Growth differentiation factor 11 accelerates liver senescence through the inhibition of autophagy

doi:10.1111/acel.13532

.2022年1月；21（1）：e13532。

doi:10.1111/acel.13532。 Epub 2021年12月14日。

生长分化因子11通过抑制自噬加速肝脏衰老

孙健^1 2, 李颖^三, 肖扬^三, 魏东^4 5 6, 杨建坤^三, 齐胡⁷, 张存泰⁷, 豪舒芳⁸, 刘安定^三

附属公司

¹中国广东省广州市中山大学中山纪念医院胆胰外科。
²广东省恶性肿瘤表观遗传学与基因调控重点实验室，中山大学中山纪念医院，广州，中国。
^三华中科技大学同济医学院同济医院实验医学中心，湖北武汉。
⁴华中科技大学同济医学院同济医院肝外科中心，湖北武汉，中国。
⁵湖北省肝胆疾病重点实验室，湖北省肝外科临床医学研究中心，湖北武汉，中国。
⁶教育部器官移植重点实验室；NHC器官移植重点实验室；中国医学科学院器官移植重点实验室，湖北武汉。
⁷华中科技大学同济医学院同济医院老年科，湖北武汉。
⁸安徽医科大学病理生理学系，安徽合肥，中国。

PMID： 34905649
预防性维修识别码：项目管理委员会8761011
内政部： 10.1111/acel.13532

生长分化因子11通过抑制自噬加速肝脏衰老

孙健等。老化细胞. 2022年1月.

.2022年1月；21（1）：e13532。

doi:10.1111/acel.13532。 Epub 2021年12月14日。

作者

孙健^1 2, 李颖^三, 肖扬^三, 魏东^4 5 6, 杨建坤^三, 齐胡⁷, 张存泰⁷, 豪舒芳⁸, 刘安定^三

附属公司

¹中山大学中山纪念医院胆胰外科，广东广州。
²广东省恶性肿瘤表观遗传学与基因调控重点实验室，中山大学中山纪念医院，广州，中国。
^三华中科技大学同济医学院同济医院实验医学中心，中国湖北省武汉市。
⁴华中科技大学同济医学院同济医院肝外科中心，湖北武汉，中国。
⁵湖北省肝胆疾病重点实验室，湖北省肝外科临床医学研究中心，湖北武汉，中国。
⁶教育部器官移植重点实验室；NHC器官移植重点实验室；中国医学科学院器官移植重点实验室，湖北武汉。
⁷华中科技大学同济医学院同济医院老年科，湖北武汉。
⁸安徽医科大学病理生理学系，安徽合肥，中国。

PMID： 34905649
预防性维修识别码：项目管理委员会8761011
内政部： 10.1111/acel.13532

摘要

生长分化因子11（GDF11）的“复兴”作用最近受到质疑，其在肝脏衰老中的作用以及可能的信号机制尚不清楚。为了过度表达或击倒GDF11，分别向老龄雄性小鼠注射单剂量的腺相关病毒-GDF11或腺病毒小发夹RNA-GDF11。GDF11过表达显著加速衰老小鼠的肝脏衰老，而GDF11敲低具有相反的作用。同时，GDF11过度表达小鼠的肝脏自噬通量受损。相反，GDF11敲除增加自噬流量。此外，雷帕霉素成功地恢复了GDF11过度表达小鼠受损的自噬流量，并缓解了肝脏衰老，而GDF11敲除介导的益处被自噬抑制剂巴非霉素A1所抵消。GDF11导致溶酶体生物发生率下降，导致自噬体清除阶段的自噬通量缺陷。从机制上讲，GDF11显著激活雷帕霉素复合物1（mTORC1）的哺乳动物靶点，随后抑制转录因子EB（TFEB），后者是溶酶体生物发生和自噬的主要调节因子。抑制mTORC1或TFEB过度表达可挽救GDF11受损的自噬流量和细胞衰老。肝细胞特异性GDF11缺失不会改变血清GDF11水平和肝脏衰老。总之，通过mTORC1/TFEB信号传导抑制自噬活性可能是GDF11加剧肝脏衰老的关键分子机制。GDF11可能对肝脏衰老有不利影响，而不是一种“恢复活力”的药物。

关键词：自噬；肝细胞；肝脏；衰老。

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未申报。

数字

图1
GDF11加剧了衰老诱导的肝脏衰老。静脉注射单剂量AAV8‐GDF11（5×10）的老龄雄性C57BL/6J小鼠（20个月）¹¹VG/小鼠）检测前8周。（a）肝组织中SA‐β‐gal染色的代表性显微照片（原始放大倍数，40倍或400倍）。（b）肝组织中p16或GDF11免疫荧光染色的代表性图像（原始放大倍数，400倍）。（c）年轻对照组SA‐β‐gal‐阳性染色细胞面积的正常化百分比。（d） p16或GDF11荧光强度归一化为年轻对照。数据显示为平均值±*标准偏差*,n个=每组4-6个*第页与旧控制或AAV8‐Null组相比<0.05

