Aging reduces calreticulin expression and alters spontaneous calcium signals in astrocytic endfeet of the mouse dorsolateral striatum

doi:10.1038/s41514-023-00102-8

.2023年3月31日；9(1):5.

doi:10.1038/s41514-023-00102-8。

衰老降低小鼠背外侧纹状体星形细胞终末钙网蛋白表达并改变自发钙信号

萨拉·M·萨拉特¹, 泰勒·E·亨廷顿^1 2, 普尼·巴格尔^三, 拉胡尔·斯里尼瓦桑^4 5

附属公司

¹德克萨斯州农工大学医学院神经科学与实验治疗学系，美国德克萨斯州布莱恩市河滨普奎8447号，邮编77807。
²德克萨斯州农工大学神经科学研究所（TAMIN），德克萨斯州农机大学，德克萨斯州大学城，77843，美国。
^三内布拉斯加州大学医学中心细胞和综合生理学系，美国东北奥马哈，68198。
⁴德克萨斯州农工大学医学院神经科学与实验治疗学系，美国德克萨斯州布莱恩市河滨普奎8447号，邮编77807。rahul@tamu.edu。
⁵德克萨斯州农工大学神经科学研究所（TAMIN），德克萨斯州农机大学，德克萨斯州大学城，77843，美国。rahul@tamu.edu。

PMID： 37002232
预防性维修识别码：项目经理10066375
内政部： 10.1038/s41514-023-00102-8

衰老降低小鼠背外侧纹状体星形细胞终末钙网蛋白表达并改变自发钙信号

萨拉·M·萨拉特等。 NPJ老化. 2023.

.2023年3月31日；9(1):5.

doi:10.1038/s41514-023-00102-8。

作者

萨拉·M·萨拉特¹, 泰勒·E·亨廷顿^1 2, 普尼·巴格尔^三, 拉胡尔·斯里尼瓦桑^4 5

附属公司

¹德克萨斯农工大学医学院神经科学与实验治疗系，8447 Riverside Pkwy，Bryan，TX，77807，USA。
²得克萨斯农工大学神经科学研究所（TAMIN），得克萨斯农工大学，德克萨斯州大学站，美国，77843。
^三内布拉斯加州大学医学中心细胞和综合生理学系，美国东北奥马哈，68198。
⁴德克萨斯州农工大学医学院神经科学与实验治疗学系，美国德克萨斯州布莱恩市河滨普奎8447号，邮编77807。rahul@tamu.edu。
⁵德克萨斯州农工大学神经科学研究所（TAMIN），德克萨斯州农机大学，德克萨斯州大学城，77843，美国。rahul@tamu.edu。

PMID： 37002232
预防性维修识别码：项目经理10066375
内政部： 10.1038/s41514-023-00102-8

摘要

衰老相关的血脑屏障（BBB）和神经血管单元（NVU）损伤增加了神经退行性变的风险。在参与BBB和NVU功能的各种细胞中，星形细胞终末的钙信号对维持BBB和NVU的完整性至关重要。为了评估老化是否与背外侧纹状体（DLS）星形细胞终末的钙信号改变有关，我们在年轻（3-4个月）、中年（12-15个月）和老化（20-30个月）小鼠的DLS星形细胞中表达GCaMP6f。与年轻小鼠的末端足相比，衰老小鼠的DLS末端足表现出钙网蛋白表达降低，自发膜相关和线粒体钙信号改变。虽然幼年小鼠需要细胞外和内质网钙源来获得终足信号，但中年和老年小鼠表现出对内质网钙质的严重依赖。因此，星形细胞终末在整个生命周期中显示出钙缓冲和来源的显著变化，这对于理解衰老损害BBB和NVU的机制非常重要。

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作者声明没有相互竞争的利益。

数字

**图1。衰老改变自发钙²⁺事件动力学。**
一将AAV-GfaABC1D-Lck-GCaMP6f注射到年轻、中年和衰老小鼠的DLS中。两周后，脑室内注射番茄凝集素（TL），收集纹状体脑切片，记录和测量末梢钙²⁺DLS中的事件。b条DLS中紧邻TL标记血管（红色）表达lck-GCaMP6f（绿色）的年轻、中年和衰老星形胶质细胞端足的代表性时间堆栈，比例尺=15μm。白色箭头指向端脚Ca的区域²⁺事件已启动。**c（c）**端脚Ca的痕迹示例²⁺记录了年轻、中年和衰老小鼠的事件。d日年轻、中年和老龄小鼠ROI数量（左）和面积（右）的比较。**e（电子）**对单个血管的ROI进行平均，以比较自发Ca²⁺事件发生频率(左边)，振幅(*中间的*)、和持续时间(*正确的*). 对于幼鼠：n个============================================================================来自7只小鼠、中年小鼠的96个ROI和36条血管：n个============================================================================来自4只小鼠的46个ROI和16条血管，对于衰老小鼠：n个============================================================================来自7只小鼠的57个ROI和26条血管。误差条为S.E.M和所有第页这些值基于曼希特尼试验。

