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.2020年7月1日；39（13）：e103325。
doi:10.15252/embj.2019103325。 Epub 2020年6月8日。

髓样细胞通过血管生成素/丛蛋白B2轴保护肠上皮屏障的完整性

白荣攀 # 1 2, 德森·孙 # 1, 陈木雄 # 1, 石晓良 1, 梁洛 三, 姚正荣 1, 刘亚欣 1, 葛小龙 4, 高向伟 1, 胡国富 5, Wei Zhou公司 4, 盛景浩 1 2 6, 徐正平 1 2 6
附属公司

髓样细胞通过血管生成素/丛蛋白B2轴保护肠上皮屏障的完整性

白荣攀等。 欧洲工商管理硕士J. .

摘要

髓细胞和上皮细胞之间的通讯在维持肠上皮屏障完整性方面起着关键作用。髓样细胞通过产生多种介质与肠上皮细胞相互作用；然而，调节其串扰的分子仍不完全清楚。在这里，我们报告了小鼠髓系细胞中血管生成素（Ang）的缺乏导致上皮屏障完整性受损，导致对DSS诱导的结肠炎高度敏感。从机制上讲，髓系细胞源性血管生成素通过丛蛋白B2介导tRNA-源性应激诱导小RNA（tiRNA）的产生和核糖体RNA（rRNA）的转录，分别促进IEC的存活和增殖。此外，重组血管生成素治疗显著减轻了实验性结肠炎的严重程度。在人类样本中，炎症性肠病（IBD）患者的血管生成素表达显著下调。总之，据我们所知，我们首次确定了一种维持上皮屏障完整性的髓系细胞-IEC串扰的新介质，这表明血管生成素可能是IBD的一种新的预防剂和治疗靶点。

关键词：血管生成素；炎症性肠病；肠上皮细胞；髓细胞。

PubMed免责声明

利益冲突声明

提交人声明他们没有利益冲突。

数字

图1
图1。昂在IBD公司患者样本
  1. 一个

    mRNA表达ANG公司正常对照结肠组织中(n个=25）和UC(n个=27）或CD(n个=46）名患者。

  2. B类

    正常对照组和UC或CD患者结肠组织中ANG的典型Western印迹。

  3. C类

    正常对照组和UC或CD样本中ANG免疫组化（IHC）染色的代表性图像。

  4. D类

    正常人ANG表达评分的相应统计分析(n个=10）和UC(n个=10）或CD(n个=15）名患者。

  5. E类

    在轻度和重度IBD样本中显示苏木精-伊红（HE）染色和ANG IHC染色的代表性图像。

  6. F、 G公司

    轻度患者ANG表达评分的统计分析(n个=18）和严重(n个=19）UC（F）或轻度(n个=20）和严重(n个=20）CD（G）患者。

数据信息：比例尺，100μm；数据显示为小提琴图（A）或平均值±SEM（D、F和G）；Kruskal–Wallis与Dunn的多重比较检验（A和D）和Mann–Whitney检验（F和G）用于确定统计显著性(**P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001). UC：溃疡性结肠炎；CD：克罗恩病。可在线获取此图的源数据。
图2
图2。安（Ang）缺乏会增加对决策支持系统小鼠诱发的结肠炎
  1. 一个

    安（Ang）2.5%DSS处理的WT小鼠在指定时间点结肠组织中的mRNA表达(n个=4只小鼠/时间点）。

  2. B类

    3.5%DSS处理的Kaplan-Meier曲线安（Ang）缺乏小鼠(安（Ang） −/−,n个=14）或窝友控制（WT，n个 = 13).

  3. C、 D类

    （C） 体重减轻和WT（D）疾病活动指数（DAI）安（Ang） −/−带有(n个=9）或不带(n个=6）2.5%DSS处理。

  4. E–H（E–H）

    （E） 结肠长度、（F）血清FITC-右旋糖酐水平、（G）代表性HE染色图像以及（H）WT和安（Ang） −/−第9天的老鼠(n个=9）或不带(n个=6）2.5%DSS处理。

  5. 我

    WT和WT结肠组织中细胞因子基因的定量mRNA表达安（Ang） −/−第0天的老鼠(n个=3）或第9天(n个=9）在2.5%DSS治疗期间。

  6. J型

    WT和WT分离培养结肠组织上清液中可溶性细胞因子水平安（Ang） −/−第0天的老鼠(n个=3）或第9天(n个=7）在2.5%DSS治疗期间。

数据信息：比例尺，50μm；数据显示为平均值±SEM；ANOVA与Dunnett的多重比较测试（A）、幸存者函数等式的对数秩检验（B）、Mann-Whitney检验（D、F、H、I和J）和双尾未配对学生的t吨检验（C和E）用于确定统计显著性(*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）<0.001）。Ctrl：控制；DSS：右旋糖酐硫酸钠；FITC-葡聚糖：异硫氰酸荧光素标记的葡聚糖。可在线获取此图的源数据。
图3
图3。的不足安（Ang）髓系细胞导致结肠炎加重
  1. A、 B类

