乳腺癌细胞系EMT中ABCA1的表达通过MYC介导的近端Ebox元件去抑制上调

2.2. RNA分离、逆转录和RT-qPCR分析

在使用QIAshredder（德国希尔登，齐阿什雷德）将样品均质后，使用RNeasy Mini Kit（德国希尔登，齐格纳）提取总RNA，并使用RNase-Free DNase Set（德国希勒登，齐格纳）进行DNA消化。使用Verso cDNA合成试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）在T100TM Thermal Cycler（Bio-Rad，Hercules，CA，US）中进行逆转录。

将获得的cDNA添加到KAPA SYBR FAST Universal 2X qPCR Master Mix（瑞士巴塞尔KAPA Biosystems（Roche））和一组特定引物中。RT-qPCR在Mastercycler RealPlex2（德国汉堡Eppendorf）中进行，初始变性温度为94°C，时间为2分钟，然后在94°C下进行40次变性，时间为15秒，在60°C下退火30秒，在72°C下伸长率为30秒。在计算基因表达时，确定并考虑每个引物组的效率。RT-qPCR数据表示为通过比较CT方法分析的相对基因表达，并归一化为GAPDH水平。我们使用了以下底漆组：

GAPDH_F GAAGGTGAAGGTCGGAGTC公司

间隙

ABCA1_F TTAATGGGGCTGGAAAATCA公司

ABCA1_R TCCTCTCAAAAGGCAAAGA公司

MYC_F CCTACCTCTCAACGACAGC公司

MYC_R CTCTGACCTTTTGCCAAGGAG公司

CDH1_F AAGAAGGAGGCGGAGAAG

CDH1_R TTTCCAATTTCTCATCGGGATT

2.3. 免疫印迹法

为了获得蛋白质，去除培养基，在用科宁细胞升降机（美国密苏里州圣路易斯Sigma-Aldrich）在Pierce IP裂解缓冲液（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆Thermo Fisher Scientific）中刮除细胞之前，用冰上的1×PBS冷却液清洗细胞，并使用蛋白酶（美国密西西比州圣路易Sigma-Aldrich）和磷酸酶抑制剂。路易斯，密苏里州，美国）。使用Pierce BCA蛋白质检测试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）测量蛋白质浓度。在总蛋白质中，10-25μg通过SDS-PAGE在4–12%或10%的Bolt-Bis-Tris Plus凝胶（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）上在Bolt-MES SDS运行缓冲液（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）中以165 V在室温下分离35-45分钟，并转移到PVDF膜（EMD Millipore，Burlington，MA，USA）在螺栓传输缓冲器（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）中，在95 V电压下放置2小时或在4°C温度下放置30 V过夜。在室温下将膜在脱脂牛奶中封闭1小时，并用一级抗体进行检测：抗ABCA1（Abcam#ab18180，英国剑桥），1:1000，抗β-actin（美国德克萨斯州达拉斯圣克鲁斯生物科技#sc-47778），1:5000，抗MYC（圣克鲁斯生技科技#sc-40），1:200，抗E-cadherin（Cell Signaling Technology#3195S，Danvers，MA，USA）1:1000，抗vimentin（Cell-Signaling Technical#5741S，Danvers，MA，US）1:1000和抗GAPDH（Cell-GAPDH Technology#5174S，Danver，MA，美国）1:5000，4°C过夜。在室温下用PBS-T清洗膜3×10 min，并在室温下使用抗鼠或抗兔山羊HRP-结合二级抗体（EMD Millipore，Burlington，MA，USA）检测1 h，然后再次清洗。使用非商业ECL溶液或SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科学公司）可视化抗体-蛋白质复合物。

