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。2022年2月3日；14(2):316.
doi:10.3390/v14020316。

DDX50是一种增强IRF3激活的病毒限制因子

米切尔·A·帕莱特 1 2, 卢永旭 1, 杰弗里·史密斯 1
附属公司

DDX50是一种增强IRF3激活的病毒限制因子

米切尔·A·帕莱特等。 病毒。 。

摘要

转录因子IRF3和NF-κB在应对许多病毒和细菌病原体的先天免疫信号传导中至关重要。然而，导致其激活的机制仍不完全清楚。病毒RNA可由RLR受体检测，如RIG-I和MDA5，以及dsRNA受体TLR3。或者，DExD-Box RNA解旋酶DDX1-DDX21-DHX36以独立于RIG-I、MDA5或TLR3的TRIF依赖性方式激活IRF3/NF-κB。在这里，我们将DDX50描述为一种非冗余因子，它与DDX21具有55.6%的氨基酸同源性，在病毒RNA刺激IRF3信号通路或感染RNA和DNA病毒后，促进其激活。小鼠和人类细胞中DDX50的缺失会损害IRF3磷酸化和IRF3依赖的内源性基因表达以及细胞因子/趋化因子的产生，以应对细胞质dsRNA（polyIC转染）以及RNA和DNA病毒的感染。从机制上讲，当DDX50共同免疫沉淀TRIF时，它独立于先前描述的TRIF依赖RNA传感器DDX1。事实上，shRNA-介导的DDX1缺失表明DDX1对于RNA病毒感染的应答信号是不必要的。重要的是，DDX50的丢失导致感染痘苗病毒、单纯疱疹病毒或寨卡病毒后病毒的复制和传播显著增加，突出了其作为广泛病毒限制因子的重要作用。

