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.2013年5月2日；8（5）：e63191。
doi:10.1371/journal.pone.0063191。 2013年印刷。

突触蛋白的代谢周转：动力学、相互依赖性和对突触维持的影响

劳里·D·科恩 1, 里娜·祖奇曼, Oksana Sorokina公司, 安克·米勒, Daniela C Dieterich公司, J道格拉斯·阿姆斯特朗, 塔玛尔·齐夫, 诺姆·E·齐夫
附属公司

突触蛋白的代谢周转：动力学、相互依赖性和对突触维持的影响

劳里·D·科恩等。 公共科学图书馆一号. .

摘要

化学突触包含大量蛋白质，与所有蛋白质一样，这些蛋白质的寿命有限，因此需要不断被替换。考虑到典型神经元形成的大量突触连接，维持这些连接的蛋白质含量的需求可能会对每个神经元产生相当大的代谢需求。此外，突触蛋白质平衡可能因与全球蛋白质合成位点的距离、分布式蛋白质合成设施的可用性、贩运率和突触蛋白质动力学而不同。迄今为止，尚未对突触蛋白的周转动力学进行系统研究或分析，因此，代谢需求或上述关系在很大程度上仍然未知。在当前的研究中，我们使用细胞培养中氨基酸的动态稳定同位素标记（SILAC）、质谱（MS）、荧光非经典氨基酸标记（FUNCAT）、定量免疫组织化学和生物信息学系统地测量了数百种突触蛋白的代谢半衰期，研究它们如何依赖于突触前/后联系或与特定分子复合物的联系，并评估突触蛋白质组的代谢负荷。我们发现，这里发现的几乎所有突触蛋白的半衰期都在2-5天范围内。出乎意料的是，突触前和突触后蛋白质或树突中持续存在mRNA的蛋白质的代谢周转率没有显著差异。一些功能或结构相关的蛋白质表现出非常相似的周转率，这表明它们的生物发生和降解可能是耦合的，这一可能性得到了基于生物信息学的分析的进一步支持。这里测量到的相对较低的周转率（每小时约0.7%的突触蛋白含量）与基于图像的突触蛋白质转运研究非常一致，但表明突触蛋白周转对单个神经元的代谢负荷非常大。

