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案例报告

.2022年2月；36（2）：e24196。

doi:10.1002/jcla.24196。 Epub 2022年1月8日。

富含脯氨酸的跨膜蛋白2与GluA1特异性结合，但对AMPA受体介导的突触传递没有影响

郝阳峰¹, 凤昌桥¹, 谭建新¹, 张晓佐¹, 胡萍¹, 云石石^2 三 4 5, 徐正峰¹

附属公司

附属公司

¹南京医科大学女子医院产前诊断科，南京妇幼保健院，中国南京。
²南京大学医学院模型动物研究中心，疾病研究模型动物教育部重点实验室，南京，中国。
^三南京大学医学院附属鼓楼医院神经内科药物生物技术国家重点实验室，南京，中国。
⁴南京大学脑科学研究所，南京，中国。
⁵南京大学化学与生物医药创新中心，南京，中国。

PMID： 34997978
预防性维修识别码： PMC8842155号
内政部： 10.1002/jcla.24196

案例报告

富含脯氨酸的跨膜蛋白2与GluA1特异性结合，但对AMPA受体介导的突触传递没有影响

郝阳峰等。临床实验室分析杂志. 2022年2月.

.2022年2月；36（2）：e24196。

doi:10.1002/jcla.24196。 Epub 2022年1月8日。

作者

郝阳峰¹, 凤昌桥¹, 谭建新¹, 张晓佐¹, 平湖¹, 云石石^2 三 4 5, 徐正峰¹

附属公司

¹南京医科大学女子医院产前诊断科，南京妇幼保健院，中国南京。
²南京大学医学院模型动物研究中心，疾病研究模型动物教育部重点实验室，南京，中国。
^三南京大学医学院附属鼓楼医院神经内科药物生物技术国家重点实验室，南京，中国。
⁴南京大学脑科学研究所，南京，中国。
⁵南京大学化学与生物医药创新中心，南京，中国。

PMID： 34997978
预防性维修识别码： PMC8842155号
内政部： 10.1002/jcla.24196

摘要

背景：富含脯氨酸的跨膜蛋白2（PRRT2）是一种与癫痫、运动障碍和智力缺陷相关的神经元特异性蛋白。先前的研究表明，PRRT2调节突触前膜的神经递质释放。然而，PRRT2也能结合AMPA-型谷氨酸受体（AMPAR），但其突触后功能尚不清楚。

方法和结果：用于诊断精神发育迟滞患者的全外显子组测序发现PRRT2基因中存在无义突变（c.649C>T；p.R217X）。为了了解突变的病理学，我们克隆了小鼠Prrt2 cDNA，并在人类Prrt2中Arg217的对应位点Arg223插入了一个提前终止突变。在小鼠海马组织中，Prrt2通过与GluA1的结合与GluA1/A2 AMPAR异构体相互作用，但与GluA2/A3s不相互作用。此外，Prrt2抑制了GluA1在HEK 293T细胞膜上的表达和定位。然而，当子宫内电穿孔使单个海马神经元中Prrt2过度表达时，AMPAR介导的突触传递不受影响。用CRIPR/Cas9技术删除Prrt2并不影响AMPAR介导的突触传递。此外，Prrt2的缺失或过度表达并不影响原代神经元培养中GluA1的表达和分布。

结论：Prrt2的突触后功能表明，Prrt1与AMPAR亚单位GluA1特异性相互作用，但不调节AMPAR介导的突触传递。因此，我们的研究在实验上排除了Prrt2的突触后调节机制。最近的研究表明，人类PRRT2变体的病理学可能源于突触前膜神经递质释放的缺陷。

关键词：AMPA受体；GluA1；PRRT2；智力低下；全基因组测序。

©2022作者。威利期刊有限责任公司出版的《临床实验室分析杂志》。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1
家系和突变分析。（A）家族谱系。（B）我们患者的临床特征显示精神发育迟滞的临床表现。（C） WES结果显示，先证者携带杂合无义突变（C.649C>T），在其母亲身上也发现了这种突变。（D） Sanger测序结果与WES结果相对应

