跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

gov意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府政府网站。

Https系统

该站点是安全的。
这个https（https）：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
。2019年7月11日；178（2）：302-315.e23。
doi:10.1016/j.cell.2019.05.035。

细胞质DNA传感器cGAS促进有丝分裂细胞死亡

克里斯蒂安·齐尔胡特 1, 山口Norihiro Yamaguchi 2, 玛丽亚·帕雷德斯 三, 吉东洛 4, 托马斯·卡罗尔 4, Hironori Funabiki先生 5
附属公司

细胞质DNA传感器cGAS促进有丝分裂细胞死亡

克里斯蒂安·齐尔胡特等。 单元格。 。

摘要

致病性和其他细胞质DNA通过IRF3和核因子κB（NF-κB）的转录激活激活干扰素基因（STING）通路的循环GMP-AMP合成酶（cGAS）刺激物，从而诱导炎症，但在有丝分裂核膜破裂时将cGAS暴露于染色体的功能后果尚不清楚。在这里，我们表明核小体竞争性地抑制DNA依赖的cGAS激活，并且cGAS-STING通路在正常有丝分裂期间没有有效激活。然而，在有丝分裂停滞期间，低水平的cGAS依赖性IRF3磷酸化缓慢积累，而不会引发炎症。磷酸化IRF3独立于其DNA结合域，通过减轻Bcl-xL依赖性抑制线粒体外膜通透性来刺激细胞凋亡。我们认为磷酸化IRF3的缓慢积累（通常不足以诱导炎症）可以在有丝分裂异常时触发转录诱导的凋亡诱导。因此，癌细胞中cGAS和IRF3的表达使小鼠异种移植瘤对有丝分裂抑制剂紫杉醇产生反应。非小细胞肺癌患者的癌症基因组图谱（TCGA）数据集也表明cGAS表达对紫杉烷反应的影响。

