PASylated Thymosin α1: A Long-Acting Immunostimulatory Peptide for Applications in Oncology and Virology

doi:10.3390/ijms22010124

。2020年12月24日；22(1):124.

doi:10.3390/ijms2201124。

PASylated Thymosinα1：一种在肿瘤和病毒学中应用的长效免疫刺激肽

Uli活页夹¹, 阿恩·斯凯拉²

附属公司

¹XL-Protein GmbH，Lise-Meitner-Str.30，85354 Freising，Germany公司。
²Lehrstuhl für Biologische Chemie，慕尼黑理工大学，Emil Erlenmeyer Forum 5，85354 Freising，德国。

PMID： 33374407
预防性维修识别码： PMC7795856号
内政部： 10.3390/ijms2201124

PASylated Thymosinα1：一种在肿瘤和病毒学中应用的长效免疫刺激肽

Uli活页夹等人。国际分子科学杂志。 2020。

。2020年12月24日；22(1):124.

doi:10.3390/ijms2201124。

作者

Uli活页夹¹, Arne Skerra公司²

附属公司

¹XL-Protein GmbH，Lise-Meitner-Str.30，85354 Freising，Germany公司。
²Lehrstuhl für Biologische Chemie，德国慕尼黑理工大学，Emil-Erlenmeyer-Forum 5，85354 Freising。

PMID： 33374407
预防性维修识别码：第7795856页
内政部： 10.3390/ijms2201124

摘要

胸腺肽α1（Tα1）是一种免疫刺激肽，用于治疗乙型肝炎病毒（HBV）和丙型肝炎病毒（HCV）感染，并用作免疫增强剂，在新冠肺炎感染和癌症方面也具有前景。这种N-末端乙酰化28-残留肽的制造要求很高，其短血浆半衰期限制了体内药效，需要频繁给药。在这里，我们将PAS化技术与RimJ的酶促原位N-乙酰化结合起来，在大肠杆菌高产。对纯化融合蛋白的ESI-MS分析表明，预期的成分没有任何蛋白水解迹象。SEC分析显示，与600个残基的构象紊乱的Pro/Ala/Ser（PAS）多肽融合后，水动力体积增加了10倍。与最初的合成肽相比，由于肾脏过滤迟缓，这种尺寸效应导致大鼠的血浆半衰期延长了8倍以上。我们的研究为下一代胸腺肽α1延长循环的治疗发展提供了基础。一般来说，生产N-末端保护的PASylated肽的策略解决了肽药物的三个主要问题：（i）表达宿主的不稳定性，（ii）血清外肽酶的快速降解，以及（iii）由于快速肾脏清除而导致的低生物活性。

关键词：新型冠状病毒肺炎；PAS化；biobetter；癌症；药物传递；半衰期延长；免疫刺激肽；药代动力学；胸腺肽α1；病毒性疾病。

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利益冲突声明

U.B.和A.S.是XL-protein GmbH的联合创始人和股东。

数字

图1
N-末端乙酰化Tα1-PAS的细菌产生。(一)诱导型tet控制下双顺反子操纵子Tα1-PAS和N-乙酰转移酶RimJ的表达载体^采购订单pASK75上克隆的基因盒包括T7噬菌体核糖体结合位点（T7 RBS），随后是融合到601位PAS#1序列的人类Tα1编码序列、第二个RBS、RimJ编码序列和脂蛋白终止子（T_{液化石油气}). (b)Tα1-PAS的4–12%SDS–PAGE后的Western blot分析*大肠杆菌*使用针对PAS#1序列的抗体裂解整个细胞。M、蛋白质尺寸标准；车道1，诱导前全细胞提取；第2道，诱导15h后提取全细胞。(**c（c）**)纯化Tα1-PAS的10%SDS-PAGE。M、蛋白质尺寸标准；泳道1，硫酸铵沉淀、消减阴离子交换（AEX）、阳离子交换（CEX）和最终AEX色谱后的Tα1-PAS。

图2
分析Tα1-PAS N-乙酰化、肽纯度和流体动力学体积。(一)减去AEX步骤（见正文）后，Tα1-PAS流通馏分的去卷积ESI-MS光谱显示分子量为52734.56 Da，对应于N-乙酰化的Tα1-PAS（计算质量：52734.56 Da）。(b)对同一色谱中结合和洗脱的肽部分进行ESI-MS分析，发现分子质量为52692.37 Da，与计算的非乙酰化Tα1-PAS质量（52692.54 Da）相匹配。(**c（c）**)流动馏分的反相色谱表明N-乙酰化Tα1-PAS的纯度>96%。(d日)最终纯化的Tα1-PAS在磷酸盐缓冲盐水（PBS）存在下的分析SEC产生一个洗脱体积为13.5 mL的单峰。与半对数校准曲线（插图）的比较表明，流体动力体积扩大，表观分子尺寸为557 kDa。

图2
分析Tα1-PAS N-乙酰化、肽纯度和流体动力学体积。(一)减去AEX步骤后Tα1-PAS流通分数的反褶积ESI-MS光谱（见正文）显示出52734.56 Da的分子质量，对应于N-乙酰化Tα1-PA（计算质量：52734.56Da）。(b)对同一色谱中结合和洗脱的肽部分进行ESI-MS分析，发现分子质量为52692.37 Da，与计算的非乙酰化Tα1-PAS质量（52692.54 Da）相匹配。(**c（c）**)流动馏分的反相色谱表明N-乙酰化Tα1-PAS的纯度>96%。(d日)最终纯化的Tα1-PAS在磷酸盐缓冲盐水（PBS）存在下的分析SEC产生一个洗脱体积为13.5 mL的单峰。与半对数校准曲线（插图）的比较表明，流体动力体积扩大，表观分子尺寸为557 kDa。

图3
Tα1肽N-末端PASylated版本的制备及其完整性、纯度和流体力学体积分析。(一)细菌产生PAS-Tα1的表达载体。pASK75上克隆的基因盒包括T7 RBS、601-残基PAS#1序列的编码区、起始蛋氨酸和脯氨酸密码子、人类Tα1序列，以及_{液化石油气}. (b)PAS-Tα1的反褶积ESI-MS光谱*大肠杆菌*通过AEX和CEX减法提取的细胞（见正文）显示分子质量为52789.69 Da，这与PAS-Tα1的计算质量和完全加工的起始蛋氨酸（52789.66 Da）相匹配。(**c（c）**)反相色谱表明PAS-Tα1的纯度>96%。(d日)PBS中纯化PAS-Tα1的分析SEC产生一个洗脱体积为13.2 mL的单峰。与半对数校准曲线（插图）进行比较表明，流体动力体积强烈膨胀，表观分子尺寸为665 kDa。

图4
大鼠N-乙酰化Tα1-PAS的PK研究。将Tα1-PAS以3.4 mg/kg b.w.的剂量皮下注射到雌性Wistar大鼠体内(N个= 5). 用夹心ELISA法定量血浆中融合蛋白的浓度。根据注射后取样时间（p.i.）绘制数据，并使用单室模型进行拟合。PK曲线显示出不同的吸收和消除阶段（PK参数见表1）。

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