Telomeric 8-oxo-guanine drives rapid premature senescence in the absence of telomere shortening

doi:10.1038/s41594-022-00790-y

.2022年7月；29(7):639-652.

doi:10.1038/s41594-022-00790-y。 Epub 2022年6月30日。

端粒8-氧代鸟嘌呤在没有端粒缩短的情况下导致快速过早衰老

附属公司

¹美国宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡大学公共卫生学院环境与职业健康系。
²UPMC希尔曼癌症中心，美国宾夕法尼亚州匹兹堡。
^三美国宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡大学医学院药理学和化学生物学系。
⁴美国宾夕法尼亚州匹兹堡卡内基梅隆大学生物科学和化学系及分子生物传感器和成像中心。
⁵美国宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡大学计算与系统生物学系。
⁶美国宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡大学公共卫生学院环境与职业健康系。网址：plo4@pitt.edu。
⁷UPMC希尔曼癌症中心，美国宾夕法尼亚州匹兹堡。plo4@pitt.edu。
⁸美国宾夕法尼亚州匹兹堡匹兹堡大学医学院药理学和化学生物学系。plo4@pitt.edu。

^#贡献均等。

PMID： 35773409
预防性维修识别码： PMC9287163
内政部： 10.1038/s41594-022-00790年

端粒8-氧代鸟嘌呤在没有端粒缩短的情况下导致快速过早衰老

瑞恩·P·巴恩斯等。自然结构分子生物学. 2022年7月.

.2022年7月；29(7):639-652.

doi:10.1038/s41594-022-00790-y。 Epub 2022年6月30日。

附属公司

¹美国宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡大学公共卫生学院环境与职业健康系。
²UPMC希尔曼癌症中心，美国宾夕法尼亚州匹兹堡。
^三美国宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡大学医学院药理学和化学生物学系。
⁴美国宾夕法尼亚州匹兹堡卡内基梅隆大学生物科学和化学系及分子生物传感器和成像中心。
⁵美国宾夕法尼亚州匹兹堡匹兹堡大学计算与系统生物学系。
⁶美国宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡大学公共卫生学院环境与职业健康系。plo4@pitt.edu。
⁷UPMC希尔曼癌症中心，美国宾夕法尼亚州匹兹堡。plo4@pitt.edu。
⁸美国宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡大学医学院药理学和化学生物学系。plo4@pitt.edu。

^#贡献均等。

PMID： 35773409
预防性维修识别码： PMC9287163
内政部： 10.1038/s41594-022-00790年

摘要

氧化应激是细胞衰老的主要原因，也是许多人类疾病的病因之一。端粒DNA的氧化损伤被认为通过加速端粒缩短而导致过早衰老。在这里，我们直接使用精确的化学发光工具对该模型进行了测试，以在人类成纤维细胞和上皮细胞的端粒处产生常见的损伤8-氧代鸟嘌呤（8oxoG）。单次诱导端粒8oxoG足以触发p53依赖性衰老的多个特征。端粒8oxoG激活ATM和ATR信号，丰富了复制细胞而非静止细胞中端粒功能障碍的标记物。急性8oxoG生成不能缩短端粒，而是在端粒产生脆弱的位点和有丝分裂DNA合成，表明复制受损。基于我们的研究结果，我们认为氧化应激通过产生氧化基损伤促进快速衰老，在没有缩短和保护蛋白丢失的情况下，氧化基损伤会导致复制依赖性端粒脆性和功能障碍。

