S6K1 phosphorylates Cdk1 and MSH6 to regulate DNA repair

doi:10.7554/eLife.79128

.2022年10月3:11:e79128。

doi:10.7554/eLife.79128。

S6K1磷酸化Cdk1和MSH6以调节DNA修复

附属公司

¹以色列耶路撒冷希伯来大学哈达萨医学院以色列卡纳达医学研究所生物化学和分子生物学系。
²以色列特拉维夫特拉维夫大学萨克勒医学院人类分子遗传学和生物化学系。
^三以色列耶路撒冷希伯来大学哈达萨医学院以色列卡纳达医学研究所免疫学与癌症研究系洛滕贝格免疫与癌症研究中心。

^#贡献均等。

PMID： 36189922
预防性维修识别码： PMC9529248型
内政部： 10.7554/e寿命79128

S6K1磷酸化Cdk1和MSH6以调节DNA修复

阿迪·阿马尔·施瓦茨等。埃利夫. 2022.

.2022年10月3:11:e79128。

doi:10.7554/eLife.79128。

附属公司

¹以色列耶路撒冷希伯来大学哈达萨医学院以色列卡纳达医学研究所生物化学和分子生物学系。
²以色列特拉维夫特拉维夫大学萨克勒医学院人类分子遗传学和生物化学系。
^三以色列耶路撒冷希伯来大学哈达萨医学院以色列卡纳达医学研究所免疫学与癌症研究系洛滕贝格免疫与癌症研究中心。

^#贡献均等。

PMID： 36189922
预防性维修识别码： PMC9529248型
内政部： 10.7554/e寿命79128

摘要

mTORC1底物S6激酶1（S6K1）参与细胞生长、核糖体生物发生、葡萄糖稳态和脂肪生成的调节。越来越多的证据表明mTORC1信号在DNA损伤反应中发挥作用。这主要是基于mTORC1抑制剂使细胞对DNA损伤敏感的发现。然而，mTORC1-S6K1信号通路在DNA修复中的直接作用以及该信号通路调节DNA修复的机制尚不清楚。在本研究中，我们发现S6K1通过协调细胞周期调节、同源重组（HR）DNA修复（HRR）和错配DNA修复（MMR）机制在调节DNA修复中发挥了新的作用。这里，我们表明S6K1通过丝氨酸39处的Cdk1磷酸化，导致G2/M细胞周期阻滞，实现同源重组，以及丝氨酸309处的MSH6磷酸化，增强MMR，来协调DNA修复。此外，乳腺癌细胞RPS6KB1型基因扩增显示，对几种DNA损伤剂的耐药性增加，S6K1的表达与化疗后乳腺癌患者的低生存率有关。我们的研究结果揭示了S6K1在DNA修复途径中的一种意想不到的功能，通过保护基因组稳定性作为致瘤屏障。

关键词：CDK1；DNA修复；MSH2；MSH6；S6K1系列；生物化学；肿瘤生物学；cdk1（cdc2）；化学生物学；dna修复；mTORC1；msh2；msh6；s6k1。

简明扼要的语言总结

细胞中DNA的损伤会导致有害的变化，如果不加以控制，可能会导致癌症的发展。为了防止这种情况发生，细胞机制已经到位，可以修复DNA中的缺陷。一种被称为mTORC1-S6K1通路的特殊过程被怀疑对修复很重要，因为当该通路被阻断时，细胞对DNA损伤更加敏感。目前尚不清楚参与mTORC1-S6K1通路的各种蛋白质如何帮助修复DNA。其中一种蛋白质S6K1是一种参与协调细胞生长和存活的酶。某些形式的乳腺癌中的肿瘤细胞比正常细胞产生更多的这种蛋白，这表明S6K1有利于这些细胞的生存。然而，目前尚不清楚这种酶是如何做到这一点的。Amar-Schwartz、Ben-Hur、Jbara等人使用转基因小鼠细胞和人类癌细胞研究了S6K1的作用。这些实验表明，该蛋白与其他两种参与DNA修复的蛋白质相互作用并激活它们，调节两种不同的修复机制并保护细胞免受损伤。这些结果可能解释了为什么一些乳腺癌肿瘤对放疗和化疗有抵抗力，而放疗和化疗的目的是通过破坏肿瘤细胞的DNA来杀死肿瘤细胞。如果是这样，这些发现可以帮助临床医生为产生额外S6K1的癌症患者选择更有效的治疗方案。未来，阻断酶活性的药物可能会使癌细胞更容易接受化疗。

