Prednisolone and mesenchymal stem cell preloading protect liver cell migration and mitigate extracellular matrix modification in transplanted decellularized rat liver

doi:10.1186/s13287-022-02711-8

。2022年1月28日；13(1):36.

doi:10.1186/s13287-022-02711-8。

泼尼松龙和间充质干细胞预加载保护去细胞大鼠移植肝的肝细胞迁移并减轻细胞外基质修饰

Atefeh Yaghoubi公司¹, 内加·阿扎皮拉², 赛义德·卡尔巴拉伊·杜斯特^三 4, 萨贾德·达内什^三, 扎赫拉·沃伊达尼¹, 塔赫雷·塔拉伊·科扎尼⁵

附属公司

¹伊朗设拉子市设拉子医科大学解剖系组织工程实验室。
²伊朗设拉子市设拉子医科大学移植研究中心。
^三伊朗设拉子市设拉子医学科学大学体视学和形态计量学研究中心。
⁴伊朗设拉子市设拉子医科大学设拉子医学院解剖系。
⁵伊朗设拉子市设拉子医科大学解剖系组织工程实验室。talaeit@sums.ac.ir。

PMID： 35090559
预防性维修识别码： PMC8800282号
内政部： 10.1186/s13287-022-02711-8

泼尼松龙和间充质干细胞预加载保护去细胞大鼠移植肝的肝细胞迁移并减轻细胞外基质修饰

Atefeh Yaghoubi公司等人。干细胞研究与治疗。 2022。

。2022年1月28日；13(1):36.

doi:10.1186/s13287-022-02711-8。

作者

Atefeh Yaghoubi公司¹, 内加·阿扎皮拉², 赛义德·卡尔巴莱（Saied Karbalay-Doust）^三 4, 萨贾德·达内什^三, 扎赫拉·沃伊达尼¹, 塔赫雷·塔莱伊·科扎尼⁵

附属公司

¹伊朗设拉子市设拉子医科大学解剖系组织工程实验室。
²伊朗设拉子医学科学大学移植研究中心。
^三伊朗设拉子市设拉子医学科学大学体视学和形态计量学研究中心。
⁴伊朗设拉子市设拉子医科大学设拉子医学院解剖系。
⁵伊朗设拉子市设拉子医科大学解剖系组织工程实验室。talaeit@sums.ac.ir。

PMID： 35090559
预防性维修识别码： PMC8800282号
内政部： 10.1186/13287-022-02711-8

摘要

简介：再生医学为治疗慢性肝病提供了有希望的方法。先前的研究表明，脱细胞的肝脏结构被侵入的非肝炎症细胞所破坏。本研究旨在利用骨髓源性间充质干细胞（BM-MSC）和泼尼松龙的抗炎和再生能力，减少纤维化，平衡炎性细胞向脱细胞肝支架的迁移。

材料和方法：通过灌注月桂醚硫酸钠（SLES）使肝脏脱细胞，通过DNA定量、组织化学和免疫组织化学评估确认细胞核耗竭和细胞外基质（ECM）保留。支架上植入BM-MSC、泼尼松龙或两者的组合，植入大鼠部分肝切除的解剖部位，并随访2周和4周。

结果：在移植支架中追踪标记的MS；然而，它们并没有迁移到完整的肝脏中。免疫组化显示肝母细胞、胆管细胞、星形细胞和卵圆形细胞侵入所有支架。胆管在支架和完整肝脏的边缘更丰富。体视学评估显示，泼尼松龙负载支架中的淋巴细胞和中性粒细胞数量显著减少。细胞/泼尼松龙负载生物支架治疗组的再生过程和血管生成显著增加。与对照组相比，用细胞/泼尼松龙、泼尼松隆或骨髓基质干细胞预处理的支架中的胶原纤维显著减少。