PubMed免责声明

利益冲突声明

M.P.B.是Sharp Edge Labs公司的创始人，该公司将FAP-荧光技术商业化应用。其余作者声明没有相互竞争的利益。

数字

**图1。急性端粒8oxoG引起快速过早衰老。**
一10后FAP-mCer-TRF1显示YFP-XRCC1定位于端粒 RPE FAP-TRF1细胞的最小染料+光（DL）处理。b条，未经治疗（UT）后每个核的YFP-XRCC1阳性端粒百分比或10 野生型或OGG1ko RPE FAP-TRF1细胞中的最小DL。误差线表示所示数字的平均值±标准差n个从代表性实验中分析的原子核。单因素方差分析的统计分析(****P（P）* < 0.001）。对RPE FAP-TRF1野生型和OGG1ko细胞提取物中的FAP-TRF 1和OGG1进行免疫印迹。箭头表示抗OGG1染色的非特异性条带。**c（c）**–**e（电子）**，BJ的细胞计数(**c（c）**)、RPE(d日)或主BJ(**e（电子）**)获得FAP-TRF1细胞4 5或20天后恢复相对于未处理的细胞，单独或组合使用最小染料（D）和光（L）。**（f）**，RPE FAP-TRF1细胞周期分析24 不治疗后h或5 最小D，L，DL，20 J型米^–2UVC或1 h，2.5或10 百万KBrO_三流式细胞术测定。克，RPE FAP-TRF1菌落形成效率7–10 在被起诉的治疗后第天。小时,我，β-半乳糖苷酶阳性BJ FAP-TRF1细胞百分比4 指示处理后第天；2.5 百万KBrO_三和50 μM ETP处理为1 h.英寸**c（c）**–我，误差条表示黑色圆圈表示的独立实验数量的平均值±标准差。通过单因素方差分析确定统计显著性（ns，不显著**P（P）* < 0.05; ***P（P）* < 0.01; ****P（P）* < 0.001; *****P（P）* < 0.0001).j个，代表性图片5 最小DL-处理的BJ FAP-TRF1β-半乳糖苷酶阳性细胞。箭头标记阳性细胞（绿松石色）。k，检测线粒体呼吸24、48和96 5小时后最小D、L或DL。数据为BJ和RPE FAP-TRF1细胞的两个独立实验的平均值，误差条为±95%CI，每个实验有七到八个技术重复。源数据

**图2。端粒8oxoG的产生增加了细胞质DNA。**
一，BJ FAP-TRF1细胞中γH2AX、H3K27me3和肌动蛋白的图像4 5天后最小DL。插图，气泡MN增大。b条，BJ和RPE FAP-TRF1细胞指示标记的MN阳性百分比4 5天后最小DL。误差条表示由黑圈表示的独立实验数量的平均值±标准差。**c（c）**，对BJ FAP-TRF1细胞进行cGAS和γH2AX染色4 5天后最小DL处理。d日，cGAS或γH2AX阳性的MN百分比4 5天后最小DL或1 小时2.5 百万KBrO_三面板内处理**c（c）**.e（电子）BJ FAP-TRF1细胞的SASP分析7 治疗后5天或20天最小DL。浓度标准化为每个样品中的最终细胞数。数据以折叠变化表示。实际浓度见补充表1。**（f）**，MN和染色质桥的量化24 DAPI显示DL后h。每次实验至少计数500个细胞。克，从面板量化MN（f）显示着丝粒（Cen+）或端粒（Tel+）DNA的总MN阳性百分比，以及两者（Cen+/Tel+，或仅端粒DNA（Cen–/Tel+）的阳性百分比。每个实验至少分析30 MN。对于面板d日–克，误差条表示黑色表示的独立实验数量的平均值±标准差(d日,**e（电子）**)或红色和蓝色(**（f）**,克)圆圈。面板的统计重要性d日–**（f）**通过双向方差分析确定，对于面板克按倍数t吨-测试（ns，不显著**P（P）* < 0.05; ***P（P）* < 0.01; ****P（P）* < 0.001; *****P（P）* < 0.0001）。小时，BJ FAP-TRF1细胞实时成像产生MN的有丝分裂百分比24 5小时后最小DL。对于UTn个 = 60和DL 5 最小值n个 = 从两个独立的实验中观察到64个有丝分裂。我、活细胞成像的静像。左面板，产生MN的有丝分裂（箭头）；右图，具有核泡的间期细胞（箭头）。源数据

