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.2022年5月13日；12(9):4110-4126.
doi:10.7150/thno.71392。 eCollection 2022年。

Wnt4通过磷酸化JNK/JNK调节间质-内皮细胞转换，对心脏修复至关重要

Wenyan Dong公司 1, 岳照 1, 大强文 1, 林英炯 1, 崔曾（Chui Zeng） 1, 顾景凯 1, 范廖 2, 李瑞琪（Ruiqi Li） 1, 徐章 1, 王殿良 三, 蔡文倩 1, 段金珠 1 2
附属公司

Wnt4通过磷酸化JNK/JNK调节间质-内皮细胞转换，对心脏修复至关重要

Wenyan Dong公司等。 治疗诊断科技. .

摘要

理性：Wnt4在发育中起关键作用，并在纤维化损伤期间重新激活；然而，Wnt4在心脏修复中的作用尚不清楚。在本研究中，我们的目的是阐明Wnt4在急性心肌缺血再灌注损伤后的病理生理作用和机制。方法和结果：我们研究了急性心脏缺血再灌注损伤后Wnt4的时空表达，发现Wnt4作为损伤边缘区附近心脏成纤维细胞的早期损伤反应基因上调，并与间质-内皮细胞转化（MEndoT）、，在心脏修复中对受损心肌进行血运重建的有益过程。使用ChIP测定和在体外和体内我们证明Wnt4在MEndoT期间是p53的一个重要下游靶基因。心脏成纤维细胞中Wnt4的敲除导致MEndoT降低和心功能恶化。相反，心脏成纤维细胞中Wnt4过表达通过磷酸化JNK/JNK信号通路诱导这些细胞中的MEndoT；然而，p53和Wnt4蛋白水平均依赖于β-catenin信号通路。JNK激活在MEndoT的诱导中起着关键作用，并且对Wnt4调节的MEndoT至关重要。此外，Wnt4在心脏成纤维细胞中的过度表达通过减少纤维化和增加MEndoT和血管密度，挽救了因p53基因缺失而导致的心脏功能恶化。结论：我们的研究表明Wnt4在心脏修复中起着关键作用，参与磷酸化JNK介导的MEndoT，并且是心脏病心脏成纤维细胞靶向治疗的关键基因。

