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.2021年12月；17(12):4423-4441.
doi:10.1080/15548627.2021.1917948。 Epub 2021年4月27日。

HBx通过ARRB1介导的自噬诱导肝细胞癌的发生1/S循环

雷一鸣 1 2, 徐宣 1 2, 刘慧玲 1 2, 陈凌军 1 2, 周浩雄 1 2, Jie Jiang（解江） 1 2, 杨一东 1 2, 吴斌（Bin Wu） 1 2
附属机构

HBx通过ARRB1介导的自噬诱导肝细胞癌的发生1/S循环

雷一鸣等。 自噬. 2021年12月.

摘要

乙型肝炎病毒X蛋白（HBx）通过激活多种癌基因参与肝细胞癌的过程。我们之前的研究表明，ARBB1（arrestin beta 1）促进肝细胞癌发生（HCC）。然而，ARRB1在HBx相关肝癌中的作用尚不清楚。在此，我们发现ARRB1被HBx上调体内和体外试验。箭头1在几种小鼠模型中，缺乏抑制HBx诱导的肝细胞癌发生。此外ARRB1号机组阻断HBx诱导的大自噬/自噬通量，并破坏自噬体的形成。ARRB1与HBx相互作用，自噬核心蛋白MAP1LC3/LC3是一种支架蛋白，对完全自噬至关重要。3-甲基腺嘌呤抑制自噬或干扰自动液位计5或自动液位计7通过诱导G1/S逮捕。自噬的缺失消除了CDK2的磷酸化和CDK2-CCNE1复合物的活性。我们的结果表明，ARRB1通过调节自噬和CDKN1B-CDK2-CCNE1-E2F1轴在HBV相关肝癌中发挥关键作用，并表明ARRB1可能是肝癌的潜在治疗靶点。缩写：ARRB1：抑制素β1；ACTB：肌动蛋白β；AMPK：一磷酸腺苷（AMP）激活的蛋白激酶；ATG5：自噬相关5；ATG7：自噬相关7；Baf A1：巴非霉素A1; CDK2：细胞周期蛋白依赖性激酶2；CDKN1B/p27Kip1：细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1B；CQ：氯喹；E2F1：E2F转录因子1；FBS：胎牛血清；GPCRs:G蛋白偶联受体；GST：谷胱甘肽S-转移酶；HCC：肝细胞癌；HBV：乙型肝炎病毒；HBx：乙型肝炎病毒X蛋白；HMGB1：高迁移率组盒1；HIF1A/HIF-1α：缺氧诱导因子1亚单位α；IHC：免疫组织化学；JAK1：Janus激酶1；LOX：赖氨酰氧化酶；MAP1LC3B/LC3：微管相关蛋白1轻链3β；MKI67：增殖标志物Ki-67；MTOR：雷帕霉素激酶的机制靶点；MAPK：丝裂原活化蛋白激酶；3-MA:3-甲基腺嘌呤；NFKB/NF-κB：核因子κB；PIK3CA：磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶催化亚单位α；PIK3C3：磷脂酰肌醇3-激酶催化亚基3型；PHHs：原代人肝细胞；RB1:RB转录辅抑制因子1；SQSTM1/p62：螯合体1；STAT：信号转导子和转录激活子；TACR1/NK1R：速激肽受体1。

关键词：ARRB1；自噬；细胞周期；乙型肝炎病毒X蛋白；肝细胞癌。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明，他们没有相互竞争的利益。

