Isolation of mitochondria-derived mitovesicles and subpopulations of microvesicles and exosomes from brain tissues

doi:10.1038/s41596-022-00719-1

审查

.2022年11月；17(11):2517-2549.

doi:10.1038/s41596-022-00719-1。 Epub 2022年8月12日。

从脑组织中分离线粒体衍生的有丝分裂囊泡以及微泡和外泌体亚群

附属公司

¹美国纽约州奥兰治堡Nathan S.Kline精神病研究所痴呆研究中心。
²美国纽约州纽约市纽约大学格罗斯曼医学院精神病学系。
^三西班牙巴塞罗那圣克鲁圣保罗医院神经内科神经退行性疾病网络生物医学研究中心（CIBERNED）。
⁴西班牙阿利坎特健康与生物医学研究所（ISABIAL）。
⁵西班牙阿利坎特UMH-CSIC神经科学研究所。
⁶美国纽约州奥兰治堡Nathan S.Kline精神病研究所痴呆研究中心。efrat.levy@nki.rfmh.org。
⁷美国纽约州纽约市纽约大学格罗斯曼医学院精神病学系。efrat.levy@nki.rfmh.org。
⁸美国纽约州纽约市纽约大学格罗斯曼医学院生物化学与分子药理学系。efrat.levy@nki.rfmh.org。
⁹纽约大学神经科学研究所，纽约大学格罗斯曼医学院，美国纽约州纽约市。efrat.levy@nki.rfmh.org。

PMID： 35962195
预防性维修识别码：项目经理C633367
内政部： 10.1038/s41596-022-00719-1

审查

从脑组织中分离线粒体衍生的线粒体小泡及微泡和外泌体亚群

帕斯奎尔·达库恩佐等。 Nat协议. 2022年11月.

.2022年11月；17(11):2517-2549.

doi:10.1038/s41596--022-00719-1。 Epub 2022年8月12日。

附属公司

¹美国纽约州奥兰治堡Nathan S.Kline精神病研究所痴呆研究中心。
²美国纽约州纽约市纽约大学格罗斯曼医学院精神病学系。
^三西班牙巴塞罗那Santa Creu i Sant Pau医院神经内科神经退行性疾病网络生物医学研究中心（CIBERNED）。
⁴西班牙阿利坎特健康与生物医学研究所（ISABIAL）。
⁵西班牙阿利坎特UMH-CSIC神经科学研究所。
⁶美国纽约州奥兰治堡Nathan S.Kline精神病研究所痴呆研究中心。efrat.levy@nki.rfmh.org。
⁷美国纽约州纽约市纽约大学格罗斯曼医学院精神病学系。efrat.levy@nki.rfmh.org。
⁸美国纽约州纽约市纽约大学格罗斯曼医学院生物化学与分子药理学系。efrat.levy@nki.rfmh.org。
⁹纽约大学神经科学研究所，纽约大学格罗斯曼医学院，美国纽约州纽约市。efrat.levy@nki.rfmh.org。

PMID： 35962195
预防性维修识别码：项目经理C633367
内政部： 10.1038/s41596-022-00719-1

摘要

细胞外小泡（EV）是由包括大脑中的神经元和星形胶质细胞在内的所有细胞分泌到细胞外空间的纳米级小泡。EV在生理和病理生理过程中发挥着关键作用，例如废物清除、细胞间通信以及将保护性或致病性物质运输到细胞外空间。在这里，我们描述了从小鼠和人类大脑中可靠、一致地分离EV的详细方案，适用于任何具有基本实验室经验的人，总时间为27小时。该方法包括对脑组织进行温和的细胞外基质消化，纯化EV的一系列过滤和离心步骤，以及基于碘克沙醇的高分辨率密度梯度，该梯度可分离不同EV群体，包括线粒体起源的新确定EV类型丝裂球。我们还报告了使用纳米线分析、电子显微镜和western印迹技术对脑EV制剂进行表征和分析的详细下游协议，以及用于测量有丝分裂囊ATP动力学的下游协议。此外，我们将这种新型的基于碘xanol的高分辨率密度梯度与之前描述的基于蔗糖的梯度进行了比较。虽然回收的总EV产量相似，但与蔗糖梯度相比，碘克沙醇梯度能更好地分离出不同的EV物种，包括微泡、外泌体和有丝分裂囊的亚群。这项技术允许在正常生理过程和病理性脑条件下，包括阿尔茨海默病和帕金森病等神经退行性疾病，对脑EV亚型进行定量、高重复性分析。

PubMed免责声明

利益冲突声明

竞争利益

作者声明没有相互竞争的利益。

数字

**扩展数据图1。用PFA固定并用醋酸铀酰染色的纯化脑EV显示出独特的杯状形态**
从一只12个月大的雌性小鼠分离的蔗糖组分c脑EV的代表性显微照片，阴性染色后可见。注意固定电动汽车的杯形和无污染物质。比例尺：200 nm。所有动物程序均按照美国国立卫生研究院指南进行，并获得Nathan S.Kline精神病研究所动物护理和使用委员会的批准。