关键词：cGAS；癌症；细胞死亡；先天免疫；有丝分裂；紫杉醇；紫杉烷。

PubMed免责声明

利益冲突声明

权益声明

提交人声明，不存在相互竞争的财务利益。

H.F.隶属于Weill Cornell医学院医学研究生院和Sloan Kettering研究所细胞生物学项目。

数字

图1。
图1核小体结合cGAS的亲和力高于裸DNA，但抑制cGAS催化活性。
（A） cGAS信号示意图。（B） 将含有或不含裸DNA/核小体的珠子与35标有S的cGAS。通过荧光法和考马斯亮蓝（CBB）（顶部）和SYBR-Safe（底部）检测与珠子相关的蛋白质和DNA。（C） 用纯化cGAS和裸DNA或单核小体进行凝胶迁移率转移结合分析。平均值和SEM（n≥3）。凝胶示例见图S1C。（D和E）裸DNA或单核小体DNA结合域（KRKK突变）中突变的纯化野生型cGAS或cGAS的结合分析。平均值和SEM（n≥3）。（F） 用cGAS和泰龙珠培养His-tagged H2A–B或H3–H4。CBB检测到与珠子相关的蛋白质。H2A-B_ap*A，丙氨酸突变体的酸性补丁；H2A-B_ap*KR，赖氨酸/精氨酸突变的酸性补丁。（G–I）cGAS活性的薄层色谱分析（见图S1D）。（G） 使用裸DNA或核小体作为cGAS刺激物的典型示例。（H） cGAS的明显Kcat。平均值和SEM（n=3）。（I） cGAS与裸DNA的表观Kcat和单核小体浓度的增加。平均值和SEM（n=3）。另请参见图S1。
图2。
图2 cGAS通路在正常有丝分裂期间是不活跃的，但在有丝分裂阻滞后期被激活
（A） 在G2或在500 nM紫杉醇、10μM proTAME的有丝分裂阻滞期间的指定时间后采集的指定HeLa细胞IRF3磷酸化的Western blot分析。（B） 使用指定的细胞系对有丝分裂阻滞中GFP-IRF3 S396磷酸化进行Western blot分析（上图）。底部，CRISPR-Cas9中断验证。（C） 在500 nM紫杉醇、10μM proTAME中，对G2阻滞HeLa细胞或阻滞期间指定时间点的细胞中内源性IRF3免疫沉淀的S396磷酸化进行Western blot分析。（D） Western blot分析在G2或在500 nM紫杉醇、10μM proTAME停药期间指定时间后采集的HeLa细胞中的IRF3 S386磷酸化。（E） 所示细胞系的细胞分数（通过活显微镜测定）和在无扰动有丝分裂中死亡的处理（每个样品的n=30-50）。（F） 有丝分裂的长度（核膜破裂-后期）由15分钟间隔时间推移显微镜测定（每个样品n=30-50）。红线：中位数。siCNTRL，非靶向控制siRNA；sicGAS，siRNA靶向cGAS。另请参见图S2。
图3。
图3：乳腺癌细胞中cGAS表达与紫杉醇敏感性相关
（A） 所示细胞系中cGAS和STING的Western blot分析。垂直线表示删除的无关车道。（B-F）在所指示的处理后，对所指示的异步群体中有丝分裂细胞死亡的时间推移显微镜分析。（B） 10 nM紫杉醇中有丝分裂细胞死亡分数（每个样品n=50）。平均值和范围由两个实验得出。（C） 500 nM紫杉醇中有丝分裂细胞死亡分数（每个样品n=45）。来自两个实验（HCC1143，MDA-MB-157）或三个实验（所有其他实验，绘制平均值和范围）的数据。（D） 有丝分裂未受干扰的有丝分裂细胞死亡频率（每个样本n=40）。（E） cGAS敲除对HCC1143、MDA-MB-157和BT549中用指定siRNA处理的有丝分裂细胞死亡（10 nM紫杉醇）的影响（每个样本n=60）。数据来自两个实验（HCC1143，MDA-MB-157，绘制的平均值和范围）或一个实验（BT549）。（F） cGAS敲除对MDA-MB-231中用指定的siRNA处理的有丝分裂细胞死亡（500 nM紫杉醇，每个样品n=60）的影响。siCNTRL，非靶向对照siRNA；sicGAS，siRNA靶向cGAS。另请参见图S3。
图4。
图4 cGAS促进有丝分裂中的细胞死亡
（A） cGAS水平的Western blot分析。使用siCNTRL细胞提取物的稀释系列来评估cGAS耗竭。垂直线表示已删除的不相关车道。（B–J）有丝分裂细胞死亡的时间推移显微镜分析。用指定的药物将细胞从G2期阻滞释放到M期，并监测有丝分裂至死亡或滑移的持续时间。红线，中位数。siCNTRL，非靶向对照siRNA；sicGAS，siRNA靶向cGAS。（B和C）10 nM紫杉醇中HeLa细胞有丝分裂细胞死亡的分数。（B） 三个实验的平均值和范围（误差条）（每个实验n=60）。（C） 有丝分裂细胞死亡和单个细胞滑移的时间（n=60个）。（D和E）释放到500 nM紫杉醇10μM proTAME中的HeLa细胞的细胞死亡时间。（D） 单个细胞死亡的时间（n=60）。（E） 六个实验的平均值和SD（点是每个实验的中位数）。（F和G）BJ hTERT释放到500 nM紫杉醇10μM proTAME中的细胞死亡时间。（F） 单个细胞的死亡时间（n=80）。（G） 六个实验的平均值和SD（点是每个实验的中位数）。（H） 有丝分裂细胞死亡的时间和释放到500 nM紫杉醇10μM proTAME中的ARPE-19 hTERT细胞（每个40个）的滑移。显示两个副本中的一个。（一） HeLa细胞的补体分析。分析单个HeLa细胞（每个细胞n~50）有丝分裂细胞死亡的时间。cGAS公司猫，催化突变体。cGASdna，DNA结合诱导的催化活性突变体。cGAS蛋白印迹见图S4J。显示两个副本中的一个。（J） 释放到500 nM紫杉醇10μM proTAME中的cGAS破坏突变体（n=60）的单个细胞有丝分裂寿命分析。使用两种不同的短导向RNA（sg#1和sg#2）产生的细胞系，以及表达野生型GFP-cGAS的克隆。不详。，无siRNA治疗。cGAS水平的Western blot见图S4L。另请参见图S4。
图5。
图5 cGAS通过加速MOMP促进有丝分裂细胞死亡
所示细胞系中的（A–C）Bax活化从G2释放到500 nM紫杉醇10μM proTAME。用识别活化Bax的6A7抗体对细胞进行染色。（A和B）HeLa细胞（A，两个实验的平均值和范围）和BJ hTERT细胞（B）的定量。（C） 14小时时HeLa细胞的代表性图像箭头，激活Bax阳性细胞。（D–F）SMAC从所示细胞系的线粒体释放，从G2释放到500 nM紫杉醇10μM proTAME。对细胞进行SMAC染色。（D和E）HeLa细胞（D，两个实验的平均值和范围）和BJ hTERT细胞（E）的定量。（F） 14小时时HeLa细胞的代表性图像箭头，带有离域SMAC的细胞。注意，去局域化表现为弱信号强度。未经处理的有丝分裂细胞的SMAC染色见图S5J。siCNTRL，非靶向控制siRNA；sicGAS，siRNA靶向cGAS。另请参见图S5。
图6。
图6 cGAS-cGAMP-STING-IRF3轴独立于转录诱导促进有丝分裂细胞死亡
（A） 所示细胞系中所示蛋白质的Western blot分析（平均值和SEM）在G2期停滞。（B和C）用中和抗IFNAR 2抗体处理细胞。（B） 添加干扰素β（含或不含IFNAR2抗体）后BJ hTERT细胞的Western blot分析。（C） 所示BJ hTERT细胞（每个细胞的有丝分裂寿命为34-40）在所示抗体的存在下生长，并从G2阻滞释放到500 nM紫杉醇10μM proTAME中。（D和E）细胞的有丝分裂寿命（每个细胞n=50）在G2中停止并释放到500 nM紫杉醇10μM proTAME中。在1.5小时（HeLa细胞，D）或4小时（BJ hTERT细胞，E）后，将cGAMP添加到33μM的指定细胞中。只对已经进入有丝分裂期的细胞进行分析。（F） 通过定量PCR在所示细胞中表达IFNB1+DNA，用裸DNA转染异步细胞。细胞从G2期阻滞释放到含有指定药物的培养基中。两个实验的平均值和范围。（G和H）转录抑制分析。（G） 细胞的有丝分裂寿命（n=60个）在G2中停止，并释放到500 nM紫杉醇10μM proTAME中。在1.5小时（HeLa）或4小时（BJ-hTERT）后，将雷公藤内酯醇（TRP）添加到10μM的指示细胞中。只有已经进入有丝分裂的细胞才被纳入分析。（H） 用TRP验证转录抑制。用10μM TRP处理的异步HeLa细胞用抗RNA聚合酶II（CTD S2ph）C末端末端丝氨酸2磷酸化的抗体染色。（一） 所示细胞的有丝分裂寿命（n=60个）在G2中停滞，并释放到500 nM紫杉醇10μM proTAME中。蛋白质印迹分析见图S6G。（J） IRF3救援结构。DBD，DNA-结合域（金）。RD，调节域（浅灰色）。S396周围区域（深灰色）。（K–M）IRF3破坏细胞系的有丝分裂寿命，该细胞系含有表达多西环素诱导的野生型GFP-IRF3（K）的拯救结构体、缺乏DNA结合域（L）的突变体或携带S396A突变（M）的表达GFP-IRF的突变体。Western blot见图S6H-S6J。细胞在G2中被捕获并释放到500 nM紫杉醇10μM proTAME中（每个n=60）。红线，中位数。siCNTRL，非靶向对照siRNA；sicGAS，siRNA靶向cGAS；不详。，无siRNA治疗。另请参见图S6。
图7。
图7：cGAS途径促进小鼠异种移植癌模型对紫杉醇的反应，并与肺癌和卵巢癌患者的生存率增加相关。
将野生型或cGAS-disrupted（sg_cGAS）HeLa细胞注射到免疫低下（NSG）小鼠中形成的（A-F）异种移植瘤每周接受紫杉醇或二甲基亚砜治疗（另见图S7A）。（A和B）所示肿瘤和治疗的生长曲线（平均值和扫描电镜；n=6（wt+DMSO）；n=8（wt+紫杉醇）；n=6（sg_cGAS+DMSO；n=5（sg_cGAS+紫杉酚））。（C–E）用识别caspase-3裂解（活性）形式的抗体测定指定肿瘤样本中的细胞凋亡。（C和D）所示肿瘤和治疗的样本图像（比例尺，100μm）。（E） 紫杉醇处理样品中裂解caspase-3信号的定量除以DMSO处理样品中的信号（平均值和标准差）。（F） 实验结束时肿瘤恢复的Western blot分析。（G和H）来自TCGA数据库的非小细胞肺癌（G）和卵巢癌（H）患者的生存曲线，根据治疗（紫杉烷与其他）和cGAS表达水平（截止值：中位数）进行分层。患者人数见表S1和表S2。（一） 感染和有丝分裂期间cGAS功能的模型。左图：由于间期的高转录潜能，细胞质DNA激活cGAS主要导致炎症。中间：在正常有丝分裂期间，cGAS与有丝分裂染色体相关，但受核小体抑制，不产生磷酸化IRF3。右：在有丝分裂阻滞期间，磷酸化的IRF3缓慢积累。由于高凋亡潜能但低转录潜能，诱导的是凋亡而非炎症。另请参见图S7、表S1和表S2。
请参阅PMC中的此图像和版权信息