**图3。8oxoG诱导衰老需要p53 DNA损伤信号。**
一，磷酸化ATM（pATM）和磷酸化Chk2（pChk2）的免疫印迹最小DL。b条，7天后RPE FAP-TRF1菌落形成天从DL恢复。细胞仅在恢复期间与ATMi KU60019或DMSO培养。这些数字与未经处理的二甲基亚砜对照品有关。**c（c）**，获得的β-gal阳性BJ FAP-TRF1细胞的百分比4 DL后天。细胞仅在恢复期间与ATMi KU60019或DMSO培养。d日，ATM和ATR激酶引起的典型DNA损伤诱导的p53激活示意图。使用Biorender.com创建。**e（电子）**、未经处理的BJ FAP-TRF1细胞的免疫印迹，或用DL处理并恢复指定时间。紫外线 = 20 J型米^–2中波紫外线。ETP公司 = 1 小时50 μM ETP。**（f）**，FAP-TRF1表达RPE、BJ和HeLa细胞mRNASeq的热图24 不治疗后h（NT）或5 最小DL。图中显示的是顶部改变的基因，p53靶基因为红色。每列是一个独立的复制。克BJ（蓝色）或RPE（红色）FAP-TRF1细胞的野生型、p16ko、p53ko或p16+p53双ko细胞计数4 5天后恢复相对于各未处理细胞的最小DL。下面的免疫印迹显示FAP-TRF1、p53、p16的表达。小时，RPE FAP-TRF1集落形成后7 天从DL恢复。我，获得的β-gal阳性BJ FAP-TRF1细胞的百分比4 治疗后第天。j个，观察到的EdU-阳性细胞百分比24 5小时后最小DL（浅红色或浅蓝色）。在每个实验中，每个条件下都会对200多个细胞进行评分。对于b条,**c（c）**，以及克–j个，误差条表示黑色圆圈表示的独立实验数量的平均值±标准差。统计显著性b条,**c（c）**和小时–j个通过双向方差分析确定克单因素方差分析（ns，不显著**P（P）* < 0.05; ***P（P）* < 0.01; ****P（P）* < 0.001; *****P（P）* < 0.0001). 源数据

**图4。端粒8oxoG促进局部DDR。**
一，典型的IF图像显示BJ FAP-TRF1细胞的端粒（绿色）经telo-FISHγH2AX（红色）和53BP1（紫色）染色24 不治疗后h或5 最小DL。Colocalizations面板显示53BP1和/或γH2AX与端粒之间NIS-Elements定义的交叉点。比例尺，10 微米。b条,**c（c）**，BJ显示与γH2AX、53BP1或两者共定位的端粒病灶的细胞百分比的量化(b条)和RPE(**c（c）**)FAP-TRF1细胞24 5小时后最小DL或2.5 百万KBrO_三治疗。误差条表示三个独立实验的平均值±标准差，其中每个实验的每个条件分析了50多个核。通过双向方差分析确定统计显著性（ns，不显著**P（P）* < 0.05; ***P（P）* < 0.01; ****P（P）* < 0.001). 源数据

**图5。8oxoG直接干扰端粒复制。**
一,b条，BJ FAP-TRF1 p53ko细胞中期染色体的末端FISH染色的代表性图像24 未处理后h(一)或5 最小DLb条，对端粒无信号末端（黄色箭头）和易碎端粒（绿色箭头）的图像进行评分。绿色病灶是端粒，粉红色病灶是CENPB着丝粒。比例尺，10 μm。**c（c）**,d日，BJ每中期端粒无信号染色单体末端的数量(**c（c）**)和RPE(d日)FAP-TRF1细胞。**e（电子）**,**（f）**，BJ每中期脆性端粒的数量(**e（电子）**)和RPE(**（f）**)FAP-TRF1细胞。对于**c–f**，误差条表示平均值±标准偏差n个 = 71（UT）和72（DL 5 BJ和n个 = 61（UT）和63（DL 5 min）对于RPE，从三个独立实验中分析中期，标准化为染色体数。双尾Mann–Whitney的统计分析（ns，不显著***P（P）* < 0.01; *****P（P）* < 0.0001).克，p53ko RPE FAP-TRF1细胞（Top）的MiDAS实验示意图，以及Telo PNA（绿色）和EdU染色（红色）的代表性中期扩散。箭头指向端粒MiDAS。比例尺，10 微米。小时，单个染色单体（BIR）和两个染色单体的EdU事件示意图。DL处理的RPE FAP-TRF1细胞的代表性图像如下所示。我端粒MiDAS在单个染色单体（左）或两个染色单体上发生。对端粒PNA染色单体末端染色阳性（Telo+）或阴性（Telo-）的事件进行评分。误差线表示51（UT）和61（DL 10）的平均值±标准偏差 min）两个独立实验的中期。单因素方差分析的统计分析（ns，不显著*****P（P）* < 0.0001). 源数据