    （A） 体重减轻和（B）体重的DAI→重量，安（Ang） −/−→重量和重量→安（Ang） −/−嵌合体小鼠(n个=7）或不带(n个=5）2.5%DSS处理。

  2. C–F类

    （C） 第8天嵌合体结肠炎小鼠结肠长度、（D）血清FITC-右旋糖酐水平、（E）代表性HE染色图像和（F）结肠切片组织病理学评分(n个=7）或不带(n个=5）2.5%DSS处理。

  3. G公司

    安（Ang）mRNA在小鼠淋巴细胞和髓细胞中的表达；数据代表两个独立的实验(n个 = 2).

  4. H、 我

    （H） 体重减轻和（I）DAI安（Ang） 飞行/飞行和利兹姆 cre公司 ;安（Ang） 飞行/飞行带有(n个=7）或不带(n个=3）2.5%DSS处理。

  5. J–M公司

    （J） 结肠长度、（K）血清FITC-右旋糖酐水平、（L）代表性HE染色图像和（M）结肠切片组织病理学评分安（Ang） 飞行/飞行和利兹姆 cre公司 ;安（Ang） 飞行/飞行第8天的老鼠(n个=7）或不带(n个=3）2.5%DSS处理。

数据信息：比例尺，50μm；数据显示为平均值±SEM；Kruskal–Wallis采用Dunn的多重比较测试（A、B和F），ANOVA采用Dunnett的多重比较检测（C和D），以及双尾未配对学生t吨检验（H、I、J、K和M）用于确定统计显著性(*对< 0.05, **对< 0.01, ***P（P）< 0.001).可在线获取此图的源数据。
图EV1
图EV1。嵌合体小鼠结肠细胞因子的产生和多系重组
  1. 一个

    WT结肠组织细胞因子基因的定量mRNA表达→WT和安（Ang） −/−→第0天的WT嵌合体小鼠(n个=3）或第8天(n个=7‐8）。

  2. B类

    嵌合体小鼠的多系重组分析(n个 = 5).

数据信息：数据显示为平均值±SEM、Mann-Whitney检验或双尾未配对学生t吨‐测试用于确定统计显著性(*P（P）< 0.05).可在线获取此图的源数据。
图EV2
图EV2。髓细胞来源ANG公司在衰减中发挥非细胞自主作用决策支持系统诱导性结肠炎
  1. A、 B类

    （A） 体重减轻和（B）DAI安（Ang） 飞行/飞行和维尔林 cre公司 ;安（Ang） 飞行/飞行带有(n个=8）或不带(n个=5）2.5%DSS处理。

  2. C类

    的冒号长度安（Ang） 飞行/飞行和维尔林 cre公司 ;安（Ang） 飞行/飞行第8天的老鼠(n个=8）或不带(n个=5）2.5%DSS处理。

  3. D类

    安（Ang）在指定的时间点，2.5%DSS处理的WT小鼠结肠髓样细胞中的mRNA表达。(n个=3–4/时间点）。

  4. E类

    WT的Kaplan–Meier曲线(n个=21）或安（Ang） −/−(n个=19）LPS诱导内毒素休克模型小鼠。

  5. F类

    WT的Kaplan–Meier曲线(n个=12）或安（Ang） −/−(n个=12）小鼠单核细胞增生李斯特菌（LM）诱导脓毒症模型。

  6. G、 H（H）

    WT或BMDM细胞因子基因的mRNA表达安（Ang） −/−在指定时间点给小鼠注射（G）LPS或（H）合成RNA双链多聚体（I:C）(n个=2–3/每组时间点）。

  7. 一、 J型

    （一） 流式细胞仪分析的代表图和（J）WT或安（Ang） −/−老鼠(n个=6）处于稳定状态。

  8. K、 L（左）

    CD45的百分比+CD11b型+（K） ，CD11b+等级6+，和CD11b+肿瘤坏死因子α+（L） LPS刺激的安（Ang） 飞行/飞行或利兹姆 cre公司 ;安（Ang） 飞行/飞行老鼠(n个=4）使用DSS治疗（第0天和第4天）。

  9. 米

    CD11b的MFI+IL6（IL6）+和CD11b+肿瘤坏死因子α+在LPS刺激的cLP中安（Ang） 飞行/飞行或利兹姆 cre公司 ;安（Ang） 飞行/飞行DSS治疗小鼠（第0天和第4天）(n个 = 4).