PubMed免责声明

利益冲突声明

AA、VB、AJ、YC、GB、EA、ZS、BM、FH、AS、MA、MB、RW、RA、TG、RK未宣布竞争利益

数字

图1。 — **图1.S6K1保护细胞免受DNA损伤剂的伤害。**
(一)长（S6K1）和短（Iso-2）S6K1亚型结构和域组织，添加Halo-tag（浅蓝色椭圆）。异构体Iso-2缺少激酶结构域的12个保守区域中的6个，苏氨酸389（T389）的mTOR磷酸化位点，以及C末端自身抑制结构域（CTD）。NLS（核定位序列），NTD（N末端结构域）。(b条)Western blot显示S6K1在MEF野生型（WT）、S6K-/-细胞和用编码空载体pBABE（pB（-））、S6K1或Iso-2的逆转录病毒转导的S6K-//-细胞中的表达。(**c、 f，i**)中描述的MEF WT、S6K-/-和S6K--/-细胞的台盼蓝排除试验(b条)用阿霉素8μg/ml（DOX）治疗24小时(**c（c）**)或γ辐照5 Gy后24小时(**（f）**)或UVC 8焦耳/米²/秒(我). 数据表示六个重复的平均值±SD。(**d、 e、g、h、j**)MEF WT、S6K-/-细胞克隆存活试验(**d、 g、h、j**)，和用编码空载体pBABE（pB（-））、S6K1或Iso-2的逆转录病毒转导的S6K-/-细胞(**e、 g、h、j**)用不同浓度的Dox处理(**d、 e（电子）**)，γ辐照1–5 Gy(克)，紫外线6.5焦耳/米²/秒(小时)或各种浓度的新卡氮平（NCS）(j个). 14天后固定并量化菌落。数据表示至少三个生物重复的平均值±SD。(k个)表达空载体pBABE（pB（-））或S6K1的S6K-/-细胞的克隆存活试验。用不同浓度的阿霉素（DOX）和50 nM雷帕霉素处理细胞(**R（右）**). 数据表示三个生物三倍体的平均值±SD。(**l、米**)MEF WT和S6K-/-细胞的Western blot分析(我)或中描述的单元格(b条) (米)紫外线6.5焦耳/米照射24小时后²/第条。相对于GAPDH信号，对裂解的caspase 3和γ−H2AX信号进行量化。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。使用Student t检验（双尾）计算p值。数据表示三个生物三倍体的平均值±SD。

图1——图补充1。 — **图1补充图1。S6K1保护MCF-10A细胞免受DNA损伤剂的伤害。**
(一)Western blot显示S6K1在用编码空载体pBABE（pB（-））、S6K1、Iso-2或空载体mlp（-）和S6K1特异性shRNAs（sh1、sh2）的逆转录病毒转导的MCF-10A细胞中的表达。(**b、 c、f、g**)用编码空载体pBABE（pB（-））、S6K1或Iso-2的逆转录病毒转导的MCF-10A细胞的台盼蓝排斥试验(**b、（f）**)或mlp（-），S6K1特异性shRNAs（sh1，sh2）(**c、克**)用8 mg/µl阿霉素（DOX）处理24小时(**b、 c**)或暴露于UVC 8 J/m2/s后24小时(**f、克**). 数据表示六个重复的平均值±SD。(**d、 e、h**)过表达S6K1或Iso-2的MCF-10A细胞的克隆生存分析(**d、小时**)或表达S6K1特异性shRNAs（sh1，sh2）的MCF-10A细胞(**e、小时**). 细胞暴露于1–5 Gyγ辐射(**d、 e（电子）**)或各种浓度的新卡氮平（NCS）(小时). 14天后固定并量化菌落。数据表示四个重复的平均值±SD。(我)用空载体pBABE（pB（-））、S6K1或Iso-2转导并用10 mM顺铂（CDDP）处理16小时的MCF-10A细胞的克隆存活试验。细胞接种在3000或1500个细胞/孔。14天后，菌落固定并染色。实验一式三份。(j个)用逆转录病毒转导的MCF-10A细胞的Western blot分析，逆转录病毒编码空载体pBABE（pB（-）、S6K1或Iso-2或mlp（-）），S6K1特异性shRNAs（sh1，sh2）在紫外线照射24小时后12 J/m²/第条。(k个)用对照Halo-tag载体（HT）、S6K1或Iso-2转染U2OS细胞的Western blot。转染后48小时，细胞未经处理（对照组）或用阿霉素（DOX）（0.5µg/ml）或阿霉素和雷帕霉素（100 nM）（Rapa+DOX）处理。处理后3.5小时收集细胞并进行western blot。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。使用Student t检验（双尾）计算p值。