**图2。老化增加了钙的膨胀速度²⁺星形胶质细胞末端的波。**
一扩张端脚Ca的代表性t型堆叠²⁺年轻人DLS中的波动(顶部)，中年(*中间的*)、和老化(底部)展示的是老鼠。t-stack右侧的面板显示了端脚Ca的典型伪彩色延时图像²⁺波浪。延时图像中的白色虚线勾勒出扩展端脚Ca所获得的最大面积²⁺波浪，比例尺=15μm。b条显示速度的条形图(左边)，行驶距离(*中间的*)、和面积(*正确的*)端脚Ca的²⁺波浪。**c（c）**对于使用AQuA进行的分析，手动绘制ROI来划分事件分析区域（与BV（白色虚线）相关），比例尺=10μm。d日事件转移的时间流逝示例(顶部)或朝向(底部)端脚ROI，比例尺=10μm。(**e（电子）**)比较膨胀钙百分比的条形图²⁺AkuA检测到的波向BV或远离BV扩展一,b条，幼鼠：n个============================================================================3只小鼠的13个ROI和5条血管，对于中年小鼠：n个============================================================================来自3只小鼠的11个ROI和4条血管，对于衰老小鼠：n个============================================================================来自3只小鼠的9个ROI和4条血管。对于速度面板第页值基于Mann-Whitney测试和距离和面积面板第页数值基于两个样本t检验。对于d日，年轻小鼠：n=4个ROI和来自3只小鼠的4条血管，对于中年小鼠：n个============================================================================来自3只小鼠的5个ROI和4条血管，对于衰老小鼠：n个============================================================================来自3只小鼠的4个ROI和4条血管。对于靠近或远离BV的事件的比较，有两个样本t吨测试用于确定第页值。所有误差条均为S.E.M。

**图3。衰老小鼠的星形胶质细胞终末不依赖细胞外钙²⁺生成自发钙²⁺事件。**
一代表性端脚Ca²⁺年轻人DLS的事件痕迹(顶部)，中年(*中间的*)、和老化(底部)小鼠沐浴后应用零钙²⁺aCSF。对单个血管的ROI进行平均，以比较Ca²⁺事件发生频率(左边)，振幅(*中间的*)、和持续时间(*正确的*)适合年轻人(b条)，中年(**c（c）**)和老化(d日)小鼠沐浴后施用零钙²⁺aCSF。对于幼鼠：n个============================================================================来自7只小鼠、中年小鼠的96个ROI和36条血管：n个============================================================================来自4只小鼠的46个ROI和16条血管，对于衰老小鼠：n个============================================================================来自7只小鼠的57个ROI和26条血管。误差条为S.E.M.全部第页年轻频率、振幅和持续时间的值基于Wilcoxon符号排名测试。对于中年小鼠，频率和持续时间面板第页值基于成对样本t吨测试和振幅面板第页该值基于Wilcoxon符号秩检验。频率和振幅第页衰老小鼠的数值来自Wilcoxon符号秩检验和持续时间第页该值基于配对样本t检验。

**图4。老化星形胶质细胞终末只依赖细胞内ER-Ca²⁺储存以产生自发钙²⁺事件。**
一代表性端脚Ca²⁺年轻人DLS的事件痕迹(顶部)，中年(*中间的*)、和老化(底部)用20µM CPA孵育15分钟后的小鼠。对单个血管的ROI进行平均，以比较Ca²⁺事件发生频率(左边)，振幅(*中间的*)、和持续时间(*正确的*)适合年轻人(b条)，中年(**c（c）**)和老化(d日)用20µM CPA孵育15分钟后的小鼠。对于幼鼠：n个============================================================================来自5只小鼠、中年小鼠的21个ROI和11条血管：n个============================================================================来自4只小鼠和老龄小鼠的22个ROI和8条血管：n个============================================================================24个ROI和来自6只小鼠的11条血管。误差条为S.E.M.对于幼鼠频率和持续时间第页数值基于两个样本t检验和young振幅第页该值基于Wilcoxon符号排名测试。全部第页中年频率、振幅和持续时间的值基于配对样本t检验。频率和振幅第页衰老小鼠的数值来自Wilcoxon符号秩检验和持续时间第页该值基于配对样本t检验。

**图5。衰老会降低星形胶质细胞终末、DLS神经膜和邻近皮层中CALR的表达水平。**
一年轻人DLS或皮层的代表性单平面共焦图像(顶部)和老化(底部)用CALR（红色）和AQP4（绿色）联合标记小鼠，比例尺=15μm。白色箭头指向与AQP4阳性血管染色一致的单个CALR点。b条幼鼠CALR或AQP4单独染色的单平面共焦图像，比例尺=15μm。比较神经膜CALR强度的条形图(左边)，AQP4阳性BV内的CALR强度(*中间偏左*)，AQP4阳性BV中CALR点的数量(*中间偏右*)在DLS中(**c（c）**)或皮层(d日). DLS、年轻和衰老小鼠的CALRn个============================================================================9个纹状体切片54条血管，每个年龄组3只小鼠。对于皮层，年轻和衰老小鼠n=36条来自9个纹状体部分的血管，每个年龄组3只小鼠。误差条均为S.E.M第页这些值基于曼希特尼试验。