**图6。复制细胞对端粒8oxoG更敏感。**
一，示意图显示了S期细胞的EdU标记实验。0后BJ FAP-TRF1细胞γH2AX（红色）和EdU（绿色）染色的代表性图像 h从5恢复最小DL。比例尺，10 微米。b条,**c（c）**、BJ每个EdU和EdU+细胞的γH2AX焦点数量(b条)和RPE(**c（c）**)FAP-TRF1细胞。误差条表示所示的平均值±s.dn个从两个独立的实验中分析的核数。单因素方差分析的统计分析（ns，不显著****P（P）* < 0.001; *****P（P）* < 0.0001).d日，端粒DDR检测实验示意图（顶部，**e（电子）**,**（f）**)和衰老分析（β-gal和增殖）（底部，克和扩展数据图10d）在复制（用10%FBS（+FBS）生长的细胞）和非复制（用0.1%FBS（–FBS）培养的细胞）BJ FAP-TRF1细胞中。**e（电子）**，端粒DDR实验的典型IF/FISH图像。比例尺，20 微米。**（f）**，具有一到三个或四个或更多DDR+（γH2AX、53BP1或两者）端粒的细胞百分比**e（电子）**.每个实验每个条件分析70多个核。克，细胞接种在含有0.1%（–）或10%（+）FBS的培养基中，第二天用5 最小DL，然后恢复24 用0.1（–）或10%（+）FBS培养h。所有细胞在10%FBS培养基中培养，另外4个 β-gal活性染色前天。每个实验每个条件下至少分析300个细胞。对于**（f）**,克，误差条表示黑色圆圈表示的独立实验数量的平均值±标准差。通过双向方差分析确定统计显著性（ns，不显著**P（P）* < 0.05; ***P（P）* < 0.01; *****P（P）* < 0.0001). 源数据

**图7。端粒8oxoG诱导衰老模型。**
在内源性或外源性应激源诱导活性氧后，端粒容易受到DNA氧化损伤，包括常见损伤8oxoG的形成。当复制叉在端粒中遇到8oxoG时，它可能会停滞，导致过多的ssDNA，导致复制压力。复制应激可导致端粒脆性、局部DDR信号转导和端粒MiDAS修复。端粒DDR导致p53激活，从而促进细胞衰老，包括多种特征标志。想象一下用BioRender.com创建。

**扩展数据图1。FAP-TRF1表达细胞中端粒8oxoG诱导的确认。**
(一)通过抗mCER染色（红色）和telo-FISH（绿色）观察表达FAP-TRF1的BJ（顶面板）和RPE（底部）克隆中FAP-mCER-TRF1与端粒共定位的代表性图像。比例尺=10μm。(b条)具有和不具有FAP-mCER-TRF1表达的hTERT BJ和RPE细胞的全细胞提取物中TRF1的免疫印迹。TRF1抗体检测外源性和内源性TRF1，而mCER抗体仅检测外源性。(**c（c）**)如（图1a）所示，端粒病灶处YFP-XRCC1信号强度的量化归一化为CFP信号。方框图表示中值和第25至75个百分位，胡须表示1^标准时间至99个百分点。数据来源于所示n个分析的病灶数量。通过单因素方差分析进行统计分析（ns=不显著，*p < 0.05，***p < 0.001). (d日)通过未处理细胞的直接mCer可视化（UT）或10来量化每个细胞的FAP-mCer-TRF1病灶数量（#）染色+光照后min（DL 10'）。误差线表示所示的平均值±标准偏差n个分析的核数。通过双尾t检验进行统计分析（p值不显著）。(**e（电子）**)10天后每个核YFP-XRCC1阳性端粒百分比的定量最小染料+光，预处理100 微米NaN_三用于15 在光照（NaAz）或无预处理（-）前。误差线表示所示的平均值±标准偏差n个分析的核数。通过双尾t检验进行统计分析（**p < 0.01）。**（f，g）**端粒中8oxoG的检测。从RPE中分离的基因组DNA(**（f）**)和BJ(克)未经处理的FAP-TRF1细胞，5或20 最小染料+光或40 百万KBrO_三，用FPG糖苷酶处理，然后用S1核酸酶（+）或不（-）处理。用PFGE分离完整和断裂的端粒限制性片段，并用Southern印迹法检测端粒。氖 = UT细胞无酶处理参考。(小时)计算切割端粒的百分比，并将其标准化为UT样本，以量化端粒切割的倍数变化。对于RPE，使用-S1和+S1之间的差异，并将其归一化为UT细胞。源数据