图2
体内外Prrt2与GluA1亚单位的相互作用。（A） HEK 293T细胞中截短的Prrt2‐FLAG质粒（p.R223X，人类Prrt2中p.R217X的相应突变）的蛋白质水平。使用针对Prrt2和FLAG N末端的抗体检测Prrt2-FLAG。Western blotting结果表明突变的Prrt2蛋白无法检测到。（B，C，D）使用成年小鼠海马进行体内免疫共沉淀分析。在使用GluA1、GluA2和GluA3抗体下拉后，Western blotting结果显示Prrt2与GluA1和GluA2之间存在相互作用，但与GluA3。（E）使用来自HEK 293T细胞的细胞提取物与HA标记的GluA1、GluA2、GluA3和FLAG标记的Prrt2共转染的体外共免疫沉淀。用FLAG抗体下拉后，Western blotting结果显示Prrt2和GluA1之间存在直接相互作用。（F）从与HA标记的GluA1、FLAG标记的Prrt2和FLAG标记突变的Prrt1（p.R223X）共转染的HEK 293T细胞中提取总蛋白和膜蛋白。（G） Western blotting结果显示，与Prrt2共转染后，GluA1总量减少(*第页=0.024 Prrt2+GluA1与Prrt2_{多用途终端}+谷氨酸A1*第页=0.010 Prrt2+GluA1 vs.GluA1；纳秒。第页=0.729 Prrt2_静音+GluA1 vs.GluA1；n个 = 3). （H） Western blotting结果显示与Prrt2共转染后GluA1的表面表达水平降低(**第页=0.003 Prrt2+GluA1与Prrt2_{多用途终端}+谷氨酸A1*第页=0.025 Prrt2+GluA1相对于GluA1；纳秒。第页=0.195 Prrt2_{多用途终端}+GluA1 vs.GluA1；n个=3）

图3
小鼠海马CA1区Prrt2的过度表达。（A）实验中使用的Prrt2质粒图（顶部）、胚胎第15天小鼠子宫内电穿孔实验程序示意图（左侧）和双细胞记录实验方法示意图（右侧）。（B）散点图显示了AMPA受体（AMPAR）诱发的兴奋性突触后电流（eEPSCs）的振幅，这些电流是针对单对（开环）对照细胞和过度表达Prrt2（OE）的转染细胞(n个=10对）。实心圆圈表示平均值±SEM（B，Control=58.4±11.2；OE=58±11.6，pA）。（C）标准化为对照（%）的比率条形图，总结平均值±扫描电镜表示为B（103.3±9.2，第页= 0.72). （D）显示AMPAR eEPSC衰减统计比较的直方图(n个=7对）。空心圆圈表示单个样品的τ（平均值±SEM，控制值=11.57±1.47；OE=12.43±2.85，ms，第页= 0.79). （E）散点图显示了对照细胞和过度表达Prrt2（OE）的转染细胞的单对（开放圈）NMDA受体（NMDAR）eEPSC的振幅(n个=6对）。实心圆圈表示平均值±SEM（E，Control=122.9±28.6；OE=137±43.9，pA）。（F）标准化为对照（%）的比率条形图，总结了E（109.8±21.2，第页=0.65）。（G）显示成对脉冲比率（PPR）统计比较的直方图(n个=6对）。实心圆圈表示单个样品的比率（平均值±SEM，控制值=2.30±0.36；OE=2.28±0.32，第页= 0.97). 比例尺：100 ms，50 pA

图4
小鼠海马CA1区Prrt2缺失。（A）实验中使用的CRISPR构建体的图谱。（B）散点图显示了AMPA受体（AMPAR）诱发的兴奋性突触后电流（eEPSCs）在对照和转染的Prrt2基因敲除（KO）细胞中的振幅(n个=10对）。实心圆圈表示平均值±扫描电镜（B，对照组=118.8±23.9；KO=120.9±19.4，pA）。（C）标准化为对照（%）的比率条形图，总结平均值±扫描电镜用B表示的AMPAR eEPSC值（115.3±11.6，第页= 0.20). （D）显示AMPAR eEPSC衰减统计比较的直方图(n个=8对）。空心圆圈表示单个样品的τ（平均值±SEM，控制值=15.12±1.72；KO=14.41±1.99，ms，第页= 0.79). （E）散点图显示了对照细胞和转染KO细胞的单对（开放圆）NMDA受体（NMDAR）eEPSC的振幅(n个=8对）。实心圆圈表示平均值±扫描电镜（E，对照组=52.4±6.5；KO=35.7±4.6，pA）；（F）标准化为对照（%）的比率条形图，总结平均值±扫描电镜E中表示的NMDAR eEPSC值（77.7±14.6，第页= 0.15). （G）显示成对脉冲比率（PPR）统计比较的直方图(n个=8对）。实心圆圈表示单个样品的比率（平均值±扫描电镜，控制=1.77±0.09；KO=1.67±0.12，第页= 0.54). 比例尺：100 ms，50 pA

图5
表面和细胞内GluA1的免疫荧光强度。（A）用GFP、过表达（OE）或敲除（KO）质粒转染的原代海马神经元中绿色荧光蛋白（GFP，绿色）和GluA1（细胞内，红色；表面，黄色）的免疫荧光染色；比例尺：20μm。（B）细胞内GluA1（ns）的免疫荧光强度分析。第页=0.750 GFP vs.Prrt2 OE；纳秒。第页=0.944 GFP vs.Prrt2 KO）。（C）表面/细胞内比率（ns）的免疫荧光强度分析。第页=0.784 GFP vs.Prrt2 OE；纳秒。第页=0.976 GFP vs.Prrt2 KO）

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