Calreticulin Shortage Results in Disturbance of Calcium Storage, Mitochondrial Disease, and Kidney Injury

doi:10.3390/cells11081329

.2022年4月13日；11(8):1329.

doi:10.3390/cells11081329。

钙网蛋白缺乏导致钙储存障碍、线粒体疾病和肾脏损伤

附属公司

¹巴基斯坦拉合尔市旁遮普大学生物科学学院，邮编53700。
²德国哥廷根大学医学中心哥廷根临床化学研究所UMG实验室，Robert-Koch-Strasse 40，37075。
^三肾脏病和风湿病诊所，德国哥廷根大学医学中心，Robert-Koch-Strasse 40，37075。
⁴德国哥廷根大学医学中心病理学系，Robert-Koch-Strasse 40，37075。
⁵职业医学和健康安全部，德国邮政股份有限公司，德国卡塞尔34117号Kölnische Strasse 81。
⁶德国哥廷根大学医学中心血液学和肿瘤学系，哥廷根Robert-Koch-Strasse 40，37075。
⁷埃及亚历山大市亚历山大大学科学院动物学系，邮编：21568。
⁸德国哥廷根大学医学中心神经变性生物结构成像中心（BIN），37075哥廷根。

PMID： 35456008
PMCID公司： PMC9025518
内政部： 10.3390/单元11081329

钙网蛋白缺乏导致钙储存障碍、线粒体疾病和肾脏损伤

阿西玛·塔伊布等人。细胞. 2022.

.2022年4月13日；11(8):1329.

doi:10.3390/cells11081329。

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¹巴基斯坦拉合尔市旁遮普大学生物科学学院，邮编53700。
²德国哥廷根大学医学中心哥廷根临床化学研究所UMG实验室，Robert-Koch-Strasse 40，37075。
^三肾脏病和风湿病诊所，德国哥廷根大学医学中心，Robert-Koch-Strasse 40，37075。
⁴德国哥廷根大学医学中心病理学系，Robert-Koch-Strasse 40，37075。
⁵职业医学和健康安全部，德国邮政股份有限公司，德国卡塞尔34117号Kölnische Strasse 81。
⁶德国哥廷根大学医学中心血液学和肿瘤学系，哥廷根Robert-Koch-Strasse 40，37075。
⁷埃及亚历山大市亚历山大大学科学院动物学系，邮编：21568。
⁸德国哥廷根大学医学中心神经变性生物结构成像中心（BIN），37075哥廷根。

PMID： 35456008
PMCID公司： PMC9025518
内政部： 10.3390/单元11081329

摘要

肾钙²⁺再吸收在全身钙的微调中起着核心作用²⁺平衡。在这里，我们确定钙网蛋白（Calr）是钙缺乏的一个环节²⁺肾脏中的处理表明Calr缺乏会导致线粒体疾病和肾脏发病。我们证明了Calr^+/-小鼠表现出慢性生理性低水平Calr，这与肾小球硬化和肾小管间质损伤表现的进行性肾损伤有关。我们发现Calr^+/-肾细胞受到功能活性钙储存紊乱和钙减少的影响²⁺存储容量。因此，肾细胞表现出钙的异常激活²⁺信号转导和NF-κB通路，导致炎症和广泛进行性肾损伤。有趣的是，Ca中的扰动²⁺Calr中的稳态和信号转导^+/-肾小白鼠细胞引发了严重的线粒体疾病和异常的有丝分裂，导致了高水平的氧化应激和能量短缺。这些发现为Calr在肾钙处理、功能和发病机制中的作用提供了新的机制性见解。