图1—图补充2。 — **图1补充图2。RPS6KB1表达是乳腺癌患者和化疗细胞系预后不良的标志。**
(一)乳腺癌化疗患者的Kaplan-Meier生存曲线与肿瘤中S6K1表达的关系。显示了使用来自Affymetrix阵列的三个不同探针的数据。(b条)未接受化疗的乳腺癌患者的Kaplan-Meier生存曲线与肿瘤中S6K1表达的关系。显示了使用来自Affymetrix阵列的三个不同探针集的数据。数据来自http://kmplot.com/analysis/. (**c（c）**)Western blot显示S6K1在四种不同乳腺癌细胞系（BTB474、MCF7、SKBR3和HCC70）中的表达。(**d、 e（电子）**)将BTB474、MCF7、SKBR3和HCC70细胞暴露于二甲基亚砜（载体）、25 mM顺铂（CDDP）或1 mg/ml阿霉素（DOX）中24小时。Western-blot分析(d日)和锥虫蓝排除试验(**e（电子）**)如图所示。数据表示六个重复的平均值±SD。***p<0.001，将BTB474细胞与MCF7、SKBR3或HCC70细胞进行比较。使用Student t检验（双尾）计算p值。

图1——图补充3。 — **图1-图补充3。S6K1不影响ATM水平或磷酸化状态。**
(**a–d**)用编码空载体pBABE（pB（-））、S6K1或Iso-2的逆转录病毒转导的MCF-10A细胞的蛋白质印迹分析(**a、 b条**)或空载体（mlp（-）），S6K1特异性shRNAs（sh1，sh2）(**c、 d日**). 用γ射线照射细胞5灰色(**a、 c**)或紫外线30焦耳/平方米/秒(**b、 d日**)照射后1或2小时收获。(**e–h**)MEF S6K-/-细胞和WT MEF的Western blot分析(**g、小时**)或用编码空载体pBABE（pB（-））、S6K1或Iso-2的逆转录病毒转导的MEF S6K-/-细胞(**e、（f）**). 用γ射线照射细胞5灰色(**e、克**)或紫外线30焦耳/平方米/秒(**f、小时**)照射后1或2小时收获。量化显示在每个面板下方的条形图中。数据表示三份的平均值+SD*使用Student t检验（双尾）计算p<0.05的值。

图2。 — **图2 S6K1和Iso-2与DNA损伤/修复蛋白结合。**
(一)维恩图表示转染HEK293细胞中与HT-S6K1亚型特异结合的DNA损伤反应/修复蛋白。蓝色标记的蛋白质通过相互免疫沉淀进行验证。(**b、 c**)总裂解物的Western blot(**L（左）**)以及从转染有Halo-tag表达控制载体（HT）、HT-S6K1（S6K1）或HT-Iso-2（Iso-2）（b，左面板和c，上面板）的HEK293细胞中的Halo-targ下拉物流过（FT）。来自相同细胞的Halo标签下拉的蛋白质印迹（b，右图c，下图）。(d日)总裂解物的Western blot(**L（左）**)以及从转染有Halo-tag表达控制载体（HT）、HT-S6K1（S6K1）或HT-Iso-2（Iso-2）（上部面板）的HeLa细胞中的Halo-targ下拉流（FT）。从转染了Halo-tag表达控制载体（HT）、S6K1或Iso-2（下面板）的相同细胞中提取Halo-targ下拉物的Western blot。(**e（电子）**)与Halo-tag表达控制载体（HT）、HT-S6K1（S6K1）或HT-Iso-2（Iso-2）和HA-Cdk1（上面板）联合转染的HEK293细胞总裂解物的Western blot。用抗HA抗体免疫沉淀这些细胞的裂解产物的Western blot（下表）。(**（f）**). 如b所述转染HEK293细胞的Western blot分析（左面板）。用抗PCNA抗体免疫沉淀这些细胞的裂解产物的Western blot（右侧）。