数字

图1。
图1。
ARRB1参与患者HBV相关肝细胞癌的发生。（A） 人类正常肝组织、慢性肝炎组织、肝硬化组织、肝癌和癌旁组织中H&E染色、HBx和ARRB1染色的代表性图像。比例尺：100μm。（B） 指示组织中HBx染色的H评分。（C） 指示组织中ARRB1染色的H评分。（D）ARRB1号机组人类正常肝组织、肝癌和癌旁组织中的mRNA水平。western blotting检测正常肝组织、肝癌组织和癌旁组织中（E和F）HBx和ARRB1蛋白的表达。ACTB被用作加载控制。每组n=10。（G） HBx和ARRB1 H核在HCC和癌旁组织中的相关性，以及在HCC和癌旁组织中的总相关性。（H） 两者之间的相关性HBx公司和ARRB1号机组mRNA在肝癌和癌旁组织中的表达，以及肝癌和癌前组织中的总相关性。采用皮尔逊相关系数评价相关性。采用单因素方差分析对其余数据进行分析。所有值均为平均值±SD
图2。
图2。
HBx诱导ARRB1表达在体外和体内（A）WT和HBx公司-4个月龄和18个月龄的TG小鼠。T、 肿瘤。P、 癌旁组织。比例尺：100μm。通过对4个月龄和18个月龄小鼠肝组织的western blot分析测定（B和C）ARRB1蛋白的表达。n=6。右侧所示的3个独立实验的量化表示相对ARRB1水平归一化为ACTB。（D） 相对mRNA水平ARRB1号机组在LO2、HepG2、Hep3B和HepG2.2.15细胞系中。（E） 所示细胞中ARRB1蛋白水平的Western blot分析。（F） 相对mRNA水平ARRB1号机组在LO2和HepG2细胞中转染HA-HBx公司质粒或空载体。（G） 瞬时转染HBx和ARRB1蛋白的细胞的Western blot分析HA-HBx公司质粒48h。（H） 瞬时转染HBx和ARRB1蛋白的细胞的Western blot分析GFP-ARRB1型质粒48h。（一） LO2细胞瞬时转染HA HBx公司质粒48小时。用抗HBx抗体对细胞裂解物进行免疫沉淀。如图所示，用抗ARRB1抗体检测共免疫沉淀内源性ARRB1。（J）HA-HBx公司质粒或空载体与ARRB1号机组荧光素酶活性测定中的启动子构建。转染后测量与Renilla对照组相关的荧光素酶活性。采用Student t检验（两组）或单因素方差分析（两组以上）进行统计分析。所有数据均为三个实验的平均值±SD
图3。
图3。
箭头1缺乏抑制自发和低剂量DEN诱导的肝细胞癌变HBx公司-TG小鼠。（A） 的MRI图像和肝脏照片HBx公司+/+箭头1+/+和HBx公司+/+棱体1−/-4月龄和18月龄小鼠。比例尺：5 mm。（B）量化平均肝脏重量占体重的百分比。肝肿瘤平均数的量化HBx公司+/+箭头1+/+和HBx公司+/+棱体1−/-18个月龄的小鼠。中最大肿瘤大小（直径）的量化HBx公司+/+拖欠1+/+和HBx公司+/+棱体1−/-18个月龄的小鼠。肿瘤平均大小（直径）的量化HBx公司+/+箭头1+/+和HBx公司+/+棱体1−/-18个月龄的小鼠。每组n=15。（C） 肝组织的代表性H&E染色HBx公司+/+箭头1+/+和HBx公司+/+棱体1负极/-4月龄和18月龄小鼠。T、 肿瘤。P、 癌旁组织。比例尺：100μm。（D） 肝脏组织的代表性MKI67染色HBx公司+/+箭头1+/+和HBx公司+/+棱体1−/-4个月龄和18个月龄小鼠的MKI67指数得分（每组n=6）。比例尺：100μm。WT和棱体1−/-用单次腹腔注射DEN（15 mg/kg）治疗小鼠。HBx公司+/+箭头1+/+和HBx公司+/+棱体1负极/-小鼠用单次腹膜内注射DEN（5mg/kg）进行处理。所有肝脏在9个月时收获。（E） 9个月时DEN诱导的肝肿瘤照片。比例尺：5 mm。（F）来自WT和棱体1−/-老鼠。比例尺：100μm。（G） DEN诱导的WT和WT肝肿瘤的MKI67染色棱体1−/-9个月龄的小鼠和MKI67指数得分（每组n=6）。比例尺：100μm。（H） 9个月时低剂量DEN诱导的肝肿瘤照片。比例尺：5 mm。（I）低剂量DEN诱导的肝肿瘤的代表性H&E染色HBx公司+/+箭头1+/+和HBx公司+/+arrb1型−/-老鼠。T、 肿瘤。P、 癌旁组织。比例尺：100μm。（J） DEN诱导的肝肿瘤中MKI67染色HBx公司+/+箭头1+/+和HBx公司+/+棱体1−/-9个月龄的小鼠和MKI67指数得分（每组n=6）。比例尺：100μm。（K） 量化平均肝脏重量占体重的百分比。肝肿瘤平均数的量化HBx公司+/+箭头1+/+和HBx公司+/+棱体1−/-9个月时的小鼠。最大肿瘤大小（直径）的量化HBx公司+/+箭头1+/+和HBx公司+/+棱体1−/-9个月龄的小鼠。肿瘤平均大小（直径）的量化HBx公司+/+箭头1+/+和HBx公司+/+棱体1−/-9个月龄的小鼠。每组n=10。所有值均为平均值±SD。P（P）<0.05，使用Student t检验