关键词：自噬；钙信号；钙贮存；钙网蛋白；肾纤维化；线粒体疾病；氧化应激。

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利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1
Calr的渐进性结构改变^+/−老鼠。(一)：肾脏结构研究的实验设计插图。(B类)：Calr中Calr丰度的Western blot分析^+/+和Calr^+/−小鼠肾脏显示Calr在Calr中的表达减少>50%^+/−小鼠肾脏。石蜡包埋肾脏切片（3µm）用PAS染色，以比较Calr的肾脏结构^+/+和Calr^+/−15周龄、30周龄和40周龄（**：第页< 0.01). (C类)：Calr PAS染色切片的代表性肾小球^+/+和Calr^+/−小鼠（放大×40）；上条形图显示30周龄和40周龄Calr肾脏中mGA增加^+/−小白鼠与小白鼠的比较^+/−和Calr^+/+同龄小鼠(第页< 0.05). 下条形图显示40周龄Calr的mMA显著增加^+/−小鼠与幼Calr的比较^+/−15周龄和30周龄小鼠和Calr^+/+同龄小鼠。所示数据为平均值±SE(n个=每组30个肾小球，第页< 0.05). PAS：碘酸-席夫；mGA：平均肾小球面积；mMA：系膜平均面积。(D类)：用不同方法对40周龄小鼠肾脏进行染色的肾脏切片证实Calr的晚期肾损伤^+/−老鼠。(E类)：Fin和Lam的Western blot分析显示在Calr中高表达^+/−小鼠肾脏与Calr的比较^+/+条形图表示Western blot结果的量化，如(E类), (n个= 4. ***:第页<0.001，ns：无显著性，第页> 0.05).β-肌动蛋白（Actb）作为负荷控制。(F类)：Calr肾脏切片的代表性图像^+/+和Calr^+/−用抗纤维连接蛋白（Fin1）和层粘连蛋白抗体对小鼠肾脏切片进行染色。(**G公司**)：抗I型胶原抗体免疫荧光染色，Calr肾切片MTC染色^+/+和Calr^+/−老鼠。染色显示Calr中纤维连接蛋白、层粘连蛋白和胶原表达显著增加^+/−肾。(**H（H）**)：40周龄Calr的肾脏切片^+/+和Calr^+/−用电子显微镜观察小鼠。GBM：肾小球基底膜；BB：画笔边界；TJ：紧密连接。

图2
Calr中低水平Calr的影响^+/−小鼠肾脏对内质网应激标志物和EF手部Ca2表达的影响⁺-结合蛋白。(一)：免疫组织学和Western blot的实验设计说明。(B类,C类)：内质网应激标记物Grp78、Erp57、Canx、Chop和p-eIF-2A的Western blot分析和免疫组织化学染色显示，Calr^+/+和Calr^+/−小鼠肾脏；Actb用作加载控制。下图：条形图表示Western blot结果的量化，如(B类) (n个= 4. *:第页< 0.05). (D类,E类)：一些ER-hand Ca的Western blot分析和免疫组织化学染色²⁺-结合蛋白Pvalb、Calb1、Calm1和S100A4在Calr中表达显著上调^+/−肾脏与Calr的比较^+/+下图：条形图表示Western blot结果的量化，如(D类) (n个= 4. *:第页< 0.05, **:第页< 0.01, ***:第页< 0.001). 40周龄Calr中显示Grp78、Pvalb、Calm1和Canx的免疫组织化学染色^+/−和Calr^+/+小鼠肾脏切片。

图3
钙的表达是钙处理激素控制的基础，对钙很重要²⁺平衡。(一)：钙测量和免疫印迹的实验设计说明。(B类)：用PTH或VD3处理MDCK细胞，或两者同时处理，并用Western blot分析监测Calr的表达。与其他内质网应激标记物相比，经PTH或VD3处理后，Calr的表达显著下调。(C类)：从小鼠肾脏分离的原代细胞（Calr^+/+和Calr^+/−)用甲状旁腺素治疗，并用Western blot监测Calr的表达。PTH治疗后Calr显著下调。(D类)：340 nm和380 nm激发下Fura-2荧光发射强度的比值（340/380）与细胞内（Ca²⁺). 绘制了Fura-2 340/380排放比与测量时间的关系曲线。(我)：Calr的Fura-2 340/380排放比平均值^+/+肾原代细胞(n个=20）和校准^+/−肾脏原代细胞随时间变化。来自Calr的三种代表性肾小管原代细胞的Fura-2 340/380发射比^+/+或Calr^+/−用ATP（5µM）处理的小鼠(二)，Thapsigargin（1µM）(三)或电离层A23187（1µM）(四、). (E类)：差异调节蛋白的分类（2D凝胶分析）是通过将与细胞成分和生物过程相对应的GO识别号与调节蛋白相关联来实现的。图中的值显示了在相应类别中发现的蛋白质的比率分布，（左）根据其细胞成分分类的已识别蛋白质，（右）根据其功能类别分类的线粒体蛋白质。(F类)：蛋白质组学数据的量化显示，蛋白质传感和钙转运到肾细胞的上调。(**G公司**)：Calr肾组织的免疫荧光染色^+/+和Calr^+/−带有Trpv5、Calb1、Ncx1和Casr抗体。(**H（H）**)：参与钙调节的蛋白质的表达改变，Western blot分析证实Ncx1上调和Trpv5下调。*：第页< 0.05, **:第页< 0.01, ***:第页< 0.001.