图2——图补充1。 — **图2补充图1。S6K1亚型与参与DNA修复的蛋白质相互作用。**
(一)维恩图表示两个独立蛋白质组分析中确定的蛋白质重叠。通过Halo-tag下拉试验转染HT、HT-S6K1或HT-Iso-2的HEK293细胞中与HT-S6K1亚型结合的蛋白质通过质谱法进行分析。这些数字代表特异性结合到HT-S6K1亚型而非HT对照的蛋白质数量。实验1使用常规蛋白质组学方法（凝胶提取样品）进行，实验2使用“珠上消化”方法进行。(b条)维恩图表示本研究中确定的S6K1相互作用物（S6K1和Iso-2）与Pavan等人2016中报告的相互作用物的重叠（Raught等人，2004）。仅使用SAINT概率（SP）>0.9和/或含有潜在磷酸化位点（RSRXXT/S）的高得分S6K1相互作用进行比较。(**c（c）**)文氏图表示本研究中确定的S6K1交互器与BioGrid（交互数据集生物通用存储库）的重叠https://thebiorid.org/2). (d日)维恩图表示Pavan研究中确定的高得分S6K1相互作用物与BioGrid的重叠(**e（电子）**)总裂解物的Western blot(**L（左）**)和HEK293细胞的流经（FT），用于实验2中的蛋白质组分析（三倍）。(**f、克**)如上所述转染的HeLa细胞用于使用PCNA抗体进行免疫沉淀。总裂解物的Western blot分析(**（f）**)和免疫沉淀蛋白(克). (**h、我**)如上所述转染的HeLa细胞用于使用MSH6抗体进行免疫沉淀。总裂解物的Western blot分析(小时)和免疫沉淀蛋白(我).

图2——图补充2。 — **图2-图补充剂2。S6K1不磷酸化无关蛋白Uba5。**
(一)使用重组His-S6K1[T412E]和重组Uba5（由Reuven Weiner博士实验室提供）进行非放射性体外激酶分析。反应产物通过SDS-PAGE进行解析，并使用针对S6K1磷酸化基序（p-Akt底物，RXXS）的抗体或抗体通过Western Blot进行分析，以检测重组蛋白。(b条)Uba5的蛋白质序列。精氨酸、丝氨酸和苏氨酸突出显示不存在RXXS基序。

图3。 — **图3 S6K1在体外磷酸化CDK1和MSH6。**
(一)γ体外激酶测定-³²所示组合中的P-ATP和重组His-S6K1[T412E]与重组His-Cdk1（Cdk1）或重组His-MSH6（MSH6，1-718aa片段，如材料和方法中所述）。前三个面板显示通过SDS-PAGE解析并可视化的反应产物（第二个和第三个面板是同一膜的短期和长期暴露）。第四个面板显示了与第一个面板相同的膜，该面板使用抗Cdk1抗体进行探测，并通过增强化学发光进行检测。非特异性放射性带用<标记。(b条)使用重组His-S6K1[T412E]和任一重组GST-S6进行非放射性体外激酶检测(**S6系列**)、His-Cdk1（Cdk1）或His-MSH6（MSH6）。反应产物通过SDS-PAGE进行解析，并使用针对S6K1磷酸化基序（p-Akt底物，RXXS）的抗体或抗体进行Western Blot分析，以检测重组蛋白。(**c、 d日**)用抗病毒颗粒免疫沉淀FLAG-MSH6和S6K1亚型共转染HEK293细胞的Western blot分析。用p-Akt底物抗体检测MSH6的磷酸化。图中显示了MSH6磷酸化的定量(d日). (**e、（f）**)HA-Cdk1和S6K1联合转染HEK293细胞的Western blot分析²/s（UV）损伤亚型与抗HA珠免疫沉淀。用p-Akt底物抗体检测Cdk1的磷酸化。图中显示了Cdk1磷酸化的量化(**（f）**). 实验重复三次（生物复制）。**使用Student t检验（双尾）计算p<0.01 p值。