**扩展数据图2。损伤诱导的生长减少和衰老表型的特征。**
(一)从指示的治疗恢复4天后，获得额外RPE FAP-TRF1克隆（#18）的细胞计数。(b条)与未处理相比，从染料+光照处理恢复4天后，RPE FAP-TRF1（红色）和BJ FAP-TRF 1（蓝色）细胞的细胞计数。误差条表示三个独立实验的平均值±标准差。(**c-d公司**)亲代BJ-hTERT的细胞计数(**c（c）**)或RPE-hTERT(d日)从指定的处理中恢复4天后获得细胞。(**e（电子）**)表达HeLa和U2OS的FAP-TRF1克隆从5 与未处理相比，最小染料+光处理。黑色圆圈表示独立实验的数量。(**（f）**)用mCER IF（粉红色）和telo-FISH（绿色）显示的大量原代BJ细胞中FAP-mCER-TRF1蛋白与端粒共定位的代表性图像。(**g-h（克-小时）**)BJ细胞计数(克)或RPE(小时)FAP-TRF1细胞从2.5或10的处理1小时后恢复4天百万KBrO_三，对于BJ FAP-TRF1和50μM足叶乙甙（ETP）。(我)获得24个BJ或RPE FAP-TRF1细胞的细胞计数 5小时后恢复与未处理相比，最小染料+光处理。对于面板**a、 c-d公司**和**g-i公司**，误差条表示条形图中黑色圆圈表示的独立实验数量的平均值±标准差。通过单因素方差分析确定统计显著性（ns=不显著，**p < 0.01，***p < 0.001，****磅 < 0.0001). (j个)RPE FAP-TRF1细胞的流式细胞术图显示了基于EdU和丙碘染色的不同细胞周期阶段的门控24 未经处理或暴露于染料、光照、5'染料+光照后h，20 焦耳/米²UVC或2.5或10小时治疗毫摩尔KBrO_三. (k)从指示的治疗恢复4天后获得的β-半乳糖苷酶阳性BJ FAP-TRF1细胞的代表性图像（来自图1h-i）。比例尺=100μm。(我)核面积大小（μm²)BJ（蓝色）或RPE（红色）FAP-TRF1细胞在未经处理或5天后恢复最小染料+光。误差条表示所示的平均值±s.dn个分析的核数。双尾t检验的统计分析（***p < 0.001，****磅 < 0.0001). 源数据