**图6。衰老降低星形胶质细胞末端线粒体的数量和DLS中AQP4的表达。**
一将AAV-GfaABC1D-mito7-eGFP注射到年轻和衰老小鼠的DLS中。3周后，对纹状体切片进行成像，获得AQP4标记的BV线粒体的单平面图像。b条年轻人DLS的典型单平面共焦图像(左边)和老化(*正确的*)表达AAV-GfaABC1D-mito7-eGFP（绿色）并用AQP4（红色）染色的小鼠，比例尺=15μm。**c（c）**条形图比较AQP4标记的BVs中线粒体的数量(左边)和AQP4强度(*正确的*)在年轻和衰老的小鼠中。d日青年DLS中AQP4标记血管的代表性z堆栈(左边)和老化(*正确的*)小鼠，比例尺=150μm。**e（电子）**比较年轻和老龄小鼠中AQP4标记血管数量的条形图。对于线粒体计数和AQP4强度，幼鼠n个============================================================================来自9个纹状体切片的38条血管，以及3只小鼠和衰老小鼠：n个============================================================================49条血管取自9个纹状体切片，每个年龄组3只小鼠。误差条为S.E.M，第页数值基于Mann-Whitney检验。对于AQP4血管的数量，n个============================================================================6只DLS FOV来自3只小鼠，分别用于年轻和老龄小鼠。误差条为S.E.M.和第页该值基于双样本t检验。

**图7。衰老增加了末端线粒体Ca的频率²⁺事件。**
一将AAV-GfaABC1D-mito7-GCaMP6f注射到年轻和衰老小鼠的DLS中。3周后，脑室内注射番茄凝集素（TL），采集纹状体脑切片，记录和测量钙²⁺DLS内终足线粒体内的内流事件。b条线粒体Ca的代表性t-stack²⁺线粒体7-GCaMP6f（绿色）在DLS中紧邻TL标记血管（红色）的年轻和老化星形胶质细胞终末检测到内流事件，比例尺=15μm。白色箭头指向线粒体末端Ca的区域²⁺事件已启动。**c（c）**代表性端足线粒体Ca²⁺年轻（红色）和衰老（蓝色）小鼠的内流事件痕迹。d日显示数字的条形图(左边)和面积(*正确的*)末梢线粒体Ca²⁺年轻和衰老小鼠的事件ROIs。**e（电子）**对单个血管的ROI进行平均，以比较末端线粒体Ca²⁺事件发生频率(左边)，振幅(*中间的*)、和持续时间(*正确的*)在年轻和衰老的小鼠中。对于幼鼠，n个============================================================================来自3只小鼠的53个ROI和18条血管。对于衰老小鼠，n个============================================================================来自5只小鼠的28个ROI和16条血管。误差条为S.E.M和所有第页中的值(d日)基于曼希特尼测试。在(**e（电子）**)，频率和振幅第页数值基于两个样本t检验和持续时间面板第页该值基于Mann-Whitney测试。

**图8。年轻和衰老小鼠的脚端线粒体不依赖细胞外钙²⁺.**
代表性线粒体Ca²⁺年轻人的事件痕迹(一)或老化(**c（c）**)小鼠沐浴前后应用零钙²⁺aCSF。对单个血管的ROI进行平均，以比较频率(左边)，振幅(*中间的*)、和持续时间(*正确的*)线粒体钙²⁺年轻时记录的事件(b条)或老化(d日)老鼠。对于幼鼠，n个============================================================================来自3只小鼠的52个ROI和18条血管。对于衰老小鼠，n个============================================================================来自5只小鼠的28个ROI和16条血管。误差条为S.E.M.所有频率和持续时间第页值和老化幅度第页值是基于配对样本t检验和年轻振幅第页该值基于Wilcoxon符号排名测试。

**图9。幼龄和老龄小鼠足端线粒体依赖细胞内钙²⁺商店。**
代表性线粒体Ca²⁺年轻时的事件痕迹(一)或老化(**c（c）**)小鼠沐浴前后涂抹CPA。(b条和d日)对单个血管的ROI进行平均，以比较频率(左边)，振幅(*中间的*)、和持续时间(*正确的*)线粒体钙²⁺年轻时记录的事件(b条)或老化(d日)老鼠。对于幼鼠：n个============================================================================来自3只小鼠和老龄小鼠的22个ROI和9条血管：n个============================================================================来自5只小鼠的18个ROI和11条血管。所有错误均为SEM。所有频率、振幅和年轻持续时间第页这些值基于Wilcoxon符号排名测试。老化持续时间第页该值基于配对样本t检验。

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[1] Hou Y等。老龄化是神经退行性疾病的危险因素。Nat.Rev.Neurol公司。2019;15:565–581. doi:10.1038/s41582-019-0244-7。-内政部-公共医学

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