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.2023年1月；56（1）：e13350。
doi:10.1111/cpr.13350。 Epub 2022年11月2日。

LSD1的NR2E1相互作用肽抑制脑肿瘤起始细胞的增殖

胡蓉（音） 1 2 三, 奥马尔·法鲁克·沙胡尔·哈米德 4, 向阳 三 5 6, Balakrishnan Shenbaga Moorthy先生 4, 文章（Wen Zhang） 1 2, 菲利普·杰弗里 7, 李周 三, 新马 三 8, 陈方金 9, 裴建峰 9, 潘卡杰·基里 10, 永高牟 11, Kunchithapadam Swaminathan公司 4, 平远（Ping Yuan） 1 2 三 8
附属公司

LSD1的NR2E1相互作用肽抑制脑肿瘤起始细胞的增殖

胡蓉（音）等。 细胞Prolif. 2023年1月.

摘要

目标：消除脑肿瘤起始细胞（BTIC）对恶性脑肿瘤治疗的良好预后至关重要。为了开发针对BTIC的新策略，我们研究了涉及NR2E1（TLX）的BTIC自我更新机制，并探索了干预手段。

材料和方法：采用基因干涉结合细胞生长、肿瘤球形成、免疫共沉淀和染色质免疫共沉淀实验研究了BTIC中NR2E1及其相互作用蛋白LSD1。通过酰胺氢/氘交换质谱（HDX-MS）鉴定LSD1的NR2E1相互作用肽，并通过体外功能分析进行分析。通过移植患者衍生的BTIC，用颅内小鼠模型检测肽的体内功能。

结果：我们发现NR2E1招募赖氨酸去甲基酶LSD1，在Pten启动子处去甲基化单甲基和双甲基组蛋白3 Lys4（H3K4me/me2）并抑制其表达，从而促进BTIC增殖。使用酰胺氢/氘交换和质谱（HDX-MS）方法，我们鉴定了四种可能与NR2E1相互作用的LSD1肽。其中一个肽，LSD1-197-211，位于LSD1 SWIRM结构域，通过干扰NR2E1和LSD1功能促进Pten表达，从而强烈抑制BTIC增殖。此外，该肽在人BTIC中的过度表达可以抑制颅内肿瘤的形成。

结论：肽LSD1-197-211通过干扰NR2E1和LSD1的协同作用而抑制BTIC，有望成为未来脑肿瘤治疗的先导肽。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突