数据信息：数据显示为平均值±SEM；ANOVA和Dunnett的多重比较检验（D）用于确定统计显著性(***P（P）< 0.001); BMDM：骨髓源性巨噬细胞；MFI：平均荧光强度；LPS：脂多糖。可在线获取此图的源数据。
图4
图4。ANG公司‐PLXNB公司2轴对缓解至关重要决策支持系统小鼠诱导性结肠炎
  1. A、 B类

    （A） WT小鼠分离IECs或结肠层流固有细胞（cLP）中ANG和PLXNB2的定量mRNA表达和（B）Western blotting(n个 = 9).

  2. C类

    在WT小鼠冷冻结肠切片中显示ANG、PLXNB2和巨噬细胞表面标记物F4/80的免疫荧光染色的代表性图像。

  3. D类

    典型图像显示感染腺相关病毒（AAV9）的WT小鼠冷冻结肠切片中GFP和PLXNB2的免疫荧光染色。

  4. E类

    AAV9感染WT小鼠IECs中PLXNB2的表达（n=3）。

  5. F、 G公司

    （F） AA9感染的WT小鼠的体重减轻和（G）DAI(n个=7）或无(n个=5）2.5%DSS处理。

  6. H–K

    （H） 第8天感染AAV9的WT小鼠结肠长度、（I）血清FITC-右旋糖酐水平、（J）代表性HE染色图像和（K）结肠切片组织病理学评分(n个=7）或不带(n个=5）2.5%DSS处理。

比例尺，50μm；数据显示为平均值±SEM、Mann-Whitney检验（A、G和I）和双尾未配对学生t吨检验（E、F、H和K）用于确定统计显著性(*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01; ***P（P）< 0.001).可在线获取此图的源数据。
图EV3
图EV3。封锁ANG公司‐PLXNB公司2轴加重决策支持系统小鼠诱导性结肠炎
  1. 一个

    人结肠组织中分离的IECs或cLP细胞中ANG和PLXNB2的蛋白质印迹。

  2. B类

    来自同一组织样本的冷冻人类结肠切片中显示ANG、PLXNB2和巨噬细胞表面标记CD68免疫荧光染色的代表性图像。

  3. C类

    DSS诱导结肠炎模型中新霉素或硝胺治疗示意图(n个 = 5).

  4. D、 E类

    新霉素或新霉素对WT结肠炎小鼠体重减轻（D）和DAI（E）的影响(n个=5）。

  5. F–I型

    （F） 结肠长度，（G）血清FITC‐右旋糖酐水平，（H）代表性HE染色图像，以及（I）新霉素或新霉素治疗的WT结肠炎小鼠第8天结肠切片的组织病理学评分(n个 = 5).

  6. J型

    ANG救援实验示意图安（Ang） −/−结肠炎小鼠。用1.25 mg/kg重组ANG对小鼠进行预处理重量或ANG66A兰特蛋白质，然后进行DSS诱导(n个 = 8).

  7. K、 L（左）

    （K） ANG的体重减轻和（L）DAI重量‐或ANG66A兰特预处理安（Ang） −/−结肠炎小鼠(n个 = 8).

  8. M–P公司

    （M） 结肠长度、（N）血清FITC-右旋糖酐水平、（O）代表性HE染色图像和（P）ANG结肠切片组织病理学评分重量‐或ANG66A兰特预处理安（Ang） −/−结肠炎小鼠(n个=8）第8天。

数据信息：比例尺，50μm；数据显示为平均值±SEM；ANOVA和Dunnett的多重比较检验（D、E、F、G、K、L、M和P）以及Kruskal–Wallis和Dunn的多重比较试验（I和N）用于确定统计显著性(*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01***对< 0.001).此数字的源数据可在线获取。
图5
图5。ANG公司通过增强国际电工委员会生存与扩散
  1. A、 B类

    （A） 具有代表性的图像显示裂解caspase 3染色和（B）WT或安（Ang） −/−结肠炎小鼠(n个=3）在指定的时间点；箭头表示裂解的caspase三个阳性细胞；每个结肠切片有两个字段被量化。