**扩展数据图3。端粒8oxoG诱导的细胞质DNA的特征。**
(一)BJ和RPE FAP-TRF1细胞在5天后每100个细胞核中MN数量的定量最小染料+光，或一小时后用于BJ 2.5 百万KBrO_三。每个实验至少有300个细胞得分。(b条)5天后4天RPE FAP-TRF1细胞的代表性图像最小染料+光处理（与图2b相关）。第1、3-4和20行的比例尺=10μm 第2行为μm。(**c（c）**)面板中归一化为核区域的拉明B1和拉明A/C信号强度的量化(b条). 误差线表示所示的平均值±标准偏差n个分析的核数。通过双向方差分析进行统计分析（ns=不显著，***p < 0.0001). (d日)量化*LMNB1型*BJ FAP-TRF1细胞5、10或20天后的mRNA 最小染料+光，或一小时2.5或10 百万KBrO_三，相对于未治疗。(**e（电子）**)具有微核的BJ FAP-TRF1细胞的百分比的定量，其显示出总体核γH2AX染色，并且在5天后具有cGAS阳性微核最小染料+光或一小时2.5 百万KBrO_三治疗。对于面板一和**d-e公司**，误差条表示条形图中黑色圆圈表示的独立实验数量的平均值±标准差。通过双尾t检验确定统计显著性（面板一RPE）或单因素方差分析（面板一BJ和d日-**e（电子）**). （ns=不显著，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****磅 < 0.0001). (**（f）**)5天后4天RPE FAP-TRF1细胞的代表性图像 min染料+光照处理，并用着丝粒和端粒PNA进行FISH染色。白色方框放大MN。比例尺=10μm。源数据

**扩展数据图4。急性端粒8oxoG不会增加细胞凋亡或DNA双链断裂。**
(一)在指示的治疗4天后，BJ或RPE FAP-TRF1细胞对膜联蛋白V（AV）、碘化丙啶（PI）或两者均呈阳性的百分比。染料、亮光或染料+亮光为5 最小KBrO_三暴露时间为一小时。误差线表示三个独立实验的平均值±标准差。通过双向方差分析进行统计分析（*p < 0.05，****页 < 0.0001). (b条)所示处理4天后，细胞膜联蛋白V（y轴）和丙碘（x轴）染色的代表性散点图。(**c（c）**)琼脂糖塞细胞的PFGE和未经处理或0或24后的BJ和RPE FAP-TRF1细胞基因组DNA的SybrGreen染色从5恢复h 最小染料+光处理。1或10次治疗1小时毫米高₂O（运行）₂，或40 百万KBrO_三，用作阳性对照。源数据

**扩展数据图5。8oxoG诱导DDR信号转导和p53激活。**
(一)染色、光照或DL 5天后4天BJ FAP-TRF1细胞磷酸化RB的免疫印迹最小值(**b、 c（c）**)BJ的免疫印迹(b条)和RPE(**c（c）**)FAP-TRF1细胞3 5小时后最小DL。用ATMi KU55933（10 μM）或KU60019（1 μM）或二甲基亚砜。箭头表示非特定带。(**d、 e（电子）**)RPE基因表达变化的火山图(d日)和BJ(**e（电子）**)FAP-TRF1细胞24 染色+光照后小时。每个点都是一个基因，红点的表达显著上调或下调。HeLa细胞无明显变化。用DEseq2进行分析。(**f、克**)RPE中的基因表达分析(**（f）**)和BJ(克)FAP-TRF1细胞24 染色+光照后小时，作为染色体位置的函数。每个点都是10 kb-bin，红线=平均值。(小时)指示治疗4天后野生型和p53ko RPE FAP-TRF1细胞计数。误差条表示三个独立实验的平均值±标准差。(我)用10 mM（RPE）或2.5 mM（BJ）KBrO_三. (**j、 k个**)p16 mRNA的qPCR分析(*CDK2NA公司*)和p21 mRNA(*CDK1NA）*在BJ FAP-TRF1细胞中，治疗4天后。对于面板**i-k公司**，误差条表示黑色圆圈表示的独立实验数量的平均值±标准差。通过单因素方差分析进行统计分析（*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001). (我)用IF定量BJ和RPE FAP-TRF1细胞中p53蛋白信号强度3 5小时后最小DL或20 μM螺母。(米)通过IF分析小组处理的细胞中每个细胞的53BP1焦点(l）用IF检测p53信号强度来确定p53的表达（+）。对于面板我和米，误差条表示所示的平均值±标准差n个从两个独立的实验中分析的核数。单因素方差分析的统计分析(我)或双向方差分析(米)（ns=不显著，***p < 0.001，****磅 < 0.0001). 源数据

