卡波西肉瘤相关疱疹病毒(KSHV;也称为人类疱疹病毒8)是最近发现的人类疱疹病毒(6,7)与卡波西肉瘤(KS)、原发性渗出性淋巴瘤(PEL;也称为体腔型淋巴瘤[BCBL])相关(三)和多中心Castleman病的一个子集(34). KSHV的流行病学研究依赖于病变和组织中特定病毒DNA的PCR检测以及随后的血清学检测,表明该病毒在很大程度上符合Hill关于KS病因的标准(26).
KSHV可以在PEL衍生的细胞系中直接培养到高拷贝数,但传播到其他细胞系和病毒的串行传播效率仍然很低(9,21). 第一个报道和表征的KSHV细胞系,命名为BC-1(HBL-6),与EB病毒(EBV)共感染(4,10). 该细胞系表现出B细胞起源的克隆性免疫球蛋白重链重排特征,每个细胞平均包含40到60个KSHV基因组拷贝(4). 与某些Burkitt淋巴瘤衍生细胞系类似,负责淋巴母细胞永生化的EBV LMP1和EBNA-2基因在BC-1中不表达(21). 然而,与EBV感染的Burkitt淋巴瘤细胞系不同(16),c-myc公司重排在细胞系或亲代肿瘤中都不存在(10). 随后建立了其他来源于PEL的细胞系;其中一些是EBV阴性,这表明EBV联合感染对KSHV的体外培养是不必要的(1,2,29,31).
最近测定了BC-1细胞系中KSHV基因组的全部核苷酸序列,除了一个3-kb的不可克隆区域(30). 它由约140.5 kb的双链长独特DNA组成,两侧为高G+C末端重复序列(TR)单元。脉冲场凝胶电泳分析来自EBV-阴性BCBL-1细胞系的KSHV颗粒的封装DNA表明,病毒基因组约165kb长(28,29); 然而,感染BC-1细胞的KSHV株基因组大小约为270 kb。BC-1细胞系中KSHV基因组的较大尺寸估计是由于插入TR区的编码片段的重复(30). 而通过PCR分析已经检测到来自BC-1细胞的KSHV基因组传播(17,21),尚未正式证明该菌株具有感染能力。根据这一观察结果,BC-1中KSHV的TR分析与标准BC-1培养条件下病毒处于严密的潜伏复制控制下一致(30). BC-1和HBL-6(4,10)从同一亲本肿瘤独立建立的细胞系具有相同的TR多态性模式,表明病毒在这些细胞系中单克隆扩增。用丁酸钠或12处理BC-1细胞-O(运行)-十四酰基佛波-13-乙酸酯(TPA)诱导晚期裂解感染阶段病毒基因表达特征(18). 在没有化学处理的情况下,BC-1中没有显著的病毒晚期基因表达的迹象,这为该细胞系中KSHV的严密潜伏控制提供了额外的证据(18). 其他细胞系,如BCBL-1和BCP-1,可能包含进行自发溶解复制的少数细胞群,从而使病毒潜伏期表达基因的搜索变得复杂。
BC-1细胞株KSHV的序列分析(30)以及KS病变(22)证明KSHV基因组的很大一部分,以编码病毒复制和结构蛋白的基因块为代表,在疱疹病毒中是保守的(5,21,24,30). 这些区域与两种具有转化潜能的γ-疱疹病毒EBV和疱疹病毒saimiri(HVS)具有共线同源性。在保守基因块之间,不同的区域包含许多独特的病毒蛋白,其中一些可以模拟细胞周期调节和信号转导蛋白(30). 没有与EBV基因序列同源的KSHV基因参与细胞永生化和肿瘤发生(如EBNA-1、-2和-3、LMP1和LMP2或gp350/220)(15)或与HVS转化有关的两个基因(STP和TIP)(13,14)通过序列分析检测到(30). 这并不排除存在具有不同氨基酸组成和结构的独特KSHV癌蛋白的可能性。
疱疹病毒基因的转录通常受到严格调控,并按顺序进行。疱疹病毒基因转录通常分为两个阶段,一个是潜伏期,病毒基因组保持在上位形式,另一个是裂解期,在生产性(裂解)感染期间以级联方式发生。用TPA处理BC-1细胞可诱导裂解EBV复制,EBV DNA增加8倍,而KSHV DNA仅增加1.3至1.4倍(21). 与EBV相比,丁酸盐处理优先增加BC-1中KSHV DNA的复制(18). 相比之下,其他PEL/BCBL细胞系在TPA治疗后KSHV DNA增加了15倍,并且可以检测到病毒粒子的产生(29)表明BC-1中的KSHV菌株可能存在复制缺陷。然而,从BC-1和TPA诱导的BC-1中提取的mRNA的比较Northern分析表明,TPA治疗可诱导广泛的病毒转录,这可能对应于病毒生命周期的活跃裂解阶段。