**扩展数据图2。获取有丝分裂囊期间污染晶体的典型低温电子显微镜照片（碘克沙醇组分8 EV）。**
晶体可视为电子密度高的物体，要么是无定形（橙色箭头），要么是多边形，例如六角形或立方形（红色箭头）。白色箭头表示典型的有丝分裂囊，其特征是存在双层膜。在这种情况下，无定形和多边形暗结构是相同的污染物，是由冻结过程中空气中的水分造成的。比例尺：200纳米。所有动物程序都是按照美国国立卫生研究院的指导方针进行的，并得到了内森·S·克莱恩精神病研究所动物护理和使用委员会的批准。

**图1|。用于分离脑EV亚群的程序概述。**
(一)从小鼠右侧半脑分离EV的程序示意图。(b条)脑EV隔离过程中最重要步骤的代表性照片（从步骤15到40）。(**c（c）**)脑EV亚群分离过程中最重要步骤的代表性照片（来自步骤41A和步骤41B）。在200000℃的过夜超速离心前后，显示了一个蔗糖低分辨率梯度（左）和一个碘克沙醇高分辨率梯度（中）加载脑EV克。右侧面板显示了碘克山醇EV组分的收集以及EV颗粒在再悬浮之前的外观。所有动物程序均按照美国国立卫生研究院指南进行，并获得Nathan S.Kline精神病研究所动物护理和使用委员会的批准。

**图2|。0.22μm过滤步骤对电动汽车的质量和产量至关重要。**
(一)当省略0.22μm过滤步骤时，在加载到柱（柱前EV）之前获得的EV的代表性低温电子显微镜照片。注意细胞碎片和电子致密膜聚集物的存在。比例尺：200 nm。(b条)样品通过0.22μm过滤器后，柱前电动汽车的代表性低温电子显微镜照片。未发现碎屑或骨料。比例尺：200 nm。(**c（c）**-**e（电子）**)小微泡（Annexin A2）、大微泡（β-actin）、外泌体（Cd63）蛋白标记物的代表性western blot分析(**c（c）**)和线粒体（Hsp60）(d日)当预柱电动汽车通过不同制造商的0.22μm或0.45μm过滤器时（更多详细信息，请参阅引言的“实验设计”部分）。层蛋白A/C、Mfn2和Polg是EV中不存在的污染细胞蛋白。(**e（电子）**)还显示了柱前脑EV和脑匀浆（BH）的SyproRuby总蛋白染色。通过0.22μm过滤器的柱前EV裂解物用数字表示(1到5)而通过0.45μm过滤器的柱前EV裂解物用大写字母表示(A类到C类). 每个数字或字母对应于使用独特制造的过滤器进行的隔离。尽管我们总共测试了七种0.22μm过滤器和三种0.45μm过滤器，但我们仅能完成五种0.22微米过滤器的隔离，而另外两种过滤器在隔离过程中瞬间堵塞（更多详细信息，请参阅前言中的“实验设计”部分）。1：CELLTREAT标准过滤器；2：康宁的预过滤过滤器；三：康宁标准过滤器；4：Cytiva的Whatman-Puradisc过滤器；5：Enertech Solutions的标准过滤器；A类：0.45μm Enertech Solutions预过滤过滤器；B类：0.45μm Enertech Solutions标准过滤器；C类：0.45μm Cytiva的Whatman GD/X（具有专利双预滤器，专为硬过滤样品设计）。有关每个过滤器的规格、更多信息和目录号，请参阅引言的“实验设计”部分。在每条车道上装载等量的柱前脑EV裂解物（3μL）。分子量标记如(**c（c）**-**e（电子）**)以千道尔顿（KDa）表示。所有动物程序均按照美国国立卫生研究院指南进行，并获得Nathan S.Kline精神病研究所动物护理和使用委员会的批准。

**图3|。高分辨率碘xanol基色谱柱可分离未被蔗糖基色谱柱分离的EV亚型。**
(一)在隔夜（约16小时）转移碘克沙醇脑EV组分1至8后，对PVDF膜进行SyproRuby总蛋白染色。20μL（左）或10μL（右）EVs组分在RIPA中裂解后加载，并按照文本所示制备。箭头指向膜底部富含脂质的区域（因此没有被污染）。(b条-**c（c）**)从成年小鼠右侧大脑分离并通过蔗糖梯度分离的EVs的代表性western blot分析(b条)或碘克沙醇梯度(**c（c）**). 对EV组分进行微泡膜联蛋白A2、外体Cd63和Alix以及有丝分裂囊PDHE1-α的印迹。分子量标记如(b条)和(**c（c）**)以千道尔顿（KDa）表示。所有动物程序均按照美国国立卫生研究院指南进行，并获得Nathan S.Kline精神病研究所动物护理和使用委员会的批准。