  2. C、 D类

    WT或安（Ang） −/−结肠炎小鼠(n个=5）第4天。

  3. E、 F类

    （E） 显示Ki67染色和（F）WT或安（Ang） −/−结肠炎小鼠(n个=3）在指定的时间点；每个结肠切片有五个代表性的隐窝被量化。

  4. G、 H（H）

    来自WT或安（Ang） −/−结肠炎小鼠(n个=5）第4天。

  5. 一、 J型

    （一） 具有代表性的图像显示了裂解caspase 3染色和（J）结肠切片中凋亡细胞的数量安（Ang） 飞行/飞行和利兹姆 Cre公司 ;安（Ang） 飞行/飞行，或在第4天使用AAV‐shControl‐和AAV-shPlxnb2治疗的结肠炎小鼠(n个 = 3); 箭头指示裂解的胱天蛋白酶三阳性细胞；对每个结肠切片的两个字段进行量化。

  6. K、 L（左）

    （K） Ki67染色和（L）来自安（Ang） 飞行/飞行和利兹姆 Cre公司 ;安（Ang） 飞行/飞行，或在第4天使用AAV‐shControl‐和AAV-shPlxnb2治疗的结肠炎小鼠(n个 = 3); 每个结肠切片有五个代表性的隐窝被量化。

数据信息：比例尺：50μm；数据显示为平均值±SEM；Mann-Whitney检验（B和F）和双尾未配对学生t吨检验（D、H、J和L）用于确定统计显著性(*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001).可在线获取此图的源数据。
图EV4
图EV4。ANG公司保护肠上皮完整性减轻肠道炎症
代表性结肠切片（除非另有说明）重量或安（Ang） −/−对指定时间点的结肠炎小鼠进行以下分析：
  1. A、 B类

    （A） TUNEL染色和（B）凋亡细胞的定量（箭头表示阳性细胞；每个结肠切片的两个区域被定量；n个=3只小鼠/组）。

  2. C、 D类

    （C） BrdU在IECs中的掺入和（D）每个隐窝增殖细胞的量化（每个结肠段五个代表性隐窝被量化；n个=3只小鼠/组）。

  3. E、 F类

    （E） MUC2染色和（F）每个隐窝的MUC2阳性细胞的定量（用DAPI染料复染的细胞核；每个结肠切片的三个代表性隐窝被定量；n个＝3只小鼠/组）。

  4. G公司

    IECs中REG3A和DEFA3的Western印迹(n个=2只小鼠/组）。

  5. H（H）

    EUB338荧光染色就地隐窝杂交（FISH）（细胞核用Hoechst染料复染；箭头表示EUB338染色阳性）。

  6. 我

    RT-qPCR定量测定新鲜结肠组织中的相对细菌负荷(n个=4-6只小鼠/组）。

  7. J–M公司

    （J） ZO‐1染色和（K）相应的平均荧光强度（MFI）（细胞核用DAPI染料复染；每个结肠切片的三个场被量化；n个=3只小鼠/组）。同时，中性粒细胞（L）、单核细胞（M）和CD11b的百分比+CX3CR1系列整数（N） WT的cLP中的子集或安（Ang） −/−在指定的时间点计算结肠炎小鼠(n个=3–4/时间点）。

数据信息：比例尺：50μm；数据显示为平均值±SEM；双尾未成对学生的t吨检验（F、K、L、M和N）和Mann-Whitney检验（B、D和I）用于确定统计显著性(*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01).可在线获取此图的源数据。
图6
图6。ANG公司增强国际电工委员会通过介导不同细胞的存活和增殖核糖核酸生产
  1. 一个

    PLXNB2在HCT116中的表达（包括野生型HCT116（HCT116重量)和ANG敲除HCT116（HCT116击倒对手))通过流式细胞仪分析检测到的THP‐1。上面的三条虚线表示这些细胞未染色阴性对照的强度，而实线表示PLXNB2抗体染色的强度。

  2. B类

    THP1、HCT116条件培养基中分泌的ANG水平重量，或HCT116击倒对手(n个 = 3).

  3. C类

    ANG之间的相互作用重量、ANG66A兰特，或ANGK40I公司带HCT116中的PLXNB2击倒对手免疫共沉淀法检测。

  4. D类

    THP‐1衍生的血管紧张素转换为HCT116击倒对手Western blotting显示，在共培养系统中通过PLXNB2。

  5. E类

    HCT116的流式细胞术分析击倒对手如图所示，经过不同处理后，用annexin V和PI染色。

  6. F类

    tiRNA和5′-tiRNA阿拉HCT116生产击倒对手按照指示进行不同的处理。

  7. G公司

    5′-tiRNA敲除或过度表达对TNF-α诱导ANG细胞凋亡的影响重量‐或ANGK40I公司处理过的HCT116击倒对手.