图4。 — **图4.S6K1影响DNA损伤蛋白的核定位。**
(**a、 b条**)用空载体pBABE（pB（-））、S6K1或Iso-2转导的MCF-10A细胞未经处理（对照）或用UVC 30 J/m处理²/秒（UV）。处理后2小时，收集细胞，进行分馏，并进行western blot分析。β-微管蛋白和SRSF1作为细胞溶质(C类)和核能(N个)标记。印迹的定量如b所示。数据表示三个实验的平均值±SD。(**c、 d日**)用空载体（mlp（-））或S6K1特异性shRNAs（sh1，sh2）转导的MCF-10A细胞未经处理（对照）或用UVC 30 J/m处理²/s（紫外线）。处理后2小时，收集细胞，进行分馏，并进行western blot分析。β-微管蛋白和SRSF1作为细胞溶质(C类)和核能(N个)标记。印迹的定量如d所示。数据表示三个生物实验的平均值±SD。(**e（电子）**)转染HT、HT-S6K1（S6K1）或HT-Iso-2（Iso-2）的U2OS细胞未经处理（续）或暴露于UVC 30 J/m2/sec（UV）。2小时后，细胞固定并用抗Halo标记荧光TMR直接配体和DAPI染色。使用荧光显微镜对细胞进行目视评分，以进行核染色(N个)或细胞质染色(C类). （n=每次转染得分为600个细胞；对照组为300个，紫外线处理为300个）。使用Student t检验（双尾）计算三个生物复制品的p值。(**（f）**)U2OS细胞用HT-S6K1转染并暴露于UVC 30J/m2/s，两小时后固定。用抗Halo-tag荧光TMR直接配体（红色）和抗γ-H2Ax（绿色）染色的细胞的代表性照片。箭头指向S6K1核定位。照片由尼康TL（×20）拍摄。*p<0.05，**p<0.01。p值采用Student t检验（双尾）计算。

图4——图补充1。 — **图4-图补充1.分馏实验的总裂解物。**
(**a、 b条**)用空载体pBABE（pB（-））、S6K1或Iso-2转导的MCF-10A细胞的Western blot(一)或用空载体mlp（mlp（-））或S6K1特异性shRNAs（sh1，2）转导的MCF-10A细胞(b条)有无紫外线30焦耳/米²/秒（紫外线）处理。这些是主图4a和c所示的分馏实验的总裂解物(**c（c）**)用空载体pBABE（pB（-））或S6K1转导的MCF-10A细胞未经处理（对照）或用UVC 30 J/m处理²/秒（UV）。治疗2小时后，收集细胞，进行分馏，并进行western blot分析。Caspase-2和SRSF1作为细胞溶质(C类)或核能(N个)标记。(d日)用对照Halo-tag载体（HT）、HT-S6K1（HT-S6K1）或HT-Iso-2（HT-Iso_2）转染U2OS细胞，并暴露于UVC 30 J/m2/s。2小时后，细胞固定并用抗Halo-targ荧光TMR直接配体（红色）和DAPI染色。图像由尼康TL（×20）拍摄。实验的代表性图像总结在主图4e中。(**e（电子）**)表示与主图4f中所述实验相关的HT、HT-S6K1（S6K1）或HT-Iso-2（Iso-2）阳性细胞U2OS细胞中γ-H2AX荧光强度的直方图。使用NIS-Elements AR软件计算强度。