**扩展数据图6。端粒8oxoG增加非复制细胞中p53依赖性p21的表达。**
(**a-c公司**) 23 治疗后小时，野生型和p53ko RPE FAP-TRF1(b条)和BJ FAP-TRF1(**c（c）**)用EdU对细胞进行1次脉冲处理小时，然后通过显微镜分析p21和EdU染色。在每种情况下，细胞被分类为EdU+或–群体，并绘制核p21信号强度图。面板中显示了典型的IF图像一，比例尺=10μm。数字n个显示了来自两个独立实验的针对每种条件分析的细胞的数量。Tukey方框图显示中位数（bar），平均数（+），25^第个至75^第个四分位范围（IQR），晶须显示25^第个或7^第个百分位±1.5x IQR。通过双向方差分析分析数据（**p < 0.01，****页 < 0.0001). 源数据

**扩展数据图7。氧化损伤诱导的端粒DDR可见于间期和中期染色体。**
(**a-b公司**)BJ显示0、1–3或≥4个端粒病灶与γH2AX、53BP1或两者共存的细胞百分比(一)和RPE(b条)FAP-TRF1细胞24 不治疗或5小时后最小DL。误差条表示由黑圈表示的独立实验数量的平均值±标准差，其中每个实验在每个条件下分析了50多个核。通过双向方差分析进行统计分析（*p < 0.05，***p < 0.001). (**c（c）**)图4显示了每个实验中端粒≥4γH2AX或53BP1阳性的细胞百分比，并进行了汇总。数据为三个独立实验的平均值，误差线为±标准偏差。(**d、 e（电子）**)显示端粒焦点与γH2AX、53BP1或两者共同定位的BJ细胞百分比(d日)和RPE(**e（电子）**)FAP-TRF1细胞5天后4天最小染料+光（DL 5'）或2.5 百万KBrO_三治疗。误差条表示由黑圈表示的独立实验数量的平均值±标准差，其中每个实验在每个条件下分析了50多个核。通过双向方差分析进行统计分析（*p < 0.05，**p < 0.01，****页 < 0.0001）。(**（f）**)RPE FAP-TRF1细胞24 meta-TIF染色体扩散的代表性图像 5小时后用DAPI（蓝色）对γH2AX（红色）、端粒PNA（绿色）和DNA进行min染料+光染色。比例尺=10μm。(克)γH2AX阳性染色单体末端缺失端粒染色或与端粒PNA共定位的meta-TIF分析定量 + ) 通过telo-FISH，如所示(**（f）**). 误差条表示平均值±标准偏差n个 = 每种情况分析33个中期。(小时)通过IF和telo-FISH对位于染色单体末端（端粒）与内部（非端粒）位置的γH2AX病灶分布的meta-TIF分析进行定量，如面板所示(**（f）**). 源数据

**扩展数据图8。急性端粒8oxoG损伤不会导致端粒缩短或保护蛋白丢失。**
(一)从BJ和RPE FAP-TRF1中获得的端粒限制性片段长度分析的Southern blot在未经治疗（UT）或5天后恢复 min染料单独（D）、光单独（L）或染料+光（DL）一起。(b条)从BJ和RPE FAP-TRF1中获得的TeSLA，在未经治疗（UT）或5天后恢复最小染料+光。每条通道都是来自同一基因组DNA池的独立PCR。最短20个端粒的平均长度^第个端粒长度小于1.6的百分数和百分比两个独立实验的kb如下所示。(**c（c）**)p53ko BJ（蓝色）和RPE（红色）FAP-TRF1细胞的两个着丝粒焦点双着丝粒染色体的量化24 5小时后最小染料+光。(d日)5天后4天通过端粒FISH测量BJ（蓝色）和RPE（红色）FAP-TRF1细胞的端粒焦点的定量最小染料+光。对于面板**c-d公司**，误差条表示所示的平均值±s.dn个中期数(**c（c）**)或焦点(d日)分析。通过单因素方差分析进行统计分析，所有p值均无显著性。(**e（电子）**)未经治疗（UT）或10天后野生型RPE FAP-TRF1细胞中FAP-mCER-TRF1每个端粒病灶mCER信号强度的定量最小染料+光（DL 10’）。方框图显示中值和25^第个至75^第个四分位范围，胡须显示1^标准时间至99^第个百分位数。通过单因素方差分析进行统计分析，所有p值均无显著性。(**f、克**)5后立即用IF和telo-FISH分析TRF2与端粒的共定位最小染料+光。DDR公司 + 通过γH2AX共定位鉴定端粒。BJ中γH2AX的TRF2信号强度在每个端粒病灶中被量化–或+(**（f）**)和RPE(克)FAP-TRF1细胞。Tukey方框图显示中位数（bar），平均数（+），25^第个至75^第个四分位范围（IQR），晶须显示25^第个或7^第个百分位±1.5x IQR。统计分析由Kruskal-Wallis完成（ns=无显著性，***p < 0.001，****磅 < 0.0001). 源数据

