5中，D1的底部接触D2顶部的C′E和FG回路（图1b条，补充图S1一)，而在ICAM-1和ICAM-2中，D1仅接触D2-FG回路（补充图S1一). D2-FG回路中的His176和Leu173分别接触D1中的Phe13和Phe86（图1b条). D1和D2之间也存在一些亲水性相互作用，这些作用涉及几个Arg残基。D1和D2富含Arg，共有30个暴露在溶剂中的Arg残留物（图2)，负责这些域的基本pH值。ICAM-5具有相对较长的疏水性N末端（图2). 有两个N链接聚糖在D1中（图1一和2)；如其他ICAM所述，附着在Asn23上的聚糖将Trp51与溶剂隔离（Jiménez等。, 2005). N链接聚糖在ICAM-5中，D2也存在于ICAM-1中：它们位于域的底部附近（图1一和2).

图1 ICAM-5四个最N端结构域的晶体结构。(一)单斜带图P（P）21蓝色（D1）、青色（D2）、橙色（D3）和红色（D4）的IgSF结构域。显示的两个视图旋转了90°。N-连接糖基化位点的天冬酰胺侧链显示为棒状碳水化合物具有明确结构的被描绘为碳为黄色、氮为蓝色、氧为红色的球体。半胱氨酸和二硫键以绿色显示。这个β-链、N端和C端被标记。(b条)D1–D2、D2–D3和D3–D4域间连接的特写视图。畴间界面上的残留物如棒状图所示，氧为红色，氮为蓝色。亲水相互作用显示为虚线。

图2 ICAM-5、ICAM-1和ICAM-2的序列比对。D1–D4片段显示了基于结构的序列比对，D5片段显示了序列比对。单斜晶系的ICAM-5 D1-D2和D3-D4模块P（P）21 晶体结构在结构上与ICAM-1和ICAM-2的同源模块对齐。每个域的第一个残基被标记并β-序列上方标记有股线。半胱氨酸以绿色突出显示，糖基化Asn以黄色突出显示；D1–D2中的碱性残基为青色，D3–D5中的酸性残基为红色。

ICAM-5 D3-D4模块在结构上与ICAM-1非常相似（均方根误差为1.77 奥代表178个残留物；补充图S1b条)与它们的序列相似性相关（～55%）。由于ICAM-3 D3-D4结构域的序列与ICAM-5的序列更为相似（～66%），因此这些结构域的结构也必须相似。D3–D4模块急剧弯曲；D3接触突出的D4 FG回路（图1)如ICAM-1结构（补充图S1c（c）). D3和D4分别属于IgSF结构域的I1和I2亚群，D1和D2也是如此。D1和D3各有一个Dβ-D2和D4中缺少的绞线（图2). 与LFA-1绑定D1相比，D3还具有短C′β-绞线（图2). 在D3CC′环，ICAM-5含有天冬氨酸残基（Asp237），该残基也在ICAM-1中保存（Asp229；图2). 该残基参与ICAM-1（Diamond）对Mac-1整合素的识别等。, 1991). 尽管D3 CC′环序列和构象在两种ICAM分子中几乎相同（图2)，ICAM-5附近有两个聚糖与Asn239和Asn272相连，可能阻止整合素与暴露的Asp237结合（图1一). D4C′边在ICAM-1中也是唯一的，因为它具有高度的结构灵活性并参与ICAM-1的二聚化（Yang等。, 2004; 陈等。, 2007). ICAM-5中的C′E环路结构不同（图2)这里报告的结构在该地区没有表现出灵活性。D4C′边涉及如下所述的几个晶体接触，但其构象保持不变。

迄今为止确定的ICAM蛋白晶体结构缺乏D2与D3的连接。IC5-4D结构显示，D2在D3中向短FG回路倾斜（图1一)其顶端有两个甘氨酸（图1b条). D3 N端（Ser194–Pro197）与D3相切（图1一)；多肽在Pro197处急剧扭结，并继续平行于D4向β-A股（图1一). D2 A′β-钢绞线垂直于D3主轴，因此Trp100位于D3-FG回路上（图1b条). 最后一个D2残基的侧链Phe193由D3-FG环和D2残基Trp100和Pro102封闭。D2–D3模块的倾斜构造必须通过在D3BC回路尖端暴露笨重的Phe224来实现（图1b条). Phe224芳香链从D3BC环中伸出并与D2 Arg158接触，后者与D3 Asp249形成盐桥。D2–D3交界处的所有残基在ICAM-1中都是保守的（图2)和ICAM-3（未显示），表明该模块在ICAM亚家族中的保守倾斜布置。