图5。 — **图5.S6K1增强DNA损伤后G2/M细胞周期阻滞。**
(**a–d**)用编码空载体pBABE（pB（-））、S6K1或Iso-2的逆转录病毒转导的MEF WT或S6K-/-细胞群用2.5 Gy（IR）电离辐射照射(一). 细胞用DAPI、抗磷甾酮H3 Alexa488、抗细胞周期蛋白B1 Alexa647和抗细胞周期素A PE561染色。根据DAPI染色显示G1、S和G2分离(b条). pH3和DAPI的双重分析可区分M相(**c（c）**). 在S/G2/M上对曲线图进行门控。对细胞周期蛋白A和细胞周期蛋白B1的双重分析区分了S、G2和M(d日). (**e、（f）**)用HA标记的WT CDK1或HA标记的突变CDK1 39 A转染表达编码S6K1的逆转录病毒的S6K-/-细胞的细胞周期FACS分析。转染细胞后36小时用IR 5 Gy处理。24小时后，对细胞进行FACS分析(**e（电子）**). G1、S和G2/M中的细胞百分比如图（f）所示。*p<0.05，使用Student t检验（双尾）计算三个生物复制品的p值。

图5——图补充1。 — **图5补充了1。MCF-10A细胞的细胞周期分析。**
(**a、 b条**)UVC 12 J/m2/s处理24小时后，用编码空载体pBABE（pB（-））、S6K1或Iso-2的逆转录病毒转导的MCF-10A细胞的细胞周期FACS分析(一). 图中显示了G1、S和G2/M中的细胞百分比(b条).

图6。 — **图6 S6K1过度表达增强同源重组和错配修复。**
(一)DSB报告质粒示意图。SceGFP是一种GFP基因，在编码区内包含一个I-SceI内切酶位点。体内I-SceI位点的裂解和HDR（同源定向修复）结合下游iGFP重复序列的修复导致GFP阳性细胞。(b条)表达DSB报告质粒（U2OS-DR-GFP）的U2OS细胞与ISceI和Halo-tag空载体（HT）、HT-S6K1或HT-Iso2联合转染。Western blot显示S6K1表达（顶部面板）。细胞通过FACS分析GFP表达（底部面板）。(**c（c）**)使用CRISPR敲除S6K1的U2OS-DR-GFP细胞被ISceI转染。Western blot显示S6K1表达（顶部面板）。细胞通过FACS分析GFP表达（底部面板）。(d日)用对照siRNA（scr）或Rad51特异siRNA（siRad51）转染的U2OS-DR-GFP细胞与ISceI联合转染。Western blot显示Rad51表达（顶部面板）。细胞通过FACS分析GFP表达（底部面板）。(**e（电子）**)U2OS-DR-GFP细胞与ISceI和WT CDK1或突变CDK1 39 A共转染。Western blot显示HA标签表达（顶面板）。细胞通过FACS分析GFP表达（底部面板）。(**（f）**)U2OS-DR-GFP细胞与ISceI和S6K1以及WT CDK1或突变CDK1 39 A共同转染。Western blot显示HA标签表达（顶面板）。细胞通过FACS分析GFP表达（底部面板）。(**g、小时**)使用MEF WT（WT）和S6K-/-细胞进行错配修复分析(**（f）**)或稳定表达空载体（pB（-））、S6K1或Iso-2的S6K-/-细胞(克)EGFP异源双链质粒转染。转染48小时后，用FACS分析细胞GFP的表达。(我)用Flag野生型MSH6（WT）、Flag-MSH6突变体309A（309A）或Flag-MSH6突变体309D（309D）和EGFP异源双链质粒共转染S6K-/-细胞。Western blot显示Flag-tagged表达（顶部面板）。转染48小时后，细胞通过FACS分析GFP表达（底部面板）。数据表示生物三倍体的平均值±SD*使用Student t检验（双尾）计算p<0.05的值。

图6——图补充1。 — **图6-图补充1.U2OS-DR-GFP细胞的细胞周期分析。**
(**a–l**)表达HT、HT-S6K1或HT-Iso2（a-d，与主图6b相关）的U2OS-DR-GFP细胞的细胞周期FACS分析，表达Cdk1 WT或Cdkl 39 a（e-h，与主表6e相关）或与S6K1（i-l，与主示图6f相关）共同表达Cdk 1 WT或者Cdk l 39 a的U2OS-DR-GFP-细胞。细胞用DAPI、抗磷甾酮H3 Alexa488、抗细胞周期蛋白B1 Alexa647和抗细胞周期素A PE561染色。根据DAPI染色显示G1、S和G2分离(**b、 f、j**). pH3和DAPI的双重分析区分M相(**d、小时，小时**). 在S/G2/M上对曲线进行门控。对细胞周期蛋白A和细胞周期蛋白B1的双重分析区分了S、G2和M(**c、克，千**).