数字

图1
图1
BTIC的增殖需要NR2E1和LSD1。（A） 基因敲除后BTIC的细胞形态编号2e1或Lsd1号机组通过RNAi。比例尺为100μm。（B） 实时PCR分析编号2e1和Lsd1号机组对照shRNA后第3天在BTIC中，编号2e1shRNA或Lsd1号机组shRNA敲除。数据表示为平均值±SD(n个 = 3). 通过学生的t吨‐测试，如所示(*第页 < 0.05; **第页 < 0.01; ***第页 < 0.001). （C） 转染对照shRNA后第3天BTIC中NR2E1和LSD1蛋白水平的代表性western blot结果，编号2e1shRNA，Lsd1号机组shRNA或shRNA及其相应的RNAi免疫cDNA，如图所示。ACTIN被用作内部控制。（D） MTT法检测转染对照shRNA后第3天BTIC的细胞活力，编号2e1shRNA，Lsd1号机组shRNA或shRNA及其相应的RNAi免疫cDNA。数据表示为平均值±SD(n个 = 3). 通过学生的t吨‐测试，如所示(*第页 < 0.05**第页 < 0.01; ***第页 < 0.001)
图2
图2
NR2E1和LSD1在BTIC中形成复合物并调节Pten的表达。（A） 用针对NR2E1和LSD1的抗体进行免疫共沉淀（Co-IP）测定，以测试它们在BTIC中的相互作用。用对照IgG和NR2E1抗体免疫沉淀等量的总细胞裂解物。然后用抗LSD1抗体印迹拉下的蛋白质。裂解物中的GAPDH被显示为每个Co-IP分析输入材料的对照物。IgG轻链显示为Co-IP下拉材料的负载控制。（B） 实时PCR分析铂族在控制shRNA后的BTIC中，编号2e1shRNA或Lsd1号机组shRNA敲除。数据表示为平均值±SD(n个 = 3). 通过学生的t吨‐测试，如所示(*第页 < 0.05; **第页 < 0.01). （C） 对照shRNA后40小时点NR2E1、LSD1、PTEN蛋白水平的Western blot分析，编号2e1shRNA1或Lsd1型shRNA1击倒。ACTIN被用作内部控制。（D） 对照shRNA后BTIC的细胞形态，编号2e1shRNA1，Lsd1型shRNA1和铂en-shRNA敲除作为指示组合。比例尺代表100μm。（E） 对照shRNA后BTIC的细胞存活分析，编号2e1shRNA1，Lsd1号机组shRNA1和Pten公司使用MTT分析法按指示组合敲除shRNA。数据表示为平均值±SD(n个 = 3). 通过学生的t吨‐测试，如所示(*第页 < 0.05; **第页 < 0.01). （F） 描述设计用于扩增染色质免疫沉淀（ChIP）DNA的引物区域的方案，以及对照GFP、LSD1和NR2E1在铂族通过ChIP和实时PCR检测发现启动子。数据表示为平均值±SD(n个 = 3). 通过学生的t吨‐测试，如所示(*P（P） < 0.05; **P（P） < 0.01). （G） H3K4me和H3K4me2富集的ChIP和实时PCR分析铂族对照shRNA敲低后BTIC中的启动子，编号2e1shRNA或Lsd1号机组40小时时的shRNA。数据表示为平均值±SD(n个=3）。通过学生的t吨‐测试，如所示(*第页 < 0.05; **第页 < 0.01)
图3
图3
如HDX‐MS所示，NR2E1对LSD1的影响。（A） LSD1和NR2E1之间的绝对氘吸收差异：LSD1。（B） LSD1、197–211、354–377、481–501和537–546的四个胃蛋白酶消化片段的增强质谱显示了NR2E1结合时交换的显著差异：未扩张肽（Top），LSD1中同一肽在氘化1分钟后的同位素包络（Middle）以及LSD1与NR2E1复合物中相同肽在氘化1分钟后的同位素包络（下图）。（C） 热图显示了在HDX作用1分钟后，NR2E1:LSD1相对于LSD1的氘摄取量减少的百分比，绘制在LSD1晶体上（PDB ID:2Z3Y）。（D） LSD1肽197-211、354-377、481-501和537-546埋藏的NR2E1表面积分布的直方图。（埋地表面积小于100º2被忽略）
图4
图4
LSD1肽在NR2E1和LSD1相互作用中的作用。（A） NR2E1和LSD1之间的相互作用因LSD1中197-211残基的缺失而中断。用抗HA抗体免疫沉淀HA‐NR2E1和Flag‐LSD1或Flag­LSD1-突变转染的293T细胞的总蛋白裂解物，然后用抗Flag抗体免疫印迹。用抗Flag或抗HA抗体的免疫印迹法显示细胞中的蛋白表达。（B） Flag‐LSD1肽197-211的过度表达导致BTIC中PTEN的上调。Flag‐GFP和Flag∙LSD1肽过度表达的BTIC的裂解产物通过抗Flag和抗PTEN抗体进行免疫印迹。ACTIN作为内部加载控件加载。（C） LSD1肽197-211的过度表达导致Ki-67阳性细胞的减少。抗Ki‐67抗体染色显示为红色，DAPI染色显示为蓝色。比例尺为25μm。（D） 对照或LSD1肽短暂过度表达后活BTIC的MTT分析。数据表示为平均值±标准差(n个 = 6). 通过学生的t吨‐测试，如所示(***第页 < 0.001). （E） 控制肽或LSD1‐197‐211肽过度表达后BTIC软琼脂分析的代表性图片。（F） transwell分析的代表性图片显示了GFP过表达的BTIC和LSD1‐197‐211过表达的BTIC的迁移能力。比例尺代表100μm。（G） GFP对照或LSD1‐197‐211过表达BTIC的限制稀释试验。（H） H3K4me和H3K4me2相对富集铂族在BTIC中过度表达GFP、LSD1‐197‐211肽或LSD1−354‐377肽后的启动子。数据表示为平均值±SD(n个 = 3). 通过学生的t吨显示为测试(*第页 < 0.05)
图5
图5
LSD1‐197‐211的特异性。（A） Western blot检测293T和BTIC‐1中NR2E1和LSD1的蛋白质水平。ACTIN作为内部控件加载。（B） 实时PCR定量铂族和编号2e1控制shRNA和编号2e1shRNA击倒293T细胞。数据用标准化肌动蛋白数据表示为平均值±SD(n个 = 3). 通过学生的t吨‐测试，如所示(**第页 < 0.01***第页 < 0.001). （C） Western blot比较PTEN在不同LSD1肽过表达293T细胞和对照GFP过表达292Ts细胞中的表达水平。GAPDH作为内部控制加载。（D） 用对照肽或LSD1肽过度表达293T细胞后的细胞活力的MTT分析。数据表示为平均值±SD(n个=6）。通过学生的t吨‐测试，如所示(**第页 < 0.01). （E） LSD1 SWIRM、ADA2 SWIRM（PDB Id:2AQE）和SWI3 SWIRM的总体结构（PDB Id:2FQ3）。所有SWIRM域都包含一个中心长螺旋，两侧为小螺旋。圈出LSD1‐197‐211和ADA2和SWI3 SWIRM域中的相应区域。型腔/装订袋表示为网格贴图。这些数字是用PyMOL绘制的
图6
图6
LSD1‐197‐211的稳定表达抑制人类BTIC的增殖。（A） 多西环素诱导3天和6天后，由表达GFP或LSD1‐197‐211‐GFP的慢病毒转导的人类BTIC品系1（hBTIC‐1）悬浮培养的代表性图片。光学显微镜（顶部）、荧光显微镜检测GFP（底部）。比例尺代表50μm。（B） GFP对照或LSD1‐197‐211过度表达hBTIC的限制稀释试验。（C） 多西环素诱导5周后，移植GFP或LSD1‐197‐211‐GFP慢病毒转导的人类BTIC的裸鼠脑肿瘤的典型IVIS图像。（D） 移植GFP或LSD1‐197‐211‐GFP慢病毒的裸鼠大脑在紫外线下转导人BTIC。（E） 在多西环素诱导7周后，移植GFP或LSD1‐197‐211‐GFP慢病毒转导的人BTIC的裸鼠大脑的代表性苏木精-伊红染色图片。（F） 移植GFP或LSD1‐197‐211‐GFP慢病毒转导hBTIC的裸鼠生存曲线。X（X）轴为hBTIC移植后的第二天。（G） 描述BTIC中NR2E1、LSD1和LSD1‐197‐211功能机制的模型
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