3.2. 域间移动性

三种晶体形式的比较表明，畴间界面具有一定的灵活性（图3)，这可能是促进细胞间相互作用所必需的。基于D4的叠加显示IC5-4D分子朝单一方向移动（图3一). 最大运动之间的分歧最大R（右）3和P（P）4₃22个结构（有效值s.d.为2.7 λ）为～16°。总体P（P）2₁尽管如此，结构与R（右）3晶体结构（5°）比P（P）4₃22结构（11°），尽管在相同条件下制备了四方和单斜晶体。这可能表明畴间运动更多地取决于晶体接触，而不是结晶条件。两个域模块中的域间迁移率相对相似（D1–D2为12°，D2–D3为10°，D3–D4为15°；图3b条). D1–D2模块构象在三种结构中是不同的，而D2–D3和D3–D4模块在P（P）2₁和R（右）3个结构（图3b条).

图3 ICAM-5的域间灵活性。IC5-4D结构在三个空间组中的叠加：R（右）3、橙色；P（P）21，绿色；P（P）4322，淡蓝色（分子A类)和深蓝色（分子B类). 基于D4的IC5-4D结构的叠加(一)或两个域模块的叠加(b条).

3.3. ICAM-5和ICAM-1的D1-D5片段的总体结构

ICAM-5 D1–D5片段参与同型相互作用（Tian，Nyman等。, 2000). IC5-5D晶体的低分辨率衍射仍然受到阻碍结构确定。我们使用D5的同源建模来生成D1–D5片段的完整结构（补充图S2一). 建模基于ICAM-1 D3-D5结构（Chen等。, 2007). ICAM-1和ICAM-5的D5结构域非常相似（49%序列相同），D4-D5连接保留参与域间相互作用的ICAM-1残基（补充图S2b条). 我们基于IC5-4D结构对ICAM-1 D2–D3连接进行了类似建模，该结构提供了ICAM-1细胞外部分的完整视图（补充图S2一，绿色）。ICAM-1和ICAM-5的五个细胞外N末端结构域的整体形状保持不变（图4). 由于D2–D3和D3–D4模块的弯曲构象，分子弯曲。D5在两种分子中均未严重糖基化（图2). 在ICAM-1中聚糖在D2和D3顶部累积，而在ICAM-5中聚糖从D1到D5分布更均匀（补充图S2a）。D3的CFG表面在ICAM-5中严重糖基化（图1一).

图4 ICAM-5五个N端结构域片段的静电表面电位(一)和ICAM-1(b条). 曲面表示以两个方向显示。D1中的中央LFA-1整合素结合残基用箭头标记。

ICAM-1和ICAM-5的D1-D5片段之间的一个主要区别是它们的静电势。与其他ICAM相比，ICAM-5具有不寻常的电荷分布，D1和D2为高碱性（pI～11），D3-D5为酸性（pI￣4）。ICAM-1在N端和C端模块之间没有显示出这种显著差异，而IgSF结构域在D1、D2、D3、D4和D5的pI值分别为7.8、6.1、4.0、9.0和5.1。因此，所有五个ICAM-1和ICAM-5结构域的结构具有非常明显的电荷分布（图4). ICAM-5 D1和D2有较大的正密度斑块（图4)由于精氨酸的大量存在（图2)在D1中围绕整合素结合Glu37，在CFG中发现β-板材和板材β-链D。其中一些精氨酸与LFA-1Ⅰ结构域结合（张等。2008年). D1的尖端也是基本的（图4)，在BC、DE和FG回路中有Arg残留物（图2). ICAM-5 D3-D5中普遍存在酸性残留物（图4)，并从D3分散到D5顶部，富集在分子的一侧。ICAM-1的Mac-1整合素结合D3也有带负电荷的斑块，但ICAM-1中的D4酸性低于ICAM-5（图4).