2.4. ChIP-qPCR

为了从HMLE/pWZL和HMLE/pWZL-Twist细胞中获得ChIP产物和基因组输入DNA，根据制造商的说明使用MAGnify染色质免疫沉淀系统试剂盒（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆Thermo Fisher Scientific公司）。S220聚焦超声仪（Covaris，Woburn，MA，USA）使用带有SDS剪切缓冲液的truCHIPTM低细胞染色质剪切试剂盒推荐的操作条件进行36分钟的DNA剪切。然后，使用分光光度计定量DNA：用3μg抗MYC抗体（英国剑桥Abcam#ab56）或小鼠IgG免疫沉淀30μg剪切的染色质，同时将3μg染色质作为基因组输入DNA（用于IP的染色质的10%）。通过在Mastercycler RealPlex2中进行qPCR，对ChIP产品和输入的纯化DNA进行分析，初始变性温度为95°C，时间为5分钟，随后在95°C下进行40次变性，时间为15秒，在60°C下退火30秒，在72°C下伸长率为30秒。qPCR检测到的来自阴性抗体控制反应的信号，即小鼠IgG，要么没有检测到，要么只存在于三个重复中的一个。因此，使用百分比输入法对ChIP-qPCR数据进行归一化，并以输入百分比表示。

使用以下引物扩增近端ABCA1启动子（P1b）的远端、上游84 bp的正向引物退火以及E-box基序下游78 bp的反向引物：

pABCA1_F ACACCTGTACCCTCAC公司

pABCA1_R CCGAGCGCAGGTTACTAT公司

作为阴性对照，使用了12号染色体上基因沙漠（GD）内的以下引物集扩增区域[22]:

GD_F目标

GD_R AAGCAGGTAAAGGTCCATATTC

萤火虫荧光素酶报告子构建

ABCA1启动子1（P1）和启动子2（P2）的序列是使用转录调控元件数据库从相对于转录起始点的−500到200个碱基对中检索和显示的，并使用以下引物集从人类基因组DNA（VWR，Radnor，PA，USA）中扩增而来：

P1_F TGGCCTCGGCGGCACAGCGCGTCCCTGTGTGTGCCTGGAGAT

P1_R CAGTACGCGGATTGCGCGTCTTTCTCCTACC

P2_F TGGCCTCGGCGGCAATATCAGGTAAAATATTTCCAAAG公司

第2页

启动子1的部分也使用引物集从人类基因组DNA（VWR，Radnor，PA，USA）中扩增：

第1a_F页TGGCCTCGGCGGCGCGCGTCCTGGCCCTGAGGATTCAGCC

P1a_R CAGTACGCGATTGCGCCGGGCCCCCCTTA

P1b_F TGGCCTCGGCGGCCATCCACGTGCTTTCTGCTG

P1b_R CAGTACGCGGATTGCGCGTCTTTCTCCTAC

对于启动子1，进行两步PCR，初始变性温度为98°C，时间为30 s，然后在98°C下进行35个变性周期，时间为5 s，在72°C下延伸45 s。对于P1a和P1b，延伸步骤为30 s。对于启动子2，初始变性时间为98°C，时间为30s，然后是35个变性循环，时间为98℃，时间为5s，在60°C下退火30秒，在72°C下用5%二甲基亚砜延伸1分钟。Phusion高纯度DNA聚合酶（美国马萨诸塞州伊普斯威奇新英格兰生物实验室）用于本手稿中描述的每一个PCR。

使用QIAquick凝胶提取试剂盒（Qiagen）从0.7%琼脂糖凝胶中柱纯化DNA。在使用Gibson Assembly Cloning Kit（美国马萨诸塞州伊普斯威奇新英格兰生物实验室）用HindIII-HF（新英格兰生物实验）消化线性化后，将启动子序列克隆到无启动子荧光素酶载体pGL4.10（luc2）（美国威斯康星州麦迪逊Promega）中。使用热休克转化具有化学活性的一次性TOP10大肠杆菌（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA），并用LB培养基（VWR，Radnor，PA，USA，）和50μg/mL氨苄西林（VWR，Radnor，PA，US）将其涂布在琼脂平板上。我们通过Sanger测序验证了每个产生质粒的重组菌落，该质粒用于本手稿中描述的实验。

