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.2022年2月28日；79(3):160.
doi:10.1007/s00018-022-04204-6。

亨廷顿病拓扑异构酶I引起的染色体损伤的缺陷修复

内尔玛·M·帕尔米尼亚 1, 克莱德·多斯·桑托斯·索萨 2, 乔恩·格里芬 1, 廖春艳 1, 劳拉·费拉约洛 2, 谢里夫·埃尔·卡米西 三 4
附属公司

亨廷顿病拓扑异构酶I引起的染色体损伤的缺陷修复

内尔玛·M·帕尔米尼亚等。 细胞分子生命科学. .

摘要

拓扑异构酶1（TOP1）介导的染色体断裂是影响神经元基因组稳定性的DNA损伤的内源性来源。TOP1 DNA断裂是否是亨廷顿病（HD）基因组不稳定的来源尚不清楚。在这里，我们报告了多个HD细胞模型中53BP1募集缺陷，包括来自HD患者的纹状体神经元。53BP1招募缺陷是由于RNF168活性有限导致H2A泛素减少所致。RNF168的可用性降低是由于与p62（一种参与选择性自噬的蛋白质）的相互作用增加所致。p62的耗尽或RNAF168和p62之间相互作用的中断足以恢复HD模型中53BP1的富集和随后的DNA修复，为治疗干预提供了新的机会。这些发现使人联想到由ALS/FTD中C9orf72扩增引起的p62积聚，并提示了蛋白质聚集干扰DNA修复信号的共同机制。