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利益冲突声明

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数字

图1
图1。通过SILAC和MS测量代谢蛋白周转。
A）实验过程图解。t=0时，将重赖氨酸和精氨酸添加到原代培养的皮层神经元培养基中（14天在体外). 0、1、3和7天后，收集细胞并用SDS-PAGE分离。其中一种凝胶（用考马斯蓝染色）如右图所示。每个时间点运行两条通道以增加蛋白质量。然后按照指示将凝胶切成9片，消化每个切片中的蛋白质，并将每个切片和每个时间点产生的肽分别提交MS分析。B）质谱图显示了切片5中两种特定肽在三个时间点的轻（开环）和重（闭环）群体的相对数量。C）两种特殊蛋白质（Munc18-1和CaMKII-β2）的重AA掺入率。每个数据点表示在给定时间点属于这些特定蛋白质的所有肽的平均分数掺入值。所有四个数据点都用于拟合指数曲线（实线），提供时间常数（τ）和半衰期的估计值，如图所示。右侧的图表显示了相同指数曲线的外推时间更长。
图2
图2。代谢半衰期估计值的分布。
A）所有已识别蛋白质的代谢半衰期估计值的分布，这些蛋白质在所有四个时间点都获得了分数合并数据。不包括符合单指数的蛋白质（～2%）。B）191种突触蛋白代谢半衰期估计值的分布（表1）。
图3
图3。特征明确的突触蛋白质的代谢半衰期估计。
A–D）四组突触蛋白的重AA掺入率:支架分子谷氨酸能突触Dlg家族(一个); 谷氨酸受体亚单位(B类); 活性区（CAZ）分子的细胞骨架(C类); 和突触囊泡分子(D类). 每个数据点（如图1C所示）表示在给定时间点属于该特定蛋白质的所有肽的重AA分数掺入值的平均值。实线表示单指数曲线的最佳拟合。图例（括号）中提供了基于这些拟合的半衰期估计值（以天为单位）。E）一组选定突触蛋白的代谢半衰期估计。主要与谷氨酸能突触和GABA能突触相关的蛋白质分别以绿色和红色显示。请注意，具有非常相似半衰期的蛋白质有时会稍微分开以增加可读性。
图4
图4。树突棘中新合成蛋白质的降解率。
使用4 mM AHA的24小时脉冲标记新合成的蛋白质。随后用高浓度蛋氨酸立即或24或48小时后固定细胞。然后使用FUNCAT用TAMRA-TAG对新合成的蛋白质（含AHA的蛋白质）进行可视化。A）FUNCAT显示新合成蛋白后，以及MAP2和突触素（Sph）免疫染色后的近端树突状片段示例。注意树突和突触体素阳性突触中的TAMRA荧光较强，24和48小时追踪后TAMRA的荧光减弱。还应注意，未接触AHA脉冲的神经元中未观察到TAMRA荧光（顶行）。颜色编码：MAP2-绿色，TAMRA-tag-洋红色/红色，Sph-蓝色。比例尺：5µm。B）随着追逐时间的延长，突触素阳性突触中TAMRA荧光强度的量化。数据显示为平均值±SEM。数据来自两个独立实验（每个实验两到三个盖玻片）和40–46个近端树枝晶的总数。杆内显示了TAMRA强度量化的脊椎数量。
图5
图5。蛋白质合成被抑制10小时后，突触部位的突触蛋白轻微丢失。
将神经元暴露于蛋白质合成阻滞剂茴香霉素（25µM）10小时，然后针对9种不同的突触蛋白进行标记的定量免疫细胞化学。暴露于载体溶液后针对CAZ蛋白边缘标记的神经元(一个)或茴香霉素(B类). 暴露于载体溶液后标记PSD蛋白PSD-95的神经元(C类)或茴香霉素(D类). 比例尺，10µm。E）C中矩形中封闭区域的放大视图，说明荧光点的编程定位(F类). 请注意，无论点的亮度如何，都能正确检测到点。G–I）暴露于茴香霉素10小时后测量的突触免疫荧光水平的变化（平均值±SEM）。条形图中的数字表示为每个数据集分析的视图字段数。每个视野包含～297±122点（平均值±标准偏差）。J）茴香霉素治疗后的平均免疫荧光水平与未治疗神经元的免疫荧光水平相比较（与G–I组的数据相同）。
图6
图6。特定突触区蛋白质代谢半衰期估计值的比较。
人工筛选特征良好的蛋白质组，并比较其代谢半衰期的估计值。每个点代表一种蛋白质的半衰期值。水平条代表每组的平均值。每组的变异系数在每组的上方提供。图表下方列出了各组中所含的蛋白质及其代谢半衰期的估计值。除突触囊泡和活性区组细胞骨架之间的差异外（p=0.01），各组之间的其他差异均无统计学意义（Kolmogorov-Smirnov检验）。
图7
图7。半衰期估计值与蛋白质相互作用组之间的关系。
A）由191个突触相关蛋白（正文和表1）组成的分子相互作用网络，该网络基于人工管理的公共域蛋白质相互作用数据库（人类综合蛋白质-蛋白质相互作用参考，或HIPPIE；更多详细信息，请参阅材料和方法）生成。每个圆圈代表一种蛋白质，该蛋白质的估计代谢半衰期根据左下角的图例进行颜色编码。每个簇中的蛋白质按顺时针方向排列，每个簇中的顶部蛋白质指的是用粗线包围的每个簇中的圆圈。B、 C）与非相互作用蛋白质对相比，相互作用蛋白质组的代谢周转率之间的平均差异较小。将已知存在相互作用的所有对的代谢半衰期估计值与未知发生相互作用的全部对之间的绝对差异进行了比较（详见正文），并绘制了这两组差异的分布图。B）所有确定的蛋白质，以及C）有关突触和突触相关蛋白的列表。在这两种情况下，各组之间的差异都非常显著（p≪10−10Kolmogorov-Smirnov试验）。
图8
图8。突触蛋白合成的代谢负荷。
神经元（顶部）和突触（底部）的示意图，对维持原代培养中原型皮层神经元的突触数量所需的蛋白质合成速率进行了一些估计（顶部）或某些特定分子的突触内容物（底部）。
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赠款和资金

这项工作得到了美国-以色列两国科学基金会（2007425）、欧盟第七框架计划（根据第HEALTH-F2–2009–241498号赠款协议，简称“EUROSPIN”）和德国-以色列项目合作基金会（Deutsch-Israelische-Projektkooperation German-Israeli Project Cooperation Foundation）的资助。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。