2.5. 萤火虫荧光素酶报告子结构的定点突变

使用JASPAR数据库鉴定了远端ABCA1启动子1序列（P1b）中−150至351区域的E-BOX、SP1和LXR基序的转录因子结合位点[23]突变介绍如下：

电子箱CACGTG>CACGAG

SP1 GGGCGGGG>GGCTCTG

LXR TGACCGATAACCT>TGAAGGATAAAGT

通过两步PCR对远端ABCA1启动子1序列（P1b）中E-BOX、SP1和LXR的转录因子结合位点进行定点突变，先在98°C下进行初始变性30秒，然后使用以下引物集在98°C下进行35次变性30秒和在72°C下伸长45秒：

电子邮箱mut_F GCCTCCACGAGCTTTCTGCTGAGTGACTGA

电子邮箱-mut_R AAAGCTCGTGGCCGCCAGGCAGAC

SP1-mut_F AAGGGCTCGCTGAGGAGGGAGCACAGGC

SP1-mut_R GCCTGTGCTCCCTCCTCAGCGCTT

LXR-mut_F TGAAGGATAGAAAGTCTGCTCGGTGCA

LXR-mut_R ACTTTACTCCTTCAAAGCCTGTGCTCTC

2.6. 瞬态转染和发光测量

通过发光测量外源ABCA1启动子活性，8×10⁴每孔HMLE、HMLE/pWZL-Twist、MCF7或MDA-MB-231细胞接种在0.5 mL培养基中的24孔板上。24小时后，使用脂质体3000试剂（美国宾夕法尼亚州Radnor的Thermo Fisher Scientific公司）将0.5μg pGL4.10[luc2]实验萤火虫荧光素酶报告子和0.5μg的pRL-SV40对照肾小球荧光素酶载体（美国威斯康星州麦迪逊市Promega）共同转染细胞。48小时后，使用Base Infinite M200 Pro Microplate Reader（瑞士梅内多夫帝肯集团有限公司）使用双荧光素酶报告检测系统（美国威斯康星州麦迪逊市普罗米加）测量发光。实验萤火虫荧光素酶基因的表达被归一化为对照肾小球荧光素瘤基因的表达。

2.7. 逆转录病毒构建与ABCA1过度表达

使用以下引物集，通过两步PCR从人类ABCA1（NP_005493）VersaClone cDNA质粒（R&D Systems，Minneapolis，MN，USA）中扩增ABCA1，首先在98°C下变性2分钟，然后在98°C35个变性周期30秒，在68°C下伸长7分钟：

_对于GATGGGTGTACGTAGGATGCTTGTTGGCCTCAG

_R TGGAAAAAAACCGGAATTTGGTCATACTAGCTTTCACTTC公司

使用QIAquick凝胶提取试剂盒从0.7%琼脂糖凝胶中柱纯化PCR产物，并在使用Gibson Assembly Cloning Kit用EcoRI-HF和SalI（马萨诸塞州伊普斯威奇新英格兰生物实验室）消化线性化后，将其克隆到表达逆转录病毒载体pWZL Hygro中，该逆转录病毒是Scott Lowe（Addgene质粒#18750）赠送的。ElectroMAX DH5α-E细胞（Thermo Fisher Scientific，Radnor，PA，USA）使用Eppendorf Eporator（Eppendorm，Hamburg，Germany）进行转化。通过测序验证了克隆的总长度。