图4。
图4。
HBx增强肝细胞癌变过程中的自噬。（A） 人类正常肝组织、肝癌和癌旁组织中HBx、BECN1和SQSTM1染色的代表性图像和量化。比例尺，100μm。（B） 采用免疫印迹法检测BECN1、LC3B和SQSTM1蛋白在人正常肝组织、肝癌组织和癌旁组织中的表达。蛋白质定量如右图所示。每组n=6。（C） 肝癌组织行HBx和BECN1双重免疫荧光染色。细胞核用蓝色DAPI染色。比例尺：100μm。（D） WT和WT肝组织中BECN1和SQSTM1染色的代表性图像和量化HBx公司-4个月龄和18个月龄的TG小鼠。比例尺：100μm。（E） WT和WT中HBx、BECN1、LC3B和SQSTM1蛋白的表达HBx公司-采用western blotting法检测4月龄和18月龄TG小鼠肝组织。蛋白质定量如右图所示。每组n=6。（F） 在WT和HBx公司-18个月龄TG小鼠肝组织的电镜观察。比例尺：500 nm。（G） 自噬体和自溶体（黄色箭头所示）在HA-HBx公司质粒或空载体转染LO2和HepG2细胞。比例尺：500 nm。（H） LC3免疫荧光染色HA-HBx公司质粒或空载体转染LO2和HepG2细胞。比例尺：10μm。按照材料和方法中的描述对LC3B点进行量化。（一） Western blotting分析转染了HBx、BECN1、LC3B和SQSTM1基因的LO2和HepG2细胞中的蛋白表达HA-HBx公司质粒或空载体。（J） LO2和HepG2细胞转染HA HBx公司含有或不含有氯喹的质粒或空载体（CQ，10μM 1 h）。采用Western blotting检测LC3B蛋白。LC3B的量化如下图所示。所有定量数据均为平均值±标准偏差，由3个独立实验获得。采用Student t检验（两组）或单因素方差分析（两组以上）进行统计分析
图5。
图5。
删除ARRB1号机组抑制HBx诱导的自噬体形成。（A） 用stubRFP-sensGFP-LC3慢病毒感染HBx稳定表达的LO2和HepG2细胞，然后用si-ARRB1号机组或siNC 48小时。细胞中LC3荧光强度的典型共焦显微镜图像。Nuclei用DAPI高亮显示。比例尺：20μm。（B） 每个字段中LC3点的量化。（C） 通过蛋白质印迹法测定细胞中ARRB1、BECN1、LC3B和SQSTM1蛋白的表达。（D） 所示蛋白质在不同组中的相对表达水平。（E） 肝组织BECN1和SQSTM1染色的代表性图像HBx公司+/+箭头1+/+和HBx公司+/+棱体1−/-4月龄和18月龄小鼠。比例尺：100μm。（F） 通过计数1000个细胞/样品来确定指示阳性细胞的指数。每组n=6。（G） 自吞噬体和自溶酶体在来自HBx公司+/+箭头1+/+和HBx公司+/+棱体1−/-通过电子显微镜观察18个月时的小鼠。比例尺：500 nm。自噬体的定量如右图所示。每组n=6。（H） Western blot分析和定量分析BECN1、LC3B和SQSTM1蛋白在肝组织中的表达HBx公司+/+箭头1+/+和HBx公司+/+棱体1−/-18个月龄的小鼠。每组n=6。所有数据均为平均值±SD。采用Student t检验（两组）或单因素方差分析（两组以上）进行统计分析
图6。
图6。
ARRB1招募HBx和LC3B形成复合物，导致自噬的诱导。（A） 稳定HBx表达HepG2细胞中ARRB1和LC3B的双重免疫荧光染色。DAPI染色细胞核。比例尺：10μm。（B） 免疫沉淀法分析HBx表达HepG2细胞中LC3B、ARRB1和HBx之间的相互作用。转染后48小时HA HBx公司质粒，用抗ARRB1抗HA和抗LC3B抗体免疫沉淀细胞裂解物，并通过免疫印迹法检测蛋白质。IP，免疫沉淀。（C） 硅ARRB1号机组转染到稳定的HBx表达细胞中48小时。用抗HA抗体免疫沉淀法分析HBx和LC3B之间的相互作用。（D） HA-ARRB1型将构建物转染到稳定的HBx表达细胞中48小时。用抗HA抗体免疫沉淀法分析HBx和LC3B之间的相互作用。（E） 将固定在谷胱甘肽树脂上的重组GST或GST-ARRB1与纯化的重组LC3B孵育。ARRB1和LC3B之间直接相互作用的分析在体外通过使用GST亲和性分离分析。（F） 将固定在谷胱甘肽树脂上的重组GST或GST-ARRB1与纯化的重组HBx孵育。ARRB1和HBx之间直接相互作用的分析在体外通过使用GST亲和性分离分析。（G） 将固定在谷胱甘肽树脂上的重组GST或GST-HBx与纯化的重组LC3B孵育。HBx和LC3B之间直接相互作用的分析在体外通过使用GST亲和分离测定