Zhong等人(38)之前使用病毒基因组片段与来自KS组织以及仅感染KSHV的细胞系(BCBL-1)的放射性标记cDNA探针杂交进行了KSHV基因转录调查。该方法为病毒基因转录提供了重要的初始筛选;然而,它的灵敏度有限,只允许检测高转录mRNA,不提供有关mRNA大小或替代转录模式的信息。通过该方法鉴定了两个高度丰富的转录本T0.7和T1.1,并随后通过Northern分析进行了表征。
为了提供BC-1细胞系中KSHV活性转录区的图谱,我们使用Northern杂交检测了基因转录。该图谱可能被证明对研究人员有用,可以作为KSHV基因组的初始转录特征。本研究的主要目的是确定潜伏期内表达的潜在编码序列,以便随后进行更精细的映射和特征研究。BC-1细胞系是BCBL转录研究的理想细胞,因为KSHV在标准生长条件下处于严密的潜伏控制之下(18). 虽然BC-1是EBV共感染,可能影响KSHV基因转录,但这种共感染在大多数BCBL肿瘤中自然发生,因此反映了病毒在体内的生物学状态。在标准生长条件下在BC-1细胞系中发现的转录物可能编码潜伏相关蛋白,这些蛋白在维持潜伏病毒基因组和/或转化病毒感染细胞方面可能很重要。
结果
由于探针之间的信号强度可能不同,这取决于探针长度、转录长度、暴露时间和比活性等因素,因此我们仅对未经TPA诱导表达的基因提供了相对探针杂交的半定量估计。每个凝胶在TPA诱导和非诱导条件下以及P3HR1下分析BC-1的Northern杂交,以控制每个探针的这些因素。尽管探针条件可能在一定程度上解释探针之间杂交强度的变化,但该技术可以准确估计任何给定探针所包含基因的TPA诱导与非诱导转录杂交的相对强度。由于BC-1 TPA诱导后出现大量条带,因此没有尝试半定量TPA诱导转录物的相对强度。使用任何KSHV探针,无论是否进行TPA处理,均未检测到P3HR1 mRNA的杂交信号,表明P3HR1编码的EBV转录物没有明显的交叉杂交。由于P3HR1中的EBV株在EBNA-2中被删除,而在EBNA-LP中被部分删除(15)虽然KSHV没有编码这些EBV基因的序列同源物,但不能排除与EBV这一区域的交叉杂交。
有无TPA的KSHV基因转录。
与Renne等人和Zhong等人对BCBL-1细胞系的研究结果一致(29,38)和使用BC-1进行病毒蛋白分析(18)Northern分析表明,在标准生长条件下,BC-1细胞表现出相对受限的基因转录模式。如表所示,未经TPA诱导在BC-1中转录的基因包括1.1 kb和0.7 kb聚腺苷酸mRNA转录物(T1.1和T0.7)(29,36,38,39)以及代表编码开放阅读框架(ORF)K13(v-FLIP)的替代转录本的6.0和2.0 kb转录本[参见图的图例。缩写])和ORF 72(v-cyclin)(27,33). 6.0-kb的转录本额外编码ORF73(LANA),后者在2.0-kb转录本中剪接出来(33). 我们将6.0kb和2.0kb转录物分别指定为潜在转录物1(LT1)和LT2。这些结果证实了LANA表达的免疫印迹研究,该研究表明该蛋白不是TPA诱导的,也不是磷酸乙酸抑制的,因此可能在病毒潜伏期表达(12). 由ORF K14和ORF 75基因对应的区域编码的4.5-kb转录物(LT3)也在未经TPA处理的情况下转录。
与Renne等人和Zhong等人的研究相反(29,38),在没有通过Northern杂交进行TPA诱导的情况下可以检测到其他转录物。其中包括1.0kb ORF K2(v-IL-6)、0.8kb ORF-K4(v-MIP-II)和1.5kb ORFK9(v-IRF)转录本(19,25)编码与细胞因子和细胞内信号转导蛋白同源的基因。用编码ORF K1、4和6(探针1)、ORF K3、70、K4和K4.1(探针4)、K5、K6和K7(探针5)、ORF 36至42(探针16)、ORF 43和44(探针19)、ORF 44和45(探针20)、ORF 49、50、K8、K8.1和52(探针22)、ORF 56和57(探针24)、ORF K10(探针26),ORF K10.1和11(探针27),ORF K11(探针28),ORF K11、58、59、60和61(探针29),ORF K14、74和75(探针39),以及ORF K14(探针40)。所有这些转录物在TPA治疗后均显示杂交强度增加(表). 大多数转录物在假定的病毒潜伏期内表达,但在裂解期基因转录期间可诱导,位于基因组的非保守区域(图。). 鉴定出几个可能跨越多探针序列和/或多顺反子的带。这些可能包括探针26至29检测到的2.0kb转录本和探针39和40检测到的4.5kb转录物。目前的研究无法解决这个问题,这需要对这些mRNA的起始和终止位点进行高分辨率的转录图谱绘制。