为了创造两栖性逆转录病毒，将包装好的铂-A（Plat-A）细胞培养在8 mL DMEM中，置于直径为10 cm的培养皿上，并使用Lipofectamine 3000试剂转染4μg pWZL或pWZL-ABCA1质粒。48小时后，收集病毒上清液，并通过0.45μm孔径过滤器（美国宾夕法尼亚州Radnor的Thermo Fisher Scientific公司）进行过滤，然后向上清液中添加8μg/mL聚溴乙烯（美国密苏里州圣路易斯的Sigma-Aldrich公司），以提高感染效率。靶细胞系MCF7的细胞与病毒上清液孵育过夜，然后用新鲜培养基替换。24小时后，我们通过将200μg/mL潮霉素B（Thermo Fisher Scientific，Radnor，PA，USA）加入培养基中4周，开始选择转导的细胞。

2.8. RNA干扰

为了击倒HMLE和MCF7细胞中的MYC，我们对2×10⁵在2 mL培养基中，将每个孔的细胞置于6孔板上。用50 nM siRNA和0.8%（HMLE）或2%（MCF7）Lipofectamine RNAiMAX试剂（Thermo Fisher Scientific，Radnor，PA，USA）转染细胞。为了同时击倒HMLE和MCF7细胞中的MYC和ABCA1，用25nM抗MYC siRNA和25nM反ABCA1 siRNA转染细胞。72 h后，分别收集总蛋白和RNA进行免疫印迹和qPCR。我们使用了以下低聚物（美国密苏里州圣路易斯Sigma-Aldrich）：

siCON任务siRNA通用阴性对照#1

siMYC#2 SASI_Hs01_00222677

siMYC#3 SASI_Hs01_00222678

siMYC 5号SASI_Hs01_00333889

siABCA1#1 SASI_Hs01_00129036

siABCA1#2 SASI_Hs01_00129037

2.9. 迁移分析

为了测量ABCA1过度表达、同时敲除MYC或MYC和ABCA1以及敲除ABCA1后的细胞迁移，将细胞置于饥饿培养基中过夜（HMLE为DMEM/F-12，MCF7为DMEM 0.1%FBS，MDA-MB-231）。那么，1×10⁵将0.5 mL饥饿培养基中的细胞分三次转移到12孔板中具有8μm孔的稀薄细胞培养插入物（Greiner Bio-One，Monroe，NC，USA）的上室，同时将1.5 mL完整培养基添加到下室。16小时后，用棉签擦洗上腔两次，将细胞从上腔顶部表面清除。我们用100%甲醇在室温下将迁移的细胞固定在上腔的底面上10分钟。迁移细胞的细胞核用1μg/mL DAPI染色2分钟或用0.05%结晶紫染色15分钟（37°C）。DAPI染色后，在数字倒置显微镜EVOS fl上拍摄9–12个视野中迁移细胞的照片，并在10倍物镜下应用荧光灯进行观察。为了量化目的，将照片转换为二进制图像，并使用图像1J 1.50i分析颗粒[24]. 从9到12个视野计算每个实验组的平均粒子数，并将其归一化为对照组的平均颗粒数。显示了每个实验组的代表性图像。结晶紫染色后，在使用倒置尼康Eclipse TE2000-U显微镜观察时，对9个视野中的细胞进行计数。从9个视野计算出每个实验组迁移的平均细胞数，并将其归一化为对照组迁移的细胞平均数。显示了每个实验组的代表性图像。

2.10. 细胞胆固醇测定

为了在同时敲除MYC或MYC和ABCA1后测量HMLE细胞中的细胞胆固醇，我们在上述6孔板上进行了反向转染。48小时后，取出完整培养基，将细胞置于饥饿DMEM/F-12培养基中过夜。测定ABCA1，2×10过表达后的细胞胆固醇⁵细胞接种在6孔板上。24小时后，对细胞进行胰蛋白酶消化、离心、再悬浮在PBS中并进行计数。如前所述，我们测量了胆固醇含量[18]并将其标准化为使用Pierce BCA蛋白质测定试剂盒（Pierce Biotechnology，Waltham，MA，USA）测量的蛋白质量。

对于胆固醇治疗，HMLE细胞连续3天每天补充500 nM水溶性胆固醇（美国密苏里州圣路易斯Sigma-Aldrich#C4951）。

2.11. 膜流动性分析

为了测量MYC或MYC和ABCA1同时敲除后的膜流动性，我们如上所述在96-well平板上进行反向转染。48小时后，将全培养基改为饥饿培养基过夜。如前所述，使用标记基因技术试剂盒（美国俄勒冈州尤金市标记基因技术公司）测量膜流动性[18].