图7。
图7。
抑制自噬触发G1/HBx诱导增殖中的S阻滞。（A） HA-HBx公司将构建或空载体转染到LO2或HepG2细胞中，加入或不加入3-MA（5 mM）24小时。治疗后用EdU掺入法检测细胞增殖。比例尺：100μm。（B） EdU分析中阳性细胞的定量。阳性细胞百分比通过计数1000个细胞/样品来确定。（C） Western blot分析上述处理对LO2或HepG2细胞中HBx和PCNA蛋白表达的影响。（D） LO2或HepG2细胞中相对PCNA蛋白表达的量化。（E） 用含或不含3-MA（5 mM）的10%FBS刺激同步表达HBx的LO2和HepG2细胞24 h，然后进行PI染色和流式细胞术。不同组间的细胞周期分布。（F） mRNA水平CCNE1公司和CDK2型采用实时荧光定量PCR技术检测各组间的差异。（G） 用上述处理对LO2或HepG2细胞中HBx、LC3B、SQSTM1、CCND1、CCNE1和CDK2蛋白表达的蛋白质印迹分析。所有数值均为平均值±标准差。采用单因素方差分析进行统计分析
图8。
图8。
删除ARRB1号机组提升G1/通过下调HBx诱导增殖中的自噬来阻止S。（A）ARRB1号机组被感染的LO2和HepG2细胞中的siRNA下调HA-HBx公司慢病毒。用EdU掺入法检测细胞增殖。比例尺：100μm。（B）ARRB1号机组在稳定表达HBx的LO2和HepG2细胞中被shRNA慢病毒下调。通过CCK-8测定处理后的细胞生长曲线。（C） 用PI对经上述处理的LO2和HepG2细胞进行染色，并用流式细胞仪检测细胞周期分布。（D） Western blot分析上述处理对LO2或HepG2细胞中HBx、CCNE1和CDK2蛋白表达的影响。（E） 18个月大鼠肝组织CCNE1、CDK2和MKI67染色的代表性图像和定量HBx公司+/+箭头1+/+和HBx公司+/+棱体1−/-老鼠。黑色三角形表示CDK2强阳性细胞。比例尺：100μm。每组n=6。（F） Western blot分析HBx、CCNE1和CDK2蛋白表达HBx公司+/+箭头1+/+和HBx公司+/+棱体1−/-4月龄和18月龄小鼠。蛋白质的密度测定如下图所示。每组n=6。（G和H）将稳定表达ARRB1的Hep3B和HepG2.2.15细胞从血清中去除48小时，然后用10%FBS刺激24小时或从血清中去除24小时，然后进行PI染色和流式细胞术。不同组间的细胞周期分布。（I和J）采用上述处理对稳定表达ARRB1的Hep3B和HepG2.2.15细胞中CCNE1、CDK2和PCNA蛋白表达进行Western blot分析。所有值均为平均值±SD。采用Student t检验（两组）或单因素方差分析（两组以上）进行统计分析
图9。
图9。
HBx促进ARRB1介导的自噬驱动G1/S的方式取决于CDKN1B-CDK2-CCNE1-E2F1轴。（A） Western blot分析经3-MA处理（5 mM，24 h）的稳定表达HBx的LO2和HepG2细胞中HBx、CDKN1B、CCNE1、p-CDK2、CDK2，p-RB1、E2F1和PCNA蛋白的表达。（B） Western blot分析3-MA（5 mM，24 h）处理的稳定表达ARRB1的Hep3B和HepG2.2.15细胞中ARRB1、CDKN1B、CCNE1、p-CDK2、CDK2，p-RB1、E2F1和PCNA蛋白表达。（C和D）通过免疫沉淀法分析CCNE1和CDK2在稳定表达HBx的LO2和HepG2细胞中与上述3-MA治疗的相互作用。（E和F）免疫沉淀法分析上述3-MA处理后稳定表达ARRB1的HepG2和HepG2.2.15细胞中CCNE1和CDK2的相互作用
图10。
图10。
ARRB1介导的自噬驱动G的拟议机制1/HBx诱导的HCC中的S周期。HBx增强了肝癌中ARRB1的表达水平。HBx促进自噬，并通过与ARRB1的相互作用促进LC3B酯化形成自噬体。HBx诱导的自噬加速CDKN1B降解。抑制ARRB1介导的自噬抑制CDK2-CCNE1复合物活性，然后阻断G1/HBx诱导细胞增殖的S周期
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