结论：将泼尼松龙加载到支架中可能是限制移植后炎症的一种有价值的方法。虽然细胞/泼尼松龙联合预载支架不能减轻炎症，但它在再生和血管生成中发挥了重要作用。

关键词：去细胞化；肝脏；间充质干细胞；泼尼松龙。

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利益冲突声明

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数字

图1
整个肝脏和植入物(一)以及移植的去细胞移植物的高倍放大(b条). 通过定向器方法从移植组织中获得均匀的各向同性随机切片(**c（c）**). 从移植组织中获得了一组各向同性均匀的随机切片(d日). 在组织学切片上用点线表示移植物与正常肝脏的边界，并对组织区域进行了表征，图中可见肝细胞（H）、胆管（BD）、血管（V）和异物（FB）(**e（电子）**). 采用点计数法估算移植物成分的体积(如果). 移植组织的细胞被鉴定(克). 光学分离技术用于估计移植组织中的细胞数量。在图中，可以看到肝细胞（H）和淋巴细胞（L）（H）。比例尺 = 30µm英寸(**e（电子）**,如果)和20µm英寸(克,小时)

图2
年代学宏观(A类)和微观变化(B类)在基于SLES的去细胞过程中对大鼠肝脏的损伤。可以观察到脱细胞过程中肝脏颜色从红色变为透明。DNA定量(C类)脱细胞后DNA含量显著降低（数据表示为平均值 ± 平均值标准误差（SEM），N个 = 每组3个，*表示有显著差异(*P（P）* = 0.0002). 赫赫斯特(D类)苏木精和曙红(E类)去细胞肝染色证实细胞核缺失。边缘切割的扫描电子显微镜(F类)和表面(**G公司**)脱细胞支架的三维超微结构保持完整

图3
肝脏细胞外基质的成分保存。Alcian blue、Aldehyde-fuchsin、Masson Trichrome和PAS分别用于检测酸性糖胺聚糖和弹性纤维、胶原纤维和中性碳水化合物含量，显示出与完整肝脏相比，脱细胞肝脏的ECM保存程度有所不同。免疫组织化学检测到I、IV型胶原、纤连蛋白和层粘连蛋白保留在肝支架中，在完整组织中具有类似的分布模式。比例尺为100µm

图4
通过将T细胞暴露在一组剂量下48小时来选择泼尼松龙的有效剂量(A类). 细胞粘附评估表明，泼尼松龙负荷对支架的粘附和渗透性能没有显著影响(B类). 培养HepG2细胞株，评价载泼尼松龙支架的细胞毒性。在常规2D条件下培养的细胞增殖率显著高于所有其他组。第7天，所有组的细胞存活率均增加。泼尼松龙对HepG2细胞有一定的细胞毒性(C类). 药物释放模式通过评估介质中释放的泼尼松龙浓度来评估。2个代表性样品(D类)和5小时(E类). 泼尼松龙在支架上48小时的释放曲线(F类). PKH26标记MSC的追踪(**G公司**). 注射细胞在0天时均匀分布在支架上。2周后，大多数标记细胞形成大聚集体；然而，其中一些分散在植入的支架上。在标记的细胞聚集物之间，也可以观察到未标记的细胞。标记的细胞不存在于肝脏的完整部分（*）。PD，泼尼松龙；DC，脱细胞*与2D藻酸盐有显著差异(*P（P）* = 0.0002）和3D PD加载去细胞(*P（P）* = 0.0001）第1天；α与2D PD加载的显著差异(*P（P）* = 0.0001）和3D去细胞(*P（P）* = 0.0029）第1天；和，β在第3天和第7天与所有其他组之间存在显著差异(*P（P）* = 0.0001)

图5
装载BM-MSC移植的代表性样本的PAS染色显示肝索形式的肝细胞样细胞重组(A类). * 表示肝脏的完整部分。图中的正方形A类用高倍镜检查，显示重组的肝索(B类). 此部分的放大倍数较高(C类)显示具有肝细胞表型（箭头）的细胞以肝索的形式排列，并且在它们之间可以观察到Sinosuites。箭头显示内皮细胞的细胞核。比较肝脏完整部分肝细胞的PAS反应(D类)以及在支架中迁移的肝细胞样细胞(C类)发现他们还没有储存糖原；因此，它们不起作用。胆道分布的镶嵌法(E类)

图6
CK19阳性细胞代表2周后移植移植物内迁移的未成熟肝母细胞和胆管细胞。在细胞和细胞/泼尼松龙组中，存在CK19-阳性细胞的大聚集体。高倍镜（小正方形）显示它们具有肝细胞表型。2周后，免疫组织化学检测所有移植物中广泛的C-kit标记的卵圆细胞迁移。在小正方形中观察到较高的放大倍数。Con:控制