图2
GDF11损害肝细胞的自噬流量。从老龄小鼠（20个月）中分离出原代肝细胞，然后在GDF11（100 ng/ml）存在下培养48 h。（a） Atg16L1、Atg5、LC3B和p62蛋白表达的Western blot分析。（b） Atg16L1、Atg5、LC3B‐II和p62的密度分析。（c）检测前用氯喹（10μM）处理原代肝细胞6小时。LC3B和p62蛋白表达的Western blot分析。（d） LC3B‐II/GAPDH和p62/GAPDH比值归一化为车辆控制的密度分析。（e） AML‐12细胞在GDF11（100 ng/ml）存在下培养48小时。有或没有GDF11处理的AML‐12细胞中LC3B和p62染色的代表性显微照片（原始放大倍数，400倍）。（f）量化每个细胞中LC3B点和p62点的数量。（g）用mCherry‐GFP‐LC3质粒瞬时转染后，在GDF11（100 ng/ml）存在下培养AML‐12细胞48小时。（h）量化每个细胞中代表自噬体（黄色）和自溶体（红色）的LC3B点的数量。实验一式三份，结果相似。数据显示为平均值±*标准偏差*, *第页与车辆组相比<0.05

图3
GDF11的过度表达通过损伤自噬活性加速肝脏衰老。（a）实验时间表：老龄雄性近交系C57BL/6J（20个月）小鼠静脉注射单剂量AAV8‐GDF11（5×10¹¹VG/鼠标）。从第4周起，每天给AAV8‐GDF11治疗的老龄小鼠注射雷帕霉素（Rap，1mg/kg，腹腔注射）。第8周，按照布局图所示，处死小鼠并收获肝脏。（b）肝组织中SA‐β‐gal染色的代表性显微照片（原始放大倍数，40倍或400倍）。（C）肝组织中p16免疫荧光染色的代表性图像（原始放大倍数，400倍）。（d） SA‐β‐gal‐阳性染色细胞面积归一化为车辆对照的百分比。（e） p16荧光强度归一化为车辆控制。（f）对p-4E‐BP1、4E-BP1、p-p70S6K、p70S6K、LC3B、p62、p16、p21和PCNA蛋白表达进行Western blot分析。（g） p-4E‐BP1、p-p70S6K、LC3B‐II、p62、p16、p21和PCNA的密度分析。数据显示为平均值±*标准偏差*,n个=每组4人*第页与车辆组相比<0.05

图4
GDF11降低溶酶体功能。（a）在GDF11（100 ng/ml）存在下培养AML‐12细胞瞬时表达GFP‐LC3 48小时。用LysoTracker Red DND‐99染色后，用共焦显微镜检查细胞。免疫荧光共聚焦显微镜显示LC3 puncta和LysoTracker Red在有或无GDF11的情况下共定位（原始放大倍数，400倍）。（b）荧光强度LC3与Lysotracker信号重叠的量化，并归一化为车辆控制。（c） AML‐12细胞中自猝灭DQ‐BSA的代表性图像（原始放大倍数，400倍）。（d） DQ‐BSA荧光强度的量化标准化为车辆控制。（e）组织蛋白酶B、ATP6V1a和ATP6V1b2蛋白表达的Western blot分析。（f）组织蛋白酶B、ATP6V1a和ATP6V2b2的密度测定分析。实验一式三份，结果相似。数据显示为平均值±*标准偏差*, *第页与车辆组相比<0.05

图5
GDF11抑制TFEB活性。（a） AML‐12细胞在GDF11（100 ng/ml）存在下培养48小时。TFEB及其靶基因VPS11和ATP6V1H mRNA水平的qRT‐PCR分析。（b）在GDF11（100 ng/ml）存在下培养AML‐12细胞瞬时表达GFP‐TFEB 48小时。免疫荧光共聚焦显微镜显示TFEB在有或无GDF11的情况下定位（原始放大倍数，400倍）。（c）核TFEB荧光强度根据车辆控制标准化。（d） TFEB总蛋白表达的蛋白质印迹分析。（e）总TFEB的密度分析。（f）核TFEB蛋白表达的Western blot分析。（g）核TFEB的密度分析。实验一式三份，结果相似。数据显示为平均值±*标准偏差*, *第页与车辆组相比<0.05

图6
猛禽击倒拯救溶酶体的生物发生和自噬。（a）用siRNA阴性或siRNA猛禽转染AML‐12细胞，然后在GDF11（100 ng/ml）存在下培养48小时。免疫荧光共聚焦显微镜显示TFEB在带有或不带有siRNA-Raptor的AML‐12细胞中的定位（原始放大倍数，400倍）。（b）核TFEB荧光强度归一化为对照。（c）组织蛋白酶B蛋白表达的Western blot分析。（d）组织蛋白酶B的密度分析（e）猛禽耗尽的AML‐12细胞LysoTracker染色的代表性图像（原始放大倍数，400倍）。（f） LysoTracker信号强度标准化为对照。（g） Western blot分析服用或不服用氯喹（10μM）6小时后Raptor缺乏的AML‐12细胞中LC3B和p62蛋白表达。（h） LC3B‐II/GAPDH和p62/GAPDH比值归一化为车辆控制的密度分析。实验一式三份，结果相似。数据显示为平均值±*标准偏差*, *第页与车辆组相比<0.05

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1. Ashapkin，V.V.、Kutueva，L.I.和Vanyushin，B.F.（2020年）。联体对衰老和年龄相关疾病的影响。实验医学和生物学进展，1260，107–122。10.1007/978-3-030-42667-5_5-内政部-公共医学
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[1] Andersson，O.、Reissmann，E.和Ibanez，C.F.（2006）。生长分化因子11通过转化生长因子β受体ALK5发出信号，对前后轴进行区域化。EMBO报告，7（8），831-837。10.1038/sj.embor.7400752-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

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