关键词：DExD-box解旋酶；HSV；IRF3；RLR；VACV；齐卡；抗病毒药物。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1
图1
DDX50（RH-II/Guβ）是先天免疫信号对细胞内核酸的反应所必需的。(A类)WT的萤火虫荧光素酶活性或Ddx50天−/−用编码萤火虫荧光素酶的质粒转染MEFIfnβ发起人和Renilla。细胞未经处理或用5µg/mL胞外多聚IC（epIC）处理，用5µg/mL多聚IC（pIC）转染6小时，或用仙台病毒（SeV）感染24小时(B类)WT或Ddx50天−/−仅用脂质体胺或5µg/mL pIC转染MEF 7 h，并对MEF进行折叠诱导第56期，Cxcl10公司，或Ifnb公司mRNA水平，相对于Gapdh公司，用RT-qPCR进行分析。(C类)PolyIC转染后7小时培养基中CXCL10和IL-6的分泌水平(D类)用ELISA分析感染SeV后4.5 h的情况。(E类)WT的萤火虫荧光素酶活性或DDX50型−/−用编码萤火虫萤光素酶的质粒转染HEK293TsIfnβTK启动子下的启动子和Renilla。用SeV感染细胞24小时或不治疗。数据代表至少三个独立实验。(F类)WT或WT感染后24小时培养基中CXCL10的分泌水平DDX50型−/−用ELISA法分析带有SeV的HEK293Ts。数据代表至少三个独立实验。对于所有面板，通过执行双向ANOVA测试以及Tukey的事后多重比较来确定统计显著性。
图2
图2
DDX50拯救核酸诱导的信号Ddx50天−/−MEF公司。(A类——C类)用pLDT-EV和Ddx50天−/−用pLDT-EV或pLDT转导的MEF-Ddx50天仅用脂质体胺或5µg/mL PolyIC转染7小时(A类)第56期，Cxcl10公司，或Ifnb公司mRNA水平，相对于Gapdh公司通过RT-qPCR和(B类)通过ELISA测定分泌的CXCL10。至少两个独立实验的代表。对于所有面板，通过执行双向ANOVA测试以及Tukey的多重比较事后测试来确定统计显著性。ns，无显著性。(C类)通过SDS-PAGE和使用抗DDX50抗体的免疫印迹确认DDX50的表达。
图3
图3
对dsDNA病毒HSV-1和VACV作出反应时，需要DDX50进行IRF3依赖性信号传递。WT MEF或Ddx50−/−用HSV-1 S17ΔICP0以10 p.f.u./细胞的速度感染MEF 3或6小时(A类，C类)或MVA(B类，D类)或者没有感染。(A类，B类)提取信使核糖核酸Ifnb公司，第56期、和Cxcl10公司通过RT-qPCR分析与Gapdh公司.至少有两个独立实验的代表。(C类，D类)用ELISA法检测感染后3和6小时CXCL10和IL-6的分泌。三个独立实验的代表，一式四份。对于所有面板，通过执行双向ANOVA测试以及Tukey的多重比较事后测试来确定统计显著性。ns，无显著性。
图4
图4
DDX50在细胞质中积累以响应细胞质dsRNA，并在MAVS激活的上游或独立于MAVS的激活。(A类，B类)磷酸化IRF3的代表性免疫印迹(A类)Ser396或(B类)用于的Ser386（pIRF3）(A类)WT或Ddx50天−/−仅用脂质体胺或5µg/mL PolyIC转染MEF 3和6小时或(B类)WT和DDX50−/−HEK293Ts未经治疗或感染SeV 18小时。IRF3磷酸化水平通过密度测定法计算，相对于α-微管蛋白(A类)或肌动蛋白(B类)并且代表了至少两个独立的实验。(C类)用2.5µg/mL PolyIC转染WT-MEFs指定时间并分离细胞质（cyt）和核组分（nuc）后的代表性免疫印迹。免疫印迹分别检测DDX50或α-微管蛋白和层粘连蛋白A/C，作为细胞质和核组分对照。通过密度计计算细胞质和细胞核DDX50水平的变化，分别相对于细胞质或细胞核组分中时间点0处的DDX50水平和α-微管蛋白或层粘连蛋白A/C水平。三个独立实验的代表。通过执行单向ANOVA检验和Tukey的多重比较事后检验来确定统计显著性。(D类)DDX50定位的免疫荧光染色。用pLDT-DDX50-HA转染HeLa细胞，保持未感染（NI）或以40 HAU/mL的SeV感染1.5 h。使用抗-HA抗体观察DDX50定位。Puntca用白色箭头表示。DAPI染色细胞核。三个独立实验的代表。比例尺，10µM。(E类)WT的荧光素酶活性或Ddx50−/−MEF与EV或指示质粒以及编码萤火虫荧光素酶的质粒共同转染Ifnβ发起人和Renilla作为内部控制。所显示的实验代表了至少三个独立的实验。对于所有面板，除非另有说明，否则通过执行双向ANOVA测试，然后执行Tukey的多重比较事后测试来确定统计显著性。
图5
图5
DDX50 co-IP TRIF，但独立于DDX1复合体(A类)DDX21和DDX50或DDX1和DHX36中相应区域的对比示意图。(B类)在用5µg/mL PolyIC刺激后1 h瞬时转染GFP-Flag或TRIF-cTAP的MEF DDX50-HA细胞系的联合免疫印迹实验。(C类)瞬时转染DDX50-HA和GFP-Flag或TRIF-cTAP的HeLa细胞系在用5µg/mL PolyIC刺激1小时后的联合免疫印迹实验。两个独立实验的代表。*，非特异性带。(D类)WT或DDX50 KO HEK293T用非靶向（NT）shRNA或靶向DDX1的两个独立shRNA克隆转导。通过DDX1和α-管蛋白的免疫印迹验证敲除。用编码萤火虫荧光素酶的质粒在Ifnβ发起人和Renilla。将细胞未感染或感染仙台病毒（SeV）24小时。这是3个独立实验的代表。通过执行双向ANOVA测试和Tukey的多重比较事后检验来确定显著性。IB，免疫印迹；免疫沉淀；ns，无显著性。
图6
图6
DDX50在高MOI后不影响病毒复制。(A类)WT或Ddx50天−/−用vA5-GFP以5p.f.u./细胞感染MEFs 24小时。通过仅在培养基（EEV）内或在BS-C-1细胞上的总（培养基加细胞）内的感染性的噬斑分析来确定病毒滴度。三个独立实验的平均值。(B类，C类)WT或Ddx50天−/−HEK293Ts感染(B类)vA5-GFP在5 p.f.u./电池下持续16小时或(C类)ZIKV在1 p.f.u./细胞上持续72小时。病毒滴度通过在Vero E6上滴定细胞裂解物来计算。两个独立实验的平均值。对于所有面板，通过执行双尾非配对分析来确定统计显著性t吨-测试。Ns，不显著。
图7
图7
DDX50是一种病毒限制因子。(A类，B类)WT或Ddx50天−/−MEF以0.0001 p.f.u./cell感染vA5-GFP。通过BS-C-1细胞上的斑块试验测定24小时p.i.的病毒滴度，并表示为p.f.u./mL（左侧）或相对于WT细胞的复制倍数增加（右侧）。(B类)如中所示(A类)但使用WT或DDX50型−/−HEK293Ts在0.0003 p.f.u./cell下感染48小时。结果显示为2个独立实验的代表性。(C类)WT或Ddx50天−/−MEF以0.01 p.f.u./cell感染HSV-1 S17 Vp26-GFP。通过U2OS细胞的菌斑试验测定48 h p.i.时的病毒滴度，并表示为p.f.u./mL（左图）和相对于WT细胞的复制倍数增加（右图）。(D类)WT或DDX50型−/−HEK293Ts以0.1 p.f.u./细胞的速度感染ZIKV 72小时。通过Vero E6细胞的斑块试验测定滴定度，数据如下所示(A类——C类). 所示标题是两个独立实验的平均值。(E类)WT或Ddx50天−/−MEF以0.0001 p.f.u./细胞的速度感染vA5-GFP，并在24h通过免疫印迹分析VACV晚期蛋白D8的表达(F类)细胞被感染，如(A类，B类)每24小时计算WT或KO细胞上形成的斑块数量。数据表示为KO细胞与WT细胞相比的斑块形成效率。两个独立实验的代表。两个独立实验的代表。(G公司，H（H）)WT或Ddx50−/−用pCW57-EV或pCW57转导的MEF-Ddx50天-HA在0.0001 p.f.u./cell时感染vA5-GFP，并在24 h p.i.时进行分析(G公司)感染后斑块的典型荧光图像。比例尺，500µM。(H（H）)病毒滴度和24小时后的折叠复制。通过执行单向方差分析测试和Tukey的多重比较事后测试来确定统计显著性。对于所有实验，除非另有说明，否则所示滴定度代表至少3个独立实验，所示折叠变化是至少2个独立实验的平均值。对于所有面板，除非另有说明，否则统计显著性通过执行双尾非配对t吨-测试。
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