图4
Calr的线粒体改变^+/−小鼠肾脏。(一)：超微结构分析和比较蛋白质组研究的实验设计说明。(B类)：Calr的肾脏切片^+/+和Calr^+/−用电子显微镜观察小鼠。典型的电子显微镜图像显示Calr肾细胞线粒体严重受损^+/−老鼠。显微照片显示肿胀结构，嵴消失。(C类)：蛋白质组学数据显示Calr中参与氧化磷酸化和线粒体完整性的蛋白质显著下调^+/−小鼠肾脏。(D类)：右：Calr中下调蛋白的字符串分析^+/−小鼠肾脏。字符串图显示了下调蛋白之间的强烈相互作用。Calr氧化应激的诱导^+/−小鼠肾脏。左图：Calr中上调的蛋白质^+/−小鼠肾脏主要是核糖体蛋白、蛋白酶体蛋白和参与氧化磷酸化的蛋白。(E类)：2-DE特写区域，显示参与氧化应激的调节蛋白。(F类)Calr中Sod1的免疫组织化学和免疫荧光染色^+/−和Calr^+/+老鼠。Sod1的免疫荧光染色与泛素偶联。(**G公司**)：对Calr肾裂解物中的氧化应激相关蛋白（Sod1、Prdx6和Park7）进行Western blot分析^+/−和Calr^+/+老鼠。Actb用作加载控制。代表G中所示Western blot结果定量的条形图(n个= 4, *:第页< 0.05, **:第页< 0.01, ***:第页< 0.001).

图5
Calr线粒体蛋白的下调^+/−小鼠肾脏。(一)线粒体蛋白质的Western blot分析：来自Calr浓缩线粒体裂解液的Vdac1、Cyc和Cat^+/+和Calr^+/−肾组织。蛋白质表达的量化如条形图所示。(B类)：Vdac1和Cyc的免疫荧光染色显示蛋白表达明显下降；显微照片显示使用免疫金对Vdac1进行染色。(C类)：蛋白质组学数据的量化证实了所研究线粒体蛋白质的下调。(D类)：Cat与泛素的免疫荧光染色显示Calr肾小球中的表达增强，肾小管细胞中的核移位增强^+/−肾脏。(E类)：使用归一化光谱账户量化Cat表达，在Calr中Cat表达显著下调^+/−小鼠肾脏。(F类)：细胞色素c氧化酶活性定量。分离出完整的线粒体，用于细胞色素c氧化酶活性的定量。Calr和Calr呼吸活动的比较^+/−和Calr^+/+肾脏显示Calr的线粒体活性下降约50%^+/−肾细胞**第页<0.01, ***第页<0.001).

图6
Calr的严重线粒体损伤和自噬^+/−小鼠肾脏。(一)：Calr线粒体超微结构形态的代表性电子显微照片^+/−小鼠肾脏-(一,b条)远曲小管细胞肿胀，线粒体被膜结构包裹，部分线粒体处于自噬晚期；(**c（c）**–**e（电子）**)：被包裹在多膜结构中的受损线粒体正在经历自噬，也表现为线粒体几乎完全消失的晚期阶段；(**（f）**)：Calr中带有受损空泡状线粒体的足细胞，以红色星号突出显示^+/−小鼠肾脏。(B类)：Calr蛋白提取物的Western blot分析^+/+和Calr^+/−肾组织表现出Bcl-2的下调和Becn-1的上调，表明自噬的激活。(C类)：LC3的免疫荧光染色证实了自噬体的启动和形成。(D类)：用针对LC3的抗体进行的蛋白质印迹分析证实了Calr中向LC3-II的转变^+/−如比率LC3-II/LC3-I计算所证明的。(E类)蛋白质组分析显示Atg3上调，Atg3在Calr自噬中起重要作用^+/−肾脏。结果以Western blot分析中相对强度的平均值±SD给出，或以蛋白质组数据中归一化光谱账户的平均值**给出：第页<0.01, ***:第页<0.001).