大多数只有在TPA诱导后才能检测到的转录物位于疱疹病毒中保守的区域,编码结构或裂解复制相关基因。例如,探针11和12包含7.0-kb ORF 25(主要衣壳蛋白[MCP])转录物,该转录物仅在TPA诱导后可检测到(图。C) ●●●●。
BC-1、TPA诱导的BC-1和P3HR1细胞系mRNA的北方杂交显示了三类病毒基因转录。mRNA(每车道500ng)在1%琼脂糖甲醛凝胶上分离并转移到尼龙过滤器。过滤器与四个DNA探针杂交:(A)代表I类转录的v-cyclin D;(B) v-IRF,代表II类转录;(C) MCP,代表III类转录;和(D)β-肌动蛋白控制RNA完整性和等效负载。
讨论
BC-1细胞中发现的基因转录模式可分为三类:I、II和III。I类(图。A) 包括在标准生长条件下在BC-1细胞系中检测到的、非TPA诱导的mRNA。这并不排除TPA降低I类基因转录的可能性,因为在KSHV感染的细胞中,TPA可能会抑制细胞基因转录(第16页,18)我们的印迹标准化了等量的mRNA。然而,与细胞转录物相比,KSHV I类转录物的相对丰度似乎不受TPA治疗的影响。
只有三个I类转录本被鉴定出来,所有这些转录本都编码在基因组的右侧。两个重叠的转录本LT1和LT2编码6.0kb和2.0kb mRNAs,可由探针36至39检测到。这两个转录本都起源于探针39区域内核苷酸127870的同一起始位点(33). ORF 72和ORF K13专用探针(36和37)与LT1和LT2杂交,表明这两个基因的多顺反子(即多基因转录物)转录。ORF73探针只与6.0-kb(LT1)转录本杂交,随后的cDNA定位研究表明,LT2起源于剪接产物,剪除了ORF73基因(33). 所有三个ORF在HVS中都有相应的序列同源物(23,37). ORF K13(122710至122144)编码Fas介导凋亡的病毒抑制剂的同源物(37). ORF 72(123566至122793)编码一种功能性细胞周期蛋白D同源物,可通过磷酸化视网膜母细胞瘤抑癌蛋白来替代人类细胞周期蛋白(8). ORF 73(127296至123808)对LANA进行编码(27),一种高免疫原性蛋白,在PEL衍生细胞系中表达,用于免疫荧光和基于西方分析的血清学测试(12). 第三类I转录物(LT3)是探针39和40检测到的4.5 kb的mRNA。与LT1和LT2不同的是,LT3尚未描述。ORF 74特异性探针(41)仅与TPA诱导的9.0和2.5 kb转录物杂交,表明ORF 74不由LT3编码;然而,ORF K14(v-Adh)或ORF 75(FGARAT)是由LT3编码的,还有待观察。上述转录物的丰度不受TPA治疗的影响,这一事实支持了这样的观点,即它们代表真正的潜伏期mRNA。这些mRNA以前在BCBL-1中没有检测到(29,38),可能是由于所用方法的灵敏度有限。
第二类基因转录,第二类(图。B) ,包括在标准生长条件下BC-1细胞系中检测到的可变丰度(高、中、低)的mRNA,并由TPA诱导到较高的转录水平。这一类中最丰富的mRNA先前在BCBL-1细胞系中发现,被指定为T1.1(核转录物1[nut-1])和T0.7(ORF K12[kaposin])(38)(分别为探针6、[1.1-kb mRNA和探针35[0.7-kbmRNA)。T1.1(28622至29002)定位于高分子量核糖核蛋白复合物,可能在调节RNA剪接事件中发挥作用(39). 通过原位杂交和与ORF 25(MCP)共定位,在KS病变中0.5%至1%的KSHV感染细胞中检测到该转录物(35). T0.7(118101至117919)似乎编码一种60个氨基酸的膜蛋白(38)通过原位杂交发现在大多数KS梭形细胞中表达(35). 未经TPA治疗而以中等水平转录的Ⅱ类mRNA包括细胞因子v-IL-6(ORF K2;探针3)、v-MIP-II(ORF K4;探针4)和v-IRF(ORF K 9;探针25)(19,25). 这些转录本的大小分别为1.0、0.8和1.5 kb。同样,探针20与仍由TPA诱导的BC-1细胞的1.5和2.0 kb mRNA杂交。应该注意的是,II类转录物似乎在潜伏病毒复制周期和裂解病毒复制周期中表达,往往聚集在基因组中编码信号转导和调节蛋白同源物的非保守区域。表中列出了该类表达水平较低的成绩单.