图7。 — **图7.MSH6 309磷酸化对细胞定位很重要。**
(**a、 b条**)用Flag-MSH6 WT、MSH6 309 A或MSH6 09D转染的MEF S6K-/-细胞接受紫外线照射，2小时后固定。用抗Flag抗体和DAPI对细胞进行染色。使用NIS-element AR软件定量荧光。(**c（c）**)图示S6K1进入细胞核对DNA损伤剂的反应。Cdk1和MSH6的S6K1磷酸化导致G2/M细胞周期阻滞并影响DNA损伤修复机制。

作者回复图片1。 — **作者回复图片1.pH2AX水平的时间进程。**
（a）用UV30J/m2/sec照射MEF WT和S6K-/-细胞。在照射后的不同时间点采集细胞。Western blot分析显示pH2AX水平。（b）用紫外线30J/m2/sec照射过度表达HT、HT-S6K1或HT-iso-2的U2OS细胞。照射后在不同时间点采集细胞。Western blot分析显示pH2AX水平。

作者回复图片2。 — **作者反应图2.紫外线照射后细胞内MSH6 mRNA水平。**
a.过度表达S6K1或Iso-2的MCF10A细胞未经处理或用紫外线30J/m2/sec处理。Q-RT-PCR用于定量MSH6 mRNA水平。b.过度表达S6K1特异性sh1或sh2的MCF10A细胞未经处理或用紫外线30J/m2/sec处理。Q-RT-PCR用于定量MSH6 mRNA水平。

作者回复图片3。 — **作者反应图像3.紫外线照射后S6K1和S6磷酸化的时间过程。**
（a）用bB（-）、S6K转导的MEK S6K-/-细胞！或Iso-2用紫外线30J/m2/sec照射。照射后在不同时间点采集细胞。Western Blot分析显示磷酸化S6K1 T389（pS6K1）、总S6K1（tS6K1”）、磷酸化S6 S235/236（pS6）和总S6（tS6）水平。Tubulin被用作负荷控制。图表显示过度表达S6K1的MEF S6K1-/-细胞中S6和S6K1相对磷酸化。

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SMYD3在肿瘤细胞对DNA损伤的反应中调节AMPK-mTOR信号平衡。
Lepore Signorile M、Sanese P、Di Nicola E、Fasano C、Forte G、De Marco K、Disciglio V、Latrofa M、Pantaleo A、Varchi G、Del Rio A、Grossi V、Simone C。 Lepore Signorile M等人。细胞。2023年11月17日；12（22）：2644。doi:10.3390/cells12222644。细胞。2023 PMID：37998381 免费PMC文章。
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1. Albert JM，Kim KW，Cao C，Lu B.针对雷帕霉素途径的akt/哺乳动物靶点对乳腺癌放射增敏。分子癌症治疗。2006;5:1183–1189. doi:10.1158/1535-7163.MCT-05-0400。-内政部-公共医学
1. Alexander A、Cai SL、Kim J、Nanez A、Sahin M、MacLean KH、Inoki K、Guan KL、Shen J、Person MD、Kusewitt D、Mills GB、Kastan MB、Walker CL。ATM向细胞质中的TSC2发出信号，以调节mtorc1对ROS的反应。美国国家科学院。2010;107:4153–4158. doi:10.1073/pnas.0913860107。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学
1. Ali AY，Abedini MR，Tsang BK。致癌磷酸酶PPM1D通过减弱检查点激酶1和p53激活，在卵巢癌细胞中赋予顺铂抵抗。致癌物。2012;31:2175–2186. doi:10.1038/onc.2011.399。-内政部-公共医学

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