**图4|。基于蔗糖和碘蒽醇的EV组分的NTA分析。**
从成年小鼠右侧大脑中分离出的EV通过基于蔗糖的阶梯梯度分离(一)或通过碘克山诺阶梯梯度(**c（c）**)并遵守NTA。将分布的频率归一化为每组的模式，并使用四点移动平均值获得曲线。将碘xanol阶跃梯度的分数1至3（LDF）和分数4至6（IDF）合并。NTA估计的蔗糖组分的EV数量(b条)以及碘克沙醇组分(d日)被归一化为半脑重量。数据表示为每毫克脑组织中数十亿个粒子。中的统计测试(b条)和(d日)：采用Tukey多重比较测试的单向方差分析。独立隔离的数量：n个=所有实验均为6。数据如所示(b条)和(d日)：平均值±标准误差（平均值的标准误差）***P（P）*< 0.01, ****P（P）*< 10⁻³, *****P（P）*< 10⁻⁴所有动物程序都是根据美国国立卫生研究院的指导方针进行的，并得到了Nathan S.Kline精神病研究所机构动物护理和使用委员会的批准。

**图5|。保存在37°C下的线粒体通过电子传递链产生ATP。**
当从12个月大的雄性小鼠脑中分离出碘克沙醇组分8中的EV并按照步骤42E所示进行处理时获得的代表性结果。在37°C下10分钟后，检测到的ATP量通常会加倍，而如果使用电子传递链抑制剂寡核苷酸和抗-A（+OA）处理相同的EV，则检测到的量仍然很低。所示的线是一个S形插值，而点对应于原始数据。

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1. van Niel G、D’Angelo G和Raposo G《细胞外囊泡的细胞生物学》。Nat Rev Mol Cell Biol 19，213–228，doi:10.1038/nrm.2017.125（2018）。-内政部-公共医学
1. Del Conde I、Shrimpton CN、Thiagarajan P&Lopez JA组织因子承载微泡产生于脂筏，并与活化血小板融合以启动凝血。《血液》106，1604–1611，doi:10.1182/bloud-2004-03-1095（2005）。-内政部-公共医学
1. D'Acunzo P等人。Mitovesicles是唐氏综合征中线粒体起源的细胞外小泡的一个新群体。Sci Adv 7，doi:10.1126/sciadv.abe5085（2021）。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学
1. Valadi H等人。外显子介导的mRNA和microRNA转移是细胞间遗传交换的一种新机制。Nat Cell Biol 9，654–659，doi:10.1038/ncb1596（2007）。-内政部-公共医学
1. Perez-Gonzalez R等人。胱抑素C负载的细胞外小泡介导的神经保护。科学报告9，11104，doi:10.1038/s41598-019-47524-7（2019）。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

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[1] van Niel G、D’Angelo G和Raposo G《细胞外囊泡的细胞生物学》。Nat Rev Mol Cell Biol 19，213–228，doi:10.1038/nrm.2017.125（2018）。-内政部-公共医学

[2] van Niel G、D’Angelo G和Raposo G《细胞外囊泡的细胞生物学》。Nat Rev Mol Cell Biol 19，213–228，doi:10.1038/nrm.2017.125（2018）。-内政部-公共医学

[3] Del Conde I、Shrimpton CN、Thiagarajan P&Lopez JA组织因子承载微泡产生于脂筏，并与活化血小板融合以启动凝血。《血液》106，1604–1611，doi:10.1182/bloud-2004-03-1095（2005）。-内政部-公共医学

[4] Del Conde I、Shrimpton CN、Thiagarajan P&Lopez JA组织因子承载微泡产生于脂筏，并与活化血小板融合以启动凝血。《血液》106，1604–1611，doi:10.1182/bloud-2004-03-1095（2005）。-内政部-公共医学

[5] D'Acunzo P等人。Mitovesicles是唐氏综合征中线粒体起源的细胞外小泡的一个新群体。Sci Adv 7，doi:10.1126/sciadv.abe5085（2021）。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

[6] D'Acunzo P等人。Mitovesicles是唐氏综合征中线粒体起源的细胞外小泡的一个新群体。Sci Adv 7，doi:10.1126/sciadv.abe5085（2021）。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

[7] Valadi H等人。外显子介导的mRNA和microRNA转移是细胞间遗传交换的一种新机制。Nat Cell Biol 9，654–659，doi:10.1038/ncb1596（2007）。-内政部-公共医学

[8] Valadi H等人。外显子介导的mRNA和microRNA转移是细胞间遗传交换的一种新机制。Nat Cell Biol 9，654–659，doi:10.1038/ncb1596（2007）。-内政部-公共医学

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