3.4. 晶体中基于静电的同型ICAM-5相互作用

碱性N末端D1-D2和酸性D3-D5（Tian，Nyman等。, 2000). 我们的IC5-4D晶体结构显示了涉及带电残基的对称相关分子的N端和C端部分之间的几种类型的相互作用（图5，补充表S1）。根据埋表面积（BSA），这些相互作用中最稳定的是P（P）4₃22晶体结构两个对称相关IC5-4D分子之间的（界面A）（图5一). 埋入～830的N端和C端双域模块之间的相互作用 Ų包括IgSF结构域中的带电残基（补充表S1）。分子遵循头到尾的平行排列（补充图S3一). D1 CFG表面上的带电区域，包括整合素结合Glu37，与带负电荷的D3相互作用（图5一，补充图S3一). 这个国际学生成绩评估服务器识别出相互作用分子之间的六个盐桥，其中三个位于D1/D3界面，四个位于D2/D4界面（图5一，补充表S1）；带正电的D1–D2区域被带负电的D3–D4区域完全掩埋（补充图S3一). 这个P（P）2₁和R（右）3晶体结构还显示了分子间从头到尾的接触（界面B）和IC5-4D分子的平行排列（图5b条，补充图S3b条). 这些触点从两个对称相关分子连接D1和D4，并埋入～600 Ų表面积的P（P）2₁晶体接触。界面B包括D1和D4中分别带正电荷和负电荷的表面，以及四个盐桥（补充表1，补充图S3b条).

图5 晶体中IC5-4D的N端和C端模块之间基于静电的分子间相互作用。如图1所示着色的相互作用域的带状图（另请参见补充图S3）。β-链和相互作用的带电残基，如补充表S1所示，被标记。盐桥和氢键显示为虚线。(一)联系人P（P）4322晶体结构（接口A）。(b条)联系人P（P）21晶体（界面B），也在R（右）3晶体结构。(c（c）)联系人P（P）21 晶体结构（接口C）。与Asn282相连的聚糖呈球形，碳呈黄色，氮呈蓝色，氧呈红色。

在P（P）2₁ 晶体结构，我们确定了两种类似的对称相关ICAM-5分子的反平行排列，它们在N端和C端部分之间有接触（补充图S3c（c）和S3d日). 一个IC5-4D分子的头部（D1-D2）和尾部（D3-D4）接触到两个不同的对称性相关伙伴；每个触点埋设500–600 Ų表面积和包括所有四个相互作用域中的带电残基。第一个触点，具有最大的接口（600 ŲBSA），由D1–D2与D3和D4上半部结合形成（界面C；图5c（c）)；聚糖贡献了50%的埋藏表面。三种聚糖碳水化合物连接到D3中Asn285的结构在结构中得到了很好的定义，并与D1底部建立了一个扩展的相互作用网络（图5c（c），补充表S1）。此外，D3–D4中的三个酸性残基与D1–D2精氨酸形成盐桥。第二种晶体接触埋藏了较小的表面积（500 Ų)并且不包括聚糖（接口D；补充图S3d日)；一个IC5-4D分子还与两个对称相关分子相互作用，这两个分子掩埋了大约1000个 Ų它的表面。D1–D2与D4接触并涉及带电残留物（补充表S1）。

3.5. 介导同型相互作用的ICAM-5表面

ICAM-5晶体中的分子间接触有助于识别亲同粘附的表面（Tian，Nyman等。, 2000). 界面A和C由D1-D2以两种不同的晶体形式与D3-D4结合形成，相互作用的分子采用不同的取向（图5). 在接口B中，D1与D4在P（P）2₁和R（右）3种晶体结构。我们在这些界面中发现了共享的残留物（图6). 参与LFA-1整合素结合的D1区域，围绕β-链C和Glu37（张等。2008年)，部分埋在几个接口中（图5和6). ICAM-5 I域结合区域包括CFG中的残基β-板材和域的CD边缘（张等。2008年). 界面A和C主要包括CFG中的残留物β-而界面B也覆盖了D1的CD边缘（图5). 大多数与D3–D4结合的D1残基从CFG的顶部延伸至底部β-板材（图6). 在D2顶部，D1附近，域C′边缘的Arg119和Arg144与界面A和C中的D3–D4接触（图5和6).

图6 介导同型相互作用的ICAM-5表面。D1–D2（左）和D3–D4（右）模块的带状图，在几个晶体中涉及分子间接触的残留物显示为带有灰色表面的棒状物。这些残留物埋藏在图5中三个界面中的至少两个界面中，是这三种晶体结构的代表。带有埋藏残基的结构域被标记，LFA-1整合素结合残基Glu37也被标记。

几个晶体中与其他分子结合的少量D3残基分散在D3结构域和介导相互作用的D4表面的同一侧（图6). D4表面覆盖了CFG的上半部分β-表。D1和D4的相互作用表面比D2和D3宽，还包括CFGβ-表，通常涉及IgSF成员的细胞粘附相互作用（Wang，2002). D1和D4中的大相互作用表面表明它们在ICAM-5同型相互作用中起着重要作用。