类似文章

查看所有类似文章

引用人

查看所有“被引用”文章

工具书类

    1. Abe T和Barber GN（2014年）。细胞质DNA介导的STING依赖性促炎基因诱导需要通过TBK1激活典型的NF-κB。《病毒杂志》88，5328–5341。-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Ablasser A、Goldeck M、Cavlar T、Deimling T、Witte G、Rhl I、Hopfner K-P、Ludwig J和Hornung V（2013）。cGAS产生一个2“-5”连接的环状二核苷酸第二信使，激活STING。《自然》498380-384。-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Allan LA和Clarke PR（2007年）。CDK1/cyclin B1对caspase-9的磷酸化保护有丝分裂细胞免受凋亡。分子细胞26301-310。-公共医学
    1. Andersen JL、Johnson CE、Freel CD、Parrish AB、Day JL、Buchakjian MR、Nutt LK、Thompson JW、Moseley MA和Kornbluth S（2009年）。通过caspase-2的区域间磷酸化抑制有丝分裂过程中的凋亡。Embo J 28，3216–3227。-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Andreeva L、Hiller B、Kostrewa D、Lässig C、de Oliveira Mann CC、Jan Drexler D、Maiser A、Gaidt M、Leonhardt H、Hornung V等（2017年）。cGAS通过形成蛋白-DNA阶梯来感应长链和HMGB/TFAM结合的U型DNA。《自然》549、394–398。-公共医学

出版物类型

MeSH术语