**扩展数据图9。端粒8oxoG诱导DDR的时间进程。**
(一)来自未处理（UT）BJ FAP-TRF1和用5处理的细胞的磷酸化Chk1（S317）和H2AX（γH2AX）的免疫印迹最小染料+光，并恢复到指定的时间。紫外线 = 20 焦耳/米²UVC。(b条)γH2AX（红色）和EdU（绿色）的代表性IF图像，共24张 h恢复（23 h新鲜介质+1 h EdU媒体）。比例尺=10μm。(**c（c）**)（顶部）示意图显示5天后S期BJ FAP-TRF1细胞的EdU标记实验最小染料+光照和总恢复时间。收获前一小时，在X h指示的恢复时间后，用EdU对细胞进行脉冲处理。（底部）核γH2AX总强度，如所示(b条)用于各种总恢复时间点的EdU+和EdU-电池。误差线表示所示数字的平均值±标准差n个检查了个细胞核。通过单因素方差分析进行统计分析（ns=不显著，*p < 0.05，****页 < 0.0001). (**d-f型**)每个核与γH2AX、53BP1或两者共同定位的端粒数量（DDR + ) 在BJ FAP-TRF1细胞中未经处理或5天后最小染料+光和0 h、 3个 h、 24个 h或4天恢复。误差线表示所示数字的平均值±标准差n个检查了个细胞核。Kruskal-Wallis的统计分析（ns=不显著，*p < 0.05，***p < 0.001，****磅 < 0.0001). 源数据

**扩展数据图10。抑制FBS缺陷培养基中培养细胞的复制和p53激活。**
(一)BJ FAP-TRF1细胞在指定FBS浓度下生长并经过指定处理后的典型亮场图像。比例尺=100μm。(**b、 c（c）**)EdU阳性细胞的定量(b条)和Cyclin A核信号(**c（c）**)在BJ FAP-TRF1细胞中24 指定处理后数小时，并在10%FBS中恢复( + ) 或0.1%FBS（-），如主图6d上部面板所示。误差条表示黑色圆圈表示的独立实验数量的平均值±标准差。通过单因素方差分析进行统计分析（**p < 0.01，****页 < 0.0001）。面板内**（c）**显示了-FBS细胞相对于+FBS细胞的显著性。(d日)按照主图6d下部面板中的描述处理细胞，并在将所有细胞培养基更换为10%FBS培养基后4天进行计数。数据是相对于相应未处理对照的细胞计数。误差条表示黑色圆圈表示的独立实验数量的平均值±标准差。双尾t检验的统计分析（***p < 0.001). (**e（电子）**)细胞在10%FBS中培养( + ) 或0.1%FBS（-），如主图6d，上面板，但采集用于免疫印迹3 治疗后h。溴酸钾_三（KB，2.5 mM）和依托泊苷（50 μM）为1 h个处理，3个 h恢复。低于p53和pChk2印迹的数字代表正常的蛋白质表达。源数据

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1. Hayflick L，Moorhead PS。人类二倍体细胞株的系列培养。实验单元。1961年决议；25:585–621. doi:10.1016/0014-4827（61）90192-6。-内政部-公共医学
1. Bodnar AG等人。通过将端粒酶引入正常人类细胞来延长寿命。科学。1998;279:349–352. doi:10.1126/science.279.5349.349。-内政部-公共医学
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