关键词：染色质泛素化；DNA修复；亨廷顿病；RNF168；TOP1cc；第62页/SQSTM1。

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作者声明没有竞争/冲突利益。

数字

图1
图1
突变体亨廷顿蛋白的表达导致53BP1招募不足，以应对DNA损伤。用含有23个CAG重复序列（GFP-Q23：野生型HTT）或74个CAG重序列（GFP Q74：突变HTT）的HTT-GFP标记质粒瞬时转染MRC5细胞。用DMSO或10µM CPT处理细胞1小时。一显示了用53BP1进行MRC5免疫染色的代表性图像（比例尺：10µm）。b条使用Student’s吨-测试(n个 = 每次复制50个细胞）。误差线代表±标准误差。c（c）–e（电子）GM08402代表未受影响的个体（健康）。GM04799（HD:42 CAG）和GM04869（HD:47 CAG）是从亨廷顿病（HD）临床患者中提取的成纤维细胞。所有细胞均购自科里埃尔研究所。c（c）显示用0.5µM CPT处理1小时后用53BP1免疫染色的原代人成纤维细胞的代表性图像（比例尺：10µM）。d日使用Student’s吨-测试(n个 = 3，每个复制10个字段）。e（电子）紫斑图显示每个细胞53BP1病灶的数量，通过三个生物实验进行量化，并使用Kruskal–Wallis测试进行分析（每个重复10个字段，±标准误差）。误差条表示±s.e.m。纳秒不重要的
图2
图2
经CPT治疗后，HD患者来源的成纤维细胞显示TOP1cc水平升高。一健康人（GM08402）和HD患者（GM04799，42 CAG）经10μM CPT治疗10分钟并用TOP1cc特异性抗体免疫染色后的原代皮肤成纤维细胞的代表性图像。比例尺：10μm。b条每个细胞的TOP1cc病灶数量由Student’s定量分析吨-测试。数据表示为三个独立实验±s.e.m的平均值
图3
图3
DNA损伤的积累会损害HD成纤维细胞的细胞活力。一用2μM CPT处理1 h并在完全培养基中恢复1–24 h（比例尺：10µM）后，用抗γH2AX抗体对原代成纤维细胞进行免疫染色的代表性图像（健康：GM08402；HD:GM04799，42 CAG）。b条每个时间点的γH2AX阳性细胞（>10 foci）百分比（%）被量化，并由Student’s分析吨-测试。数据显示为三个独立实验的平均值（每个实验10个场；N个 = 计数的单元格总数）。误差线：±标准误差。c（c）用60µM CPT处理健康（GM08402）或HD（GM04799）成纤维细胞30分钟，然后在无CPT培养基中恢复30分钟、1小时、2小时和4小时。采用中性彗星分析法测量双品牌断裂，采用单向方差分析法分析三个独立实验的平均彗星尾矩，采用Dunnett的多重比较试验，以健康成纤维细胞数据为对照。d日用10μM CPT治疗72小时并用裂解的caspase-3特异性抗体孵育后，对成纤维细胞进行Western blotting分析。Ponceau用于装载控制。e（电子）裂解半胱天冬酶-3水平与蓬索标准化。Student’s计算并分析了相对于健康细胞的折叠变化吨-测试。误差线：±s.e.m；n个 = 三。（f）使用CPT（0–10µM）治疗96小时后，CellTiter-Blue®监测健康和HD患者成纤维细胞对CPT治疗的敏感性。Y（Y）-轴表示根据CPT浓度（µM）绘制的平均存活百分比（%存活）(n个 = 3). % 通过对相应的未治疗条件（0µM）进行正常化，评估治疗后成纤维细胞的存活率。误差线代表±标准误差。克计算曲线下面积（A.U.C.）并绘制为三个生物复制的平均值。数据由Student’s吨-测试（误差条：±s.e.m）。纳秒不重要的
图4
图4
HD患者的GABA能神经元表现出53BP1信号减少和凋亡标记裂解caspase-3激活增加。一来自健康个体（CS14）和HD患者（GM23225，68CAG）的从NPC分化的GABA能神经元的代表性图像，在用0.5μM CPT或模拟（DMSO）处理1小时后用抗53BP1抗体进行免疫染色（比例尺：50µM）。DAPI显示细胞核染色。MAP2是神经元细胞骨架的特异性标记物。b条对每个时间点53BP1阳性细胞（>2个病灶）的百分比（%）进行量化，并由Student’s吨-测试。数据显示为三个独立实验的平均值。误差线代表±标准误差。c（c）紫斑图显示用0.5μM CPT处理后每个细胞53BP1病灶的数量。d日用10μM CPT或模拟（DMSO）处理48小时（比例尺：50µM）后，用特定裂解caspase-3抗体免疫染色的NPC分化出的GABA能神经元的代表性图像。e（电子）被切割的caspase-3信号强度被量化，数据显示为两个生物实验中六个技术重复的平均值，并由Student’s分析吨-测试。误差线代表±标准误差。纳秒不重要的
图5
图5
