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.2015年5月；12(5):411-4.
doi:10.1038/nmeth.3319。 Epub 2015年3月16日。

原位直接可视化新合成的靶蛋白

苏珊·汤姆·迪克 1, 丽莎·科钦 1, 西里尔·哈纳斯 1, 马克西米利安·赫穆勒 1, 伊娜·巴特尼克 1, 贝尔奎斯·纳西姆·阿西尔 1, 凯特琳·默克 1, 托尔斯滕·莫斯勒 1, 萨基·加格 1, 斯蒂芬妮·本斯 1, 大卫·A·蒂雷尔 2, 埃林·舒曼 1
附属公司

原位直接可视化新合成的靶蛋白

苏珊·汤姆·迪克等人。 Nat方法. 2015年5月.

摘要

蛋白质合成是一个动态过程，根据内部和外部需求调节细胞蛋白质组。代谢标记方法可识别一般蛋白质组反应，但无法显示细胞内特定的新合成蛋白质。在这里，我们描述了一种将非经典氨基酸标记或嘌呤化与邻近连接分析结合起来的技术，以可视化特定的新合成蛋白质，并原位监测其来源、重新分布和周转。

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数字

图1
图1。标记特定的新合成蛋白质
(一)工作原理。新合成的蛋白质含有AHA或嘌呤霉素。AHA通过点击化学被生物素化。抗体（粉色Y）识别“新合成”标签（生物素或嘌呤霉素，粉色三角形），蛋白特异性抗体（蓝色Y）识别POI，当PLA检测到接近时减和解放军加与二级抗体（灰色Y）偶联的寡核苷酸（黄色和绿色波形条）足够接近模板连接物寡聚结扎成一个圆圈。通过结合荧光耦合检测探针（绿色圆圈）放大信号。(b条)培养海马神经元（左）中新合成的Camk2a（2 h AHA）的FUNCAT-PLA信号（绿色）的示例图像，以及无抗Camk2a抗体的对照（右）。(c（c）)在没有（左）或（右）蛋白合成抑制剂Anisomycin的情况下，用嘌呤霉素标记15分钟后，新合成的Camk2a（绿色）的Puro-PLA图像。比例尺(b条,c（c）)=15微米。(天)培养海马神经元的体细胞和主要树突中新合成的巴松管、TGN38或LaminB（如图所示，2h AHA）的FUNCAT-PLA高放大图像（灰度）（MAP2轮廓为洋红色）。比例尺=10μm。(e（电子）)新合成的TGN38在5分钟嘌呤化后的显微照片。插图：躯体信号转换为(天). 比例尺=20μm。(（f）)TGN38 FUNCAT-PLA和Puro-PLA信号（胞体中PLA综合强度）与AHA和嘌呤霉素孵育时间的相关性。（右2=0.99和0.98，来自两个和三个独立实验，n个=20-27和n个分别=15–20。显示平均值±SEM和线性回归）。
图2
图2。评估Puro-PLA的分子内标记
(一)描述N端和C端抗巴松管抗体结合位点的方案（蓝色Y，上面板）。在Puro-PLA实验中，由于嘌呤霉素（粉红色三角形）阻止新生链的延伸，预计与C端巴松素和嘌呤菌素抗体对相比，N端巴松素抗体和抗嘌呤霉菌素抗体（粉红色Y）会产生更大的信号。如果两种抗体都识别同一蛋白质中的表位，与与相邻蛋白质的结合相比，N端抗体产生的Puro-PLA信号预计会大于C端抗体生成的Puro-PLA信号。(b条)代表性荧光图像和特写（上图，PLA信号绿色，MAP2品红色和DAPI标记的细胞核蓝色，下图灰度级PLA信号）显示了在用嘌呤霉素标记四分钟或不用嘌呤霉素标记后，使用N-或C-末端抗巴松抗体检测到的巴松蛋白的Puro-PLA信号。比例尺分别为30μm和10μm。(c（c）)所示信号的量化(b条). 对于每个实验，将每个抗体的背景校正Puro-PLA密度归一化为C末端抗体的平均值（三个独立实验的平均值±SEM，n个= 10 – 11). 使用非配对学生t检验测试统计显著性(*P（P）< 0.05,P（P）= 0.014).
图3
图3。随着蛋白质寿命的延长，FUNCAT-PLA的分布变化和合成速率变化
(一)方案描述了两种假想的具有不同寿命的FUNCAT-PLA标记蛋白质。(b条)巴松管和TrkB FUNCAT-PLA信号对2小时AHA脉冲后追踪时间的依赖关系图。将与扩张MAP2信号重叠的FUNCAT-PLA信号区归一化为MAP2信号区（归一化平均值±SEM，来自三个（TrkB，n个=12-14）和5（巴松管，n个=23–39个细胞/条件）独立实验。(c（c）)描述假设的FUNCAT-PLA标记蛋白质群体（绿色）的时空动力学的方案，以及标记为Bassoon FUNCAT-PLA（灰色）的神经元体细胞和树突图像（绿色MAP2轮廓），在AHA孵育2小时后，进行10分钟或24小时追踪。比例尺=10μm；枝晶长度=135μm。(天)的分析图(c（c）). 显示的值是各个隔间内最大信号密度与追踪时间的百分比（三个独立实验的标准化平均值±SEM，n个= 11 – 13). (e（电子）)显示GluA1 FUNCAT-PLA（细胞概况和下面的相应树突）的显微照片，在3小时AHA标记后，无需（对照），并且通过单独阻断动作电位（TTX）或结合阻断NMDA组成的微型突触事件（TTX/APV）诱导稳态可塑性。GluA1 FUNCAT-PLA（绿色）、MAP2（洋红色）、比例尺=20（概述）和10μm（特写）。(（f）)分析(e（电子）). GluA1 FUNCAT-PLA信号密度标准化以控制神经元体细胞（上面板）。TTX/APV处理显著增加了新合成GluA1的数量(*P（P）< 0.05,P（P）= 0.0349). 下面板：TTX或TTX/APV处理显著增加树突中新合成GluA1的数量，甚至比体细胞中的GluA1数量还要多(*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01，归一化平均值±SEM，n个=三个不同实验中每种条件下16–25个细胞，ANOVA，Tukey对原始值的多重比较测试）。
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    1. Dieterich DC、Link AJ、Graumann J、Tirrell DA、Schuman EM.国家科学院院刊。2006;103:9482–9487.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Dieterich DC等，《自然神经科学》。2010;13:897–905.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. David A等人，《细胞生物学杂志》。2012;197:45–57.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Schmidt EK、Clavarino G、Ceppi M、Pierre P.Nat Methods。2009;6:275–277.-公共医学
    1. Jarvius M等人，《分子细胞蛋白质组学》。2007;6:1500–1509.-公共医学

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