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.2022年3月8日；119（10）：e2114303119。
doi:10.1073/pnas.2114303119。 Epub 2022年3月1日。

通过其相互作用化合物去氨酸抑制突变型亨廷顿蛋白的毒性

海昆之歌 1 2, 岑王 1, 朱成钢 三, 王子英 1, 杨惠亚 1, 吴鹏（音） 1, 崔晓天 1, 胡安·博塔斯 4, 党永军 1, 于丁 1, 费一燕 三, 博逊路 1
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通过其相互作用化合物去氨酸抑制突变型亨廷顿蛋白的毒性

海昆之歌等。 美国国家科学院程序. .

摘要

识别致病蛋白抑制剂是发现靶向药物的主要策略。该策略在靶向神经退行性疾病（如亨廷顿氏病（HD））方面遇到了挑战，亨廷顿病主要由突变的亨廷顿蛋白（mHTT）引起，这是一种功能未知的“无法挖掘”的致病蛋白。我们假设，mHTT的一些化学结合物可能会改变其构象和/或稳定性，以抑制其下游毒性，其功能类似于广义定义下的“抑制剂”。我们通过基于小分子微阵列的筛选确定了21种潜在的mHTT选择性结合物。我们使用二级表型筛选进一步测试了这些化合物对mHTT诱导毒性的影响，并揭示了四种可能拯救HD相关表型的mHTT结合化合物。其中，美国食品和药物管理局批准的药物去离子能够通过增强mHTT在K6位点的多泛素化来破坏mHTT的稳定性，从而抑制HD细胞和动物模型中的mHTT毒性。我们的研究揭示了去离子治疗HD的潜在疗效，并为药物发现管道提供了原理证明：靶向结合物筛选，然后进行表型验证和机理研究。

关键词：亨廷顿病；去离子；药物靶点；运动障碍；神经变性。

PubMed免责声明

利益冲突声明

竞争利益：B.L.、Y.F.、Y.Ding和Y.Dang是根据本研究提交的相关专利的发明人（向中国国家知识产权局提交的申请号：202110795274.4）。他们也是生物技术公司的股东，其范围不包含本研究。