突变体亨廷顿蛋白的表达损害H2A泛素化。一用H2A抗体检测后，用GFP-Q23或GFP-Q74过度表达MRC5染色质结合部分的蛋白质印迹。17KDa的底部带代表未修饰的H2A，显示出相等的负载。顶带代表泛素化H2A（H2Aub公司).b条H2A水平ub公司，根据H2A标准化，以健康百分比（%）表示，并由学生的吨-测试。（误差线：±s.e.m，n个 = 3).c（c）通过western blotting分析健康（GM08402）和HD（GM04869，47 CAG）成纤维细胞的染色质结合组分。底部带表示未修改的H2A。顶带代表H2Aub公司.d日H2A水平ub公司，与H2A标准化，表示为健康细胞的%。数据由Student’s吨-测试，显示为平均值±标准误差(n个 = 3).e（电子）用10μM CPT处理1 h后，对共转染GFP-Q23或GFP-Q74和Flag-H2A K5-9-118-119-125-127-129R突变质粒（Flag-H2A K13/K15）的HEK293染色质组分进行Flag免疫沉淀（Flag IP）。GFP为空表示阴性对照。使用泛素抗体（Fk2）检测标记H2A K13/15泛素化。10%的裂解产物经Western blotting分析。GFP-Q23和GFP-Q74表达类似水平的标记-H2A K13/K15（输入）。（f）根据相应的Flag-IP信号对Fk2水平进行量化和标准化。数据显示平均值±s.e.m(n个 = 2） 并由Student的吨-测试
图6
图6
P62缺失可恢复53BP1信号传导，并改善对TOP1 DNA损伤的超敏反应。一用p62抗体进行western blotting分析健康（GM08402）和HD患者成纤维细胞（GM04799，42 CAG和GM04869，47 CAG）的全细胞提取物。肌动蛋白被用作负荷控制。b条Student’s计算并分析了p62水平相对于健康细胞的折叠变化吨-测试。误差线：±s.e.m，n个 = 4c（c）健康和HD纹状体神经元p62染色的免疫荧光图像。DAPI显示细胞核染色，MAP2表示神经元标记（比例尺：10μm）。d日每个细胞的p62强度被量化，并显示为健康的百分比。数据由Student’s分析吨-测试（误差条：三次技术重复的±s.e.m）。e（电子）用对照siRNA颗粒（siCTRL）或靶向p62（sip62）转染健康（GM08402）和HD成纤维细胞（GM04869），并用p62抗体进行免疫印迹分析。肌动蛋白染色显示负载。（f）用0.5μM CPT处理1小时后，用sip62或siCTRL转染的健康和HD成纤维细胞的53BP1免疫荧光图像（比例尺：10μM）。克53BP1阳性细胞（>5个病灶）的百分比通过单向方差分析进行量化和分析，然后进行事后Tukey多重比较测试（n=3，±s.e.m.）。小时使用抗p62抗体对siRNA转染后的健康（GM08402）和HD成纤维细胞（HD1:GM04799和HD2:GM04869）进行Western blotting分析。蓬索表示装载。我在CPT（0–10µM）治疗96小时后，通过CellTiter-Blue®分析监测转染siCTRL或sip62的健康和HD患者成纤维细胞对CPT的敏感性。Y（Y）-axis：平均存活率（%）n个 = 根据CPT浓度绘制3。%通过对照相应的未治疗条件（0µM）进行正常化来评估生存率。j个计算每个条件下的曲线下面积（A.U.C.），并绘制为[25]中的平均值。数据由Student’s吨-测试（误差线：±s.e.m；n个 = 3).纳秒不重要的
图7
图7
p62的药理学破坏：RNF 168结合拯救53BP1募集，以应对表达突变亨廷顿蛋白的细胞中的DNA损伤。一共转染GFP-Q23或GFP-74的HEK293核组分的RNF168联合免疫沉淀（RNF168 co-IP）。左：Western blotting显示RNF168和p62之间的相互作用。右图：10%的裂解物在与抗RNF168和抗p62抗体孵育后通过蛋白质印迹进行分析。Actin显示加载控制。（问题23：野生型亨廷顿蛋白。问题74：突变型亨廷廷蛋白）。b条p62下拉水平被量化并标准化为输入中的p62含量。该值根据诱饵RNF168水平进行了标准化。数据显示为GFP-Q23的倍数变化。数据由Student’s吨-测试并显示为平均值±标准误差。；n个 = 三。c（c）p62和RNF168相互作用的示意图。p62的LB结构域与RNF168的MIU1相互作用。p62和RNF168之间的相互作用被模拟RNF168 MIU1结构域的重组罗丹明标记肽中断。d日RNF168 Co-IP在转染GFP-Q23或GFP-74的HEK293核组分中进行。左：Western blot显示RNF168和p62之间的相互作用（通道3和4）。与5μM MIU1肽孵育24小时后，相互作用受到干扰（通道5和6）。右：10%的裂解产物用抗RNF168和抗p62抗体进行免疫印迹分析。（问题23：野生型亨廷顿蛋白。问题74：突变型亨廷廷蛋白）。e（电子）用GFP-Q23或GFP-Q74质粒转染MRC5细胞，并暴露于5µM模拟（DMSO）/罗丹明标记的MIU1。用10μM CPT处理细胞1 h，并通过免疫荧光分析（比例尺：10µM）。（f）53BP1阳性细胞百分比（>5个病灶）通过单向方差分析进行量化和分析，然后进行Tukey的多重比较测试。数据显示为平均值±s.e.m；n个 = 3（50个GFP表达细胞/复制）*第页 < 0.05; **第页 < 0.01；纳秒不重要的
图8
图8
提出的模型显示亨廷顿病染色体DNA断裂修复缺陷。突变体亨廷顿蛋白（mtHTT）导致自噬缺陷，促进货物受体蛋白p62的积累。在修复染色体DNA断裂的过程中，p62水平升高，进而使RNF168的E3泛素连接酶活性失活。这导致组蛋白H2AK13/K15泛素化不足，这是招募修复因子（如53BP1）所必需的。由于无法招募53BP1，细胞会留下未修复的损伤，导致神经元过早死亡
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参考文献

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