图7
GFAP抗体检测星形胶质细胞迁移。显微镜检查显示，较少的星状细胞迁移到载泼尼松龙的支架上。肝脏完整部分（箭头）和移植物中的星形细胞（箭头）。*表示肝脏的完整部分

图8
异物巨细胞。肝巨细胞与CK19和HSA抗体以及PAS染色反应。多核巨噬细胞呈HAS和CK19-阴性，细胞质中没有糖原。图表显示，所有组中这些细胞的体积在统计学上是相同的。比例尺为50µm

图9
中性粒细胞的数量(A类)，淋巴细胞(B类)和炎症组织的体积密度(C类)，船只(D类)和胆管(E类). 早在2周前，泼尼松龙和MSCs就加速了中性粒细胞向淋巴细胞群的置换。泼尼松龙和细胞可减轻炎症和免疫细胞迁移。细胞/泼尼松龙负荷组的血管生成明显高于对照组(*P（P）* = 0.0086），载药(*P（P）* = 0.0004）和电池加载(*P（P）* < 0.0001）组。与对照组和泼尼松龙负荷组相比，两种细胞负荷支架的胆道迁移和形成速度均无明显加快

**图10**
三色Masson染色以及纤维化区域所占体积的量化显示，在同时装载细胞和泼尼松龙的移植物中，纤维生成显著降低。细胞/泼尼松龙治疗组再生肝组织的体积密度也显著高于对照组。PD，泼尼松龙*同一周和所有其他组的显著差异(*P（P）* < 0.05）；^#与同一周细胞和细胞治疗组的PD有显著差异(*P（P）* < 0.05)

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1. Rockey DC，Friedman SL。肝纤维化和肝硬化。Zakim和Boyer的肝病学。6.爱思唯尔·桑德斯；2012年，第64-85页。
1. 洛基哥伦比亚特区伊瓦基里Y，Shah V。血管病理生物学在慢性肝病和肝硬化中的现状和未来方向。肝素杂志。2014;61(4):912–924.-项目管理咨询公司-公共医学
1. Seki E，Schwabe RF。肝脏炎症和纤维化：功能联系和关键途径。肝病学。2015;61(3):1066–1079. doi:10.1002/hep.27332。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学
1. Karsdal MA、Manon-Jensen T、Genovese F、Kristensen JH、Nielsen MJ、Sand JMB等。对肝纤维化中细胞外基质的功能和动力学的新见解。美国生理学杂志-胃肠病学-肝脏生理学。2015;308（10）：G807–G830。-项目管理咨询公司-公共医学
1. Koyama Y，Brenner DA。肝脏炎症和纤维化。临床投资杂志。2017;127:55–64. doi:10.11172/JCI88881。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

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[1] Rockey DC，Friedman SL。肝纤维化和肝硬化。Zakim和Boyer的肝病学。6.爱思唯尔·桑德斯；2012年，第64-85页。

[2] Rockey DC，Friedman SL。肝纤维化和肝硬化。Zakim和Boyer的肝病学。6.爱思唯尔·桑德斯；2012年，第64-85页。

[3] 洛基哥伦比亚特区伊瓦基里Y，Shah V。血管病理生物学在慢性肝病和肝硬化中的现状和未来方向。肝素杂志。2014;61(4):912–924.-项目管理咨询公司-公共医学

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[6] Seki E，Schwabe RF。肝脏炎症和纤维化：功能联系和关键途径。肝病学。2015;61(3):1066–1079. doi:10.1002/hep.27332。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

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[8] Karsdal MA、Manon-Jensen T、Genovese F、Kristensen JH、Nielsen MJ、Sand JMB等。对肝纤维化中细胞外基质的功能和动力学的新见解。美国生理学杂志-胃肠病学-肝脏生理学。2015;308（10）：G807–G830。-项目管理咨询公司-公共医学

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[10] Koyama Y，Brenner DA。肝脏炎症和纤维化。临床投资杂志。2017;127:55–64. doi:10.11172/JCI88881。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

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