图7
Calr中PKA的激活和糖酵解^+/−肾。线粒体严重受损导致能源短缺。为了克服能量危机，Calr中的肾细胞^+/−小鼠激活糖酵解。(一)：上调Slc5a1 a钠/葡萄糖协同转运蛋白1，积极将葡萄糖转运到细胞内，PcK1也上调，积极增加乳酸的葡萄糖合成。(B类)：烯醇化酶1也上调，有利于葡萄糖产生能量。(C类)：PKA显著上调和激活，以加速糖酵解并促进能量生成，重要的糖酵酵解激酶PFK在Calr中显著上调^+/−小鼠肾脏。(D类)：与糖酵解激活平行，参与磷酸肌酸产生替代能量的酶在Calr中也上调^+/−小鼠肾脏。数据（*：第页< 0.05) **:第页< 0.01, ***:第页< 0.001).

图8
慢性细胞溶质钙水平升高导致Calr PKC和NF-κB通路激活^+/−肾。(一)：活性测定显示Calr中PKC显著激活^+/−小鼠肾脏因胞浆钙浓度改变。(B类)：Calr蛋白质提取物的Western blot分析^+/+和Calr^+/−肾脏显示NF-κB通路激活，杂合子肾脏p65上调和通路抑制剂IkB下调证明了这一点。(C类,D类)p65的核转位证实了NF-κB通路的激活，核蛋白Lamin A/C作为对照。(E类)：对Calr的肾裂解物进行iNos的蛋白质印迹分析^+/−和卡尔^+/+老鼠。使用Actb作为负载控制。表示iNos的MM和DM定量的条形图。Western blot结果如所示(B类) (n个= 4 *,第页< 0.05, **:第页< 0.01, ***:第页< 0.001). MM：单体，DM：二聚体。(F类)iNos免疫组织化学染色显示Calr蛋白表达模式无明显变化^+/−与Calr相比^+/+. (**G公司**)蛋白质组学数据显示IL6st（白细胞介素6受体）上调，显示Calr中NF-κB通路激活的炎症增加^+/−小鼠肾脏。

图9
Calr肾组织血细胞浸润与炎症^+/−老鼠。(一)：显示结构分析和比较蛋白质组研究样品处理的实验设计插图。(B类)：组织化学染色显示Calr有强烈炎症^+/−肾组织。C类：电镜超微结构分析显示Calr的血细胞有强烈浸润^+/−肾组织。(D类,E类)蛋白质组学数据显示ECM蛋白显著上调，免疫荧光染色和电子显微镜分析显示，在Calr肾组织的间质区有强烈的EMC沉积^+/−小鼠。***：第页< 0.001.

**图10**
卡尔^+/−肾脏表现出抗GBM疾病。(一)：显示结构分析和比较蛋白质组研究样品处理的实验设计插图。(B类)：组织化学染色显示典型的强线性带状外观，显示抗GBM疾病。(C类)：免疫组织化学染色显示Calr的IgA、IgG、IgM阳性染色^+/−肾组织。(D类)：蛋白质组分析证实了所研究的三种蛋白质的上调。(E类)：Igkc、Iglc、C1q和C3c的染色模式相似，Calr呈阳性染色^+/−肾脏和Calr中几乎未检测到染色^+/+肾脏。(F类)：蛋白质组学数据证实了染色结果，并显示补体因子蛋白和轻链的上调。(**G公司**)：Calr的电子显微镜照片^+/−肾组织，显示系膜区电子致密沉积物。**：第页< 0.01, ***:第页< 0.001.

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