关键词：心脏缺血再灌注损伤；Wnt4；心脏成纤维细胞；间质-胚层转变（MEndoT）；第53页。

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竞争利益：作者声明不存在竞争利益。

数字

图1
图1
急性缺血再灌注损伤后心脏成纤维细胞Wnt4上调。(A类)24小时内从整个心脏组织分离的心脏成纤维细胞中Wnt4和内皮细胞标记基因的qPCR分析，n＝4。(B类)I/R损伤后第3天早期从左心室心肌组织中分离的心脏成纤维细胞中Wnt4和内皮细胞标记基因的qPCR分析，n=4。(C-D公司)在I/R损伤后24小时内从左心室心肌组织分离的心脏成纤维细胞中Wnt4和内皮细胞标记基因的Western blot和密度定量，n=4。(E类)qPCR分析分别在24小时内从远端和近梗死心肌分离的心脏成纤维细胞Wnt4和内皮细胞标记基因，n=4。(F类)Col1a2-CreERT:R26R心脏切片损伤边缘区Wnt4的免疫荧光染色td番茄小鼠假手术或I/R损伤后的定量，n=4。(G公司)损伤边缘区td番茄、Wnt4和VECAD的三重免疫荧光染色及定量，n=4。（所有图表均显示平均值±S.E.M*第页< 0.05, **第页< 0.01, ***第页< 0.001, ****第页<0.0001，与假手术组相比，使用单向方差分析和双向方差分析。荧光团的颜色化用箭头表示。比例尺：10µm）。
图2
图2
p53通过直接靶向Wnt4启动子区域来调节MEndoT。(A类)血清饥饿后心脏成纤维细胞Wnt4和内皮细胞标记基因的qPCR分析，并用RITA（p53激活剂，50µM）和pifithrin-α（p53抑制剂，50μM）治疗，n=4。(B类)血清缺乏的心脏成纤维细胞上p53的染色质免疫沉淀（ChIP）测序表明Wnt4启动子区是p53的直接结合位点。(C)p53 ChIP后Wnt4的ChIP-qPCR检测，n=3。(D类)Wnt4敲除后，RITA增强的MEndoT被抑制，n=4。（所有图表均显示平均值±S.E.M*第页< 0.05, **第页< 0.01, ***第页<0.001，使用非配对t检验、单向方差分析和双向方差分析）。注：FBS（胎牛血清）、RITA（p53活化和肿瘤凋亡诱导）。
图3
图3
Wnt4击倒导致MEndoT下调。(A-C公司)Wnt4 shRNA慢病毒转导后心脏成纤维细胞基因表达的qPCR分析，n=4。(A类)重量4。(B类)内皮细胞标记基因和血管生成相关基因。(C)成纤维细胞标记基因和原纤维细胞基因。(D类)Matrigel上毛细管的形成和定量，n=3，比例尺：750µm。(E类)Ac-LDL摄入量和定量，n=5，比例尺：200µm。（所有图表均显示平均值±S.E.M*第页< 0.05, **第页< 0.01, ***第页<0.001，使用非配对t检验、单向方差分析和双向方差分析，荧光灯用箭头表示。）注：Angpt1（血管生成素1）、α-SMA（肌动蛋白-α2，平滑肌，主动脉）、CD31（Pecam1，血小板和内皮细胞粘附分子1）、Cdh2（钙粘蛋白2）、Cthrc1（胶原三螺旋重复序列包含1）、eNOS（一氧化氮合酶3）、IL-34（白细胞介素34）、Pdgfd（血小板衍生生长因子D）、Postn（骨膜炎素）、，Sparc（分泌的富含半胱氨酸的酸性糖蛋白）、TGF-β1（转化生长因子β1）、VECAD（钙粘蛋白5）。
图4
图4
MEndoT可由Wnt4过度表达诱导。心脏成纤维细胞用Wnt4慢病毒转导，并在10%FBS细胞培养条件下培养。(A类)Wnt4和内皮细胞标记物的qPCR分析，n=3。(B类)Matrigel上毛细管的形成和定量，n=3，比例尺：750µm。(C)Ac-LDL摄入量和定量，n=5，比例尺：200µm。（所有图表均显示平均值±S.E.M*第页< 0.05, **第页< 0.01, ***第页<0.001，使用非配对t检验和双向方差分析，荧光灯用箭头表示。）
图5
图5
Wnt4通过p-JNK/JNK信号通路诱导MEndoT。(A类)心脏成纤维细胞中Wnt4过度表达诱导MEndoT并添加β-连环蛋白抑制剂IWR-1-endo（50µM）和p-JNK/JNK途径抑制剂SP600125（50μM）后基因表达的qPCR分析。(B-D公司)心脏成纤维细胞的Western blot及其定量。（所有图表均显示平均值±S.E.M*第页< 0.05, **第页< 0.01, ***第页< 0.001, ****第页<0.0001，n=4，使用非配对t检验、单向方差分析和双向方差分析。）
图6
图6
JNK的激活对于Wnt4蛋白诱导的MEndoT至关重要。(A类)Western blot分析加入茴香霉素（JNK激活剂，25nM）24h、48h和72h后心脏成纤维细胞中p-JNK、JNK，VECAD和Occludin的表达，并进行定量。n=4。(B类)在加入重组MAP2K7（JNK激酶，80ng/mL）6小时、12小时和24小时后，对心脏成纤维细胞中p-JNK、JNK、VECAD和Occludin的表达进行蛋白质印迹分析，并进行定量。n=4。(C)Western blot分析心脏成纤维细胞中p-JNK、JNK1、JNK2、VECAD和Occludin的表达，并进行量化。通过pCLenti-shRNA-病毒的转导，JNK1或JNK2在心脏成纤维细胞中被敲除。通过添加重组Wnt4（20 ng/mL）72 h诱导MEndoT。n=4。（所有图表均显示平均值±S.E.M*第页< 0.05, **第页< 0.01, ***第页< 0.001, ****第页<0.0001，n=4，使用非配对t检验和单向方差分析。）
图7
图7
心肌成纤维细胞Wnt4的上调对缺血再灌注损伤后的心脏功能至关重要。Col1a2-CreERT和Col1a2-CreERT:R26Rtd番茄给药pAAV-CGB-DIO-Wnt4-miR30shRNA-WPRE病毒（pAAV-CGB-DIO-EGFP-Scramble-miR30shRNA-WPRE病毒作为干扰控制）和三苯氧胺后，小鼠出现假损伤或I/R损伤。(A类)心脏损伤后第7天，24小时内从全心脏分离的心脏成纤维细胞中Wnt4和内皮细胞标记基因的Western blot和密度定量，n=4只动物/组。(B至C)心脏成纤维细胞Wnt4敲除后损伤边缘区tdTomato、Wnt4和VECAD的三重免疫荧光染色和定量，n=3只动物/组，比例尺：10µm。(D类)超声心动图M型的代表性图像。(E类)通过超声心动图检测心脏功能，n=7只动物/组。(F类)通过图像J对心脏组织进行Masson’三色染色并量化纤维化区域，n=7只动物/组。(G公司)isolectin B4的免疫荧光染色用于血管密度，并通过Image J和AngioTool进行量化，n=4只动物/组，比例尺：20µm。（所有图表均显示平均值±S.E.M*第页< 0.05, **第页< 0.01, ***第页<0.001，使用非配对t检验和双向方差分析，荧光团的颜色化用箭头表示。）
图8
图8
心肌成纤维细胞中Wnt4的过度表达挽救了缺血再灌注损伤后心脏成纤维细胞p53缺失导致的心脏功能恶化。Col1a2-CreERT:p53 CKO小鼠在服用pAAV-CMV-DIO-Wnt4-3xFLAG-WPRE病毒（pAAV-CMC-DIO-EGFP-3xFLAG-WPRE病毒作为对照）和三苯氧胺后受到假损伤或I/R损伤。(A类)示意图显示p53敲除和Wnt4过度表达第1a2列+心脏成纤维细胞。(B类)Western blot检测心脏I/R损伤后第7天24小时内从整个心脏分离的心脏成纤维细胞中的p53、Wnt4和内皮细胞标记物，并进行密度定量，n=4只动物/组。(C-D公司)损伤边界区tdTomato、Wnt4和VECAD的三重免疫荧光染色及其定量，n=4只动物/组，比例尺：10µm。(E类)超声心动图M型的代表性图像。(F类)超声心动图分析心脏功能，p53+/+组n=7只动物，p53-/-n=10组动物，p53-/-/Wnt4组n=10只动物。(G公司)心脏组织的Masson三色染色和通过图像J定量纤维化区域，n=7只动物/组。（H） 通过Image J和AngioTool对isolectin B4进行免疫荧光染色，以检测血管密度和量化，n=6只动物/组，比例尺：20µm。（所有图表均显示平均值±S.E.M*第页< 0.05, **第页< 0.01, ***第页< 0.001, ****第页<0.0001，使用单向方差分析和双向方差分析）。注：p53+/+是p53接触小鼠，p53-/-是心脏成纤维细胞中含有p53 CKO的小鼠，p53-/-/Wnt4是p53 CKO小鼠，但Wnt4在心脏成纤维细胞中过度表达。
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