数字

图1。
图1。
识别抑制其细胞毒性的潜在mHTT结合化合物。(一个)基于SMM的选择性与mHTT外显子1（Q72）而非wtHTT外显子1（Q25）蛋白片段相互作用的化合物的初步筛选的示意图。GFP标签与HTT-外显子1片段融合，当与印在特定点上的某些化合物相互作用时产生信号。饼图：贴在SMM芯片上的化合物类别。(B类)屏幕上的一对具有代表性的图像（来自使用不同芯片的两次重复），显示了主要交互屏幕的点击复合物。(C类)通过去除血清后不同时间点的凋亡检测HD小鼠纹状体细胞（STHdhQ7/Q111）中mHTT细胞毒性的代表性数据（来自≥7批实验），使用绿色荧光染料（NucView 488）检测活性caspase-3。每组测试三个独立的电镀井。(D类)类似于C类但在蛋白体抑制剂MG132（0.5μM）治疗并去除血清后的WT小鼠纹状体细胞（STHdhQ7/Q7）中。与DMSO对照组相比，使用Dunnett的事后检验，通过双向方差分析对数据进行平均值和SEM分析****P（P）< 0.0001.
图2。
图2。
HD患者iPSC衍生神经元和HD苍蝇模型中hit化合物的表型测试。(一个)HD患者iPSC衍生神经元的代表性TUB3免疫荧光染色图像和Incucyte图像，在BDNF去除后用所述化合物处理。n个（括号中的数字）表示独立电镀孔的数量。(B类和C类)复合饲料转基因果蝇的爬升性能（每组四瓶）与羽化后年龄的关系。与DMSO对照组相比，使用Dunnett的事后检验，通过双向方差分析对数据进行平均值和SEM分析****P（P）< 0.0001. 请注意，所有四种受试化合物都挽救了HD苍蝇的攀爬性能缺陷，尽管巴泽多西芬、伊洛哌酮和氯雷他定导致表达WT全长HTT（flHTT-Q16）的苍蝇攀爬性能略有下降，但不包括表达HTTexon1-Q25的苍蝇。
图3。
图3。
在敲除HD小鼠模型中，注射去离子的icv挽救了HD相关表型。(一个–E类)小鼠行为测试显示，在icv注射去离子（2μL，2 mM）4周后，HD相关表型得到改善。n个指示小鼠数量（注射开始时为12个月大）。(F类)分别用S830和抗-DARPP-32免疫染色检测到的代表性图像和定量显示，通过去离子（des）注射，mHTT聚集物降低，DARPP-32信号增加。图像分析由ImageJ以盲法进行。n个表示三只老鼠的切片数。（比例尺，100μm）数据为平均值，SEM通过单向方差分析进行分析(一个–D类)或双向方差分析(E类)土耳其的事后测试或双尾不成对测试t吨测试(F类). ****P（P）< 0.0001.
图4。
图4。
去离子以等位基因选择性的方式降低mHTT。(一个)用地奈德（3μM）处理的STHdh细胞的代表性蛋白质印迹和定量。(B类)以5 mg/kg剂量ip注射去离子4周的小鼠（14个月龄）纹状体的典型蛋白质印迹和定量。每组9只小鼠接受测试。(C类)HD患者成纤维细胞中去离子的剂量-反应曲线（Q47）。mHTT水平用HTRF测定（抗体对：2B7/MW1；n个≥ 9). (D类和E类)通过HTRF（2B7/MW1）测量HD患者iPSC衍生神经元中的mHTT水平(D类3μM去离子与DMSO处理后48小时；n个指示独立电镀孔或HD飞头的数量(E类，elav-GAL4:UAS-flHTTQ128羽化后喂入化合物6天；n个表示苍蝇的瓶数）。数据为平均值，SEM分析为双尾非配对t吨测试****P（P）< 0.0001.
图5。
图5。
去离子通过蛋白酶体降低mHTT。(一个)STHdhQ7/Q111细胞中去离子处理的mHTT降低效应的代表性Western blot和定量分析，包括或不包括蛋白酶体或自噬抑制剂。(B类)HTRF（2B7/MW1）测量HD患者成纤维细胞（Q47）中内源性mHTT水平及所示化合物。(C类)HTRF（2B7/MW1）测量用所示化合物处理的转染HEK293T细胞中HTTexon1-Q72蛋白水平。在所有测试的细胞中，去氨酸对mHTT降低的作用被蛋白酶体抑制剂阻断，例如MG132（2μM）或环氧化合物（100 nM），而不是自噬抑制剂，例如NH4Cl（10 mM）或CQ（25μM）。所有信号均归一化为DMSO对照组的平均信号。数据为平均值，SEM分析为双尾非配对t吨测试****P（P）< 0.0001.n个表示独立电镀孔的数量。
图6。
图6。
去离子与mHTT的相互作用依赖于K6和膨胀polyQ。(一个)用去离子（3μM）或阳性对照5,7-二羟基-4-苯基香豆素（AN2100nM）处理的SCA3患者成纤维细胞的代表性蛋白质印迹和定量（12）。去离子未能降低突变型ATXN3的水平，这表明该效应需要HTT蛋白的区域，而不是扩大的polyQ拉伸。数据均数和SEM分析采用单向方差分析和Dunnett的事后检验****P（P）< 0.0001.n个表示独立电镀孔的数量。(B类)通过MST测量去离子与所示polyQ或HTTexon1片段的结合亲和力。与GFP融合的长polyQ强度不能与去离子相互作用(左侧). 此外，K6R突变消除了去离子与HTTexon1-Q72蛋白之间的结合，而ΔPRD的缺失或其他氨基酸的突变不影响这种相互作用(赖特). (C类)具有代表性的ITC分析（来自两批实验）去离子与HTT的相互作用。使用单点模型进行曲线拟合（对于Q72：n个= 0.910; ΔH=−5.266×104卡/摩尔；ΔS=−152卡/摩尔/度）。NDB：无可检测的绑定。
图7。
图7。
Desonide通过增强其K6聚体来降低mHTT。(一个)代表性免疫沉淀（IP）-转染HEK293T细胞的Western结果（来自五个批次）表明，去离子增强了mHTTexon1-Q72，但不增强mHTTex1-Q25 poly-ub，后者被K6R而不是K9R或K15R突变所消除。请注意，Q25蛋白略高于IgG轻链。(B类)通过HTRF（2B7/MW1）测量转染HEK293T或STHdhQ7/Q7细胞中的HTT水平。所有数据均归一化为DMSO治疗组，以显示去离子治疗的效果。(C类)用所示HTTexon1片段转染HEK293T细胞24小时，然后在无血清培养基中用去离子或二甲基亚砜处理后，进行Caspase-3活性测定。将数据归一化为Q72转染组和DMSO处理组，其caspase-3活性高于Q25转染组，说明mHTT依赖性和去离子敏感性细胞毒性信号。(D类)类似于C类但转染有指示点突变的Q72片段。所有数据均归一化为DMSO治疗组，以显示去离子治疗的效果。(E类和F类)类似于C类和D类但在STHdhQ7/Q7细胞中。数据为平均值，SEM分析为双尾非配对t吨测试****P（P）< 0.0001.n个表示独立电镀孔的数量。
图8。
图8。
去离子外周给药挽救了HD相关表型。9个月龄的指定基因型小鼠(n个=15），11个月(n个=13）或14个月(n个=13）以5 mg/kg的剂量ip注射去离子，持续4周，每天注射一次。(一个–E类)表明去离子对HD小鼠（HdhQ7/Q140）具有救援作用的行为分析。(F类)纹状体脑片免疫染色对HTT聚集物的定量显示，15个月龄HD小鼠纹状体组织中的去离子注射降低了mHTT聚集体（14个月龄注射4周）。通过ImageJ对聚集物进行盲目量化。n个表示每组三只小鼠的纹状体切片数量。数据为平均值，SD（SEM太小，无法显示）由非配对双尾分析t吨测试****P（P）< 0.0001.
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    Wu J、Möhle L、Brüning T、Eiriz I、Rafehi M、Stefan K、Stefan-SM、Pahnke J。 吴杰等。 国际分子科学杂志。2022年11月25日；23(23):14763. doi:10.3390/ijms232314763。 国际分子科学杂志。2022 PMID：36499090 免费PMC文章。

工具书类

    1. Tabrizi S.J.、Ghosh R.、Leavitt B.R.，亨廷顿病疾病治疗中亨廷顿降低策略。《神经元》102、899（2019）。-公共医学
    1. Saudou F.，Humbert S.，《亨廷顿的生物学》。《神经元》89910-926（2016）。-公共医学
    1. Trookman N.S.，Rizer R.L.，0.05%脱糖水凝胶与0.05%脱钠软膏治疗轻中度特应性皮炎的随机对照试验。临床杂志。埃斯特。皮肤科。4, 34–38 (2011).-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Kahanek N.、Gelbard C.、Hebert A.、Desonide:剂型、疗效和安全性综述。专家操作。投资。药物17，1097–1104（2008）。-公共医学
    1. Zhu C.等，开发一种使用异氰酸酯化学将小分子固定在微阵列上的高效通用策略。传感器（巴塞尔）16，E378（2016）。-项目管理咨询公司-公共医学