  8. H（H）

    5′-tiRNA与细胞色素c（Cytc（c）)RIP检测HCT116细胞。

  9. 我

    HCT116的半胱氨酸天冬氨酸酶活性击倒对手按照指示进行不同的处理。

  10. J型

    HCT116的细胞活力击倒对手按照指示进行不同的处理。

  11. K（K）

    用Northern印迹法检测HCT116中47S前rRNA转录水平击倒对手按照指示进行不同的处理。

  12. L（左）

    tiRNA和5′-tiRNA阿拉与WT隔离的IEC生产安（Ang） −/−结肠炎小鼠。

  13. 米

    来自WT和安（Ang） −/−在指定时间点的结肠炎小鼠。

数据信息：Neamine，ANG和PLXNB2相互作用的阻断剂；siCtrl：控制siRNA；siPLXNB2-1和siPLXNBA2-2:PLXNB2 siRNA；si5′-tiRNA：tiRNA靶向siRNA；ANG公司66A兰特血管紧张素受体结合位点变异；ANG公司K40I公司，ANG酶活性无变异；BAY，TNF-α诱导的κB激酶（IKK）磷酸化抑制剂；数据显示为平均值±SEM，并代表（E、G、H、I和J）中的至少三个独立实验。ANOVA与Dunnett的多重比较检验（B、I和J）和Mann-Whitney检验（H）用于确定统计显著性(**P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001).可在线获取此图的源数据。
图EV5
图EV5。髓源性昂介导的ti核糖核酸生产国际电工委员会s通过PLXNB公司2
  1. 一个

    联合免疫沉淀法检测DSS治疗的WT小鼠IECs中ANG及其内源性抑制剂RNH1之间的相互作用。

  2. B–D类

    tiRNA和5′-tiRNA阿拉与（B）隔离的IEC生产安（Ang） 飞行/飞行或利兹姆 cre公司 ;安（Ang） 飞行/飞行，（C）骨髓嵌合体或（D）Plxnb2型击倒小鼠(n个=2）对DSS治疗的反应（第0天，第4天）。

  3. E类

    通过Northern印迹法检测从DSS治疗小鼠（第6天）分离的IECs中的5′-tiRNA。

  4. F类

    tiRNA和5′-tiRNA阿拉在ANG预防或治疗模型中，第6天从DSS治疗小鼠分离的IECs产生。当天接受DSS治疗但未补充ANG的小鼠作为对照(n个=2只小鼠/组）。

  5. G公司

    tiRNA和5′-tiRNA阿拉与DSS处理的WT隔离的IEC生产或Plxnb2型击倒小鼠(n个=2）在第6天注射或不注射ANG。

可在线获取此图的源数据。
图7
图7。重组ANG公司保护小鼠免受决策支持系统诱导性结肠炎
  1. 一个

    ANG预防模型示意图。老鼠(n个=8）用1.25 mg/kg重组ANG蛋白预处理，然后进行DSS诱导。

  2. B类

    WT小鼠结肠组织中ANG的蛋白质印迹(n个＝2）在ANG预防模型中的指示时间点。未经重组ANG和DSS治疗（未经治疗）的WT小鼠ANG带灰度任意设置为1。

  3. C、 D类

    （C） 预处理WT结肠炎小鼠的体重减轻和（D）DAI(n个 = 8).

  4. E–H（E–H）

    （E） 第8天预处理WT结肠炎小鼠的结肠长度、（F）血清FITC-右旋糖酐水平、（G）代表性HE染色图像和（H）结肠切片组织病理学评分(n个 = 8).

  5. 我

    ANG治疗模型示意图。老鼠(n个=8）用DSS治疗7天，并在第4-6天同时给予1.25 mg/kg重组ANG。

  6. J型

    WT结肠组织中ANG的免疫印迹(n个=2）ANG治疗模型中指定时间点的小鼠。未经重组ANG和DSS治疗（未经治疗）的WT小鼠ANG带灰度任意设置为1。

  7. K、 L（左）

    （K） 治疗WT结肠炎小鼠的体重减轻和（L）DAI(n个 = 8).

  8. M–P公司

    （M） 第8天治疗的WT结肠炎小鼠结肠长度、（N）血清FITC-右旋糖酐水平、（O）代表性HE染色图像和（P）结肠切片组织病理学评分(n个 = 8).

数据信息：比例尺，50μm；数据显示为平均值±SEM；双尾未成对学生的t吨检验（C、E、F、K、M、N和P）和曼惠特尼检验（D、H和L）用于确定统计显著性(*P（P）< 0.05).可在线获取此图的源数据。
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