第三类成绩单,第三类(图。C) ,包括仅在TPA诱导后在BC-1中检测到的mRNA。这些转录物很可能编码裂解基因,这些裂解基因在活动感染期间转录,是有效病毒复制和病毒粒子生成所必需的。一些例子包括ORF 25(MCP;探针12)、ORF 6(DNA聚合酶;探针2)和ORF 21(gH;探针11)的转录本。TPA还可能诱导EBV编码基因,如裂解反式激活蛋白,这可能影响KSHV基因转录。EBV基因表达可能会影响BC-1细胞株中KSHV基因的转录,因此这些结果可能与单独感染KSHV的PEL/BCBL细胞株不同。我们的结果与Lagunoff和Ganem的结果一致,他们表明ORF K1基因表现为III类基因,与ORF K1-探针杂交的1.35-和3-kb转录物只有在TPA处理后才能诱导(第16页). 虽然我们没有在该区域定位表达,但这些转录本可能与探针1发现的1.8和3-kb III类转录本相同(表). TPA诱导后保守的结构和代谢基因转录物的高丰度以及在没有TPA处理的情况下无法检测到它们,为在标准生长条件下BC-1中KSHV受到严格潜在控制的观点提供了支持。
本研究旨在对PEL中潜在相关mRNA的潜在编码序列进行初步调查,以指导更详细的表达研究。我们的结果表明,与KS病变一样,PEL中的真正潜在转录受到限制。然而,在没有TPA处理的PEL中,许多基因通常以低转录水平表达,并且用TPA诱导(II类)。有趣的是,这类转录包括许多独特的KSHV基因(例如病毒细胞因子和v-IRF),这些基因可能在消除细胞通路以控制病毒感染和细胞转化中发挥作用(11,20).
应提及本研究的几个重要注意事项。在我们的条件下可能没有检测到非常低的表达水平;我们之前已经描述了BC-1中ORF16(v-Bcl2)的低水平转录(32)因此,在更详细的检查中,该基因可能属于我们的II类转录类别。此外,第二类mRNA的转录是由TPA诱导的,这一事实增加了这些不是真实的潜在转录物的可能性;相反,它们可能代表高度丰富的溶解酶相mRNA和/或相对稳定的mRNA,这些mRNA积聚在培养中经历自发溶解酶再激活的感染细胞的少数亚群中。然而,用膦甲酸抑制DNA聚合酶活性的处理并不影响TPA处理或未处理细胞中ORF K2(v-IL-6)或ORF K9(v-IRF)II类转录物的丰度(数据未显示),这意味着在TPA未诱导的细胞中检测到这些II类转录物并不是由少数细胞中晚期裂解mRNA表达引起的。无法检测保守的晚期基因的转录,如主要衣壳蛋白,晚期裂解感染的标志物(探针11和12),以及II类转录物主要从不编码结构基因的非服务区表达的事实,都与这种解释相矛盾。更可能的是,II类转录物代表组成型表达的mRNA,其在感染的活跃期被诱导到更高的水平。BC-1中的KSHV亚基因组复制不太可能导致双基因剂量或失去调控,从而允许II类转录物在潜伏期内表达,因为II类中的大多数基因(例如ORF K2[v-IL-6])不是BC-1基因组复制的一部分。最后,另一个警告是,可能会发生选择性剪接事件,其中TPA诱导的II类转录物的转录来自多个启动子:一个启动子是构成型的,允许在标准生长条件下基因表达,另一种启动子是TPA诱导型的。这些转录本的精细映射可能会验证这种可能性。
本研究提供了推测潜伏期和裂解复制期间BC-1中KSHV基因转录的工作图,这可能对未来研究单个基因的调控有用。这项定位研究对KSHV转录提供了比以前使用cDNA杂交测定更敏感的评估,使我们能够识别在没有TPA诱导的情况下转录的其他基因。这些基因可能在维持潜在KSHV上位体中发挥作用,并可能参与KSHV相关的发病机制。