2.12. CRISPR/案例9

使用CRISPR.mit.edu上的CRISPR设计网络工具获得针对ABCA1启动子1和外显子3的sgRNA序列。我们选择得分最高、非靶点数量最少的sgRNAs，尤其是在基因编码区（不包括PAM序列）：

靶向ABCA1启动子的sgRNA1 GGCTGACGTCGCCCGTTTA

靶向ABCA1外显子3的sgRNA2 GCCGAACAGATGATC

设计了具有附属悬链的互补寡核苷酸，并使用金门克隆协议将sgRNAs克隆到质粒中[25]. sgRNA1被克隆到lent sgRNA（MS2）_zeo主干（Addgene质粒#61427，Watertown，MA，USA）[26]用BsmbI（美国马萨诸塞州伊普斯威奇新英格兰生物实验室）消化后。sgRNA2被克隆到pGL3-U6-sgRNA-PGK-嘌呤霉素（Addgene质粒#51133，Watertown，MA，USA）中[27]在用Eco31l（Thermo Fisher Scientific，Radnor，PA，USA）消化后。通过测序验证sgRNAs插入阳性克隆。

我们通过将2A-GFP插入eSpCas9（1.1）（Addgene质粒#71814，Watertown，MA，USA）中，获得了高特异性的pSpCas9[28]在与EcoRI（美国马萨诸塞州伊普斯威奇新英格兰生物实验室）线性化后。从pSpCas9n（BB）-2A-GFP（PX461）获得2A-GFP PCR产物（Addgene质粒#48140，Watertown，MA，USA）[25]，使用以下引物进行两步PCR，在98℃下初始变性30 s，然后在98℃变性35个周期5 s，在68℃下伸长1.5 min：

2A-GFP_F GAAAAAGTCAGAAATTCGGCAGTGAGAGGCAGAGG公司

2A-GFP_R CGAGCTCTAGGAATTAGATTCTTAGATTCCGTACAGCTCGCCA

使用QIAquick凝胶提取试剂盒从0.7%琼脂糖凝胶中柱纯化DNA，并使用Gibson组装克隆试剂盒克隆到eSpCas9（1.1）中。使用Eppendorf Eporator转化ElectroMAX DH5α-E细胞，并通过测序验证重组克隆中的插入物。

那么，2.5×10⁶根据制造商的建议，使用Lipofectamine 3000在6孔板上用2.5μg sgRNA（MS2）_zeo backbone-sgRNA1（g1克隆）或pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin-sgRNA2（g2克隆）转染MDA-MB-231细胞。用400μg/mL玉米霉素筛选转染细胞2周（g1）或1μg/mL嘌呤霉素筛选3天（g2）。选择后2.5×10⁶根据制造商的建议，使用Lipofectamine 3000在6孔板上用2.5μg pSpCas9（1.1）-2A-GFP转染MDA-MB-231/g1和MDA-MB231/g2细胞。48小时后，使用BD FACSAria II（BD Biosciences，Franklin Lakes，NJ，USA）选择GFP+细胞。GFP+细胞按照内部单细胞稀释方案进行扩增。在单细胞克隆扩增后，收集蛋白质，并如上所述测试细胞ABCA1的表达。GAPDH被用作负荷控制。

3.2. E-Box和SP1启动子元件调节EMT中的ABCA1

鉴于上皮细胞系和间充质细胞系中ABCA1的表达存在显著差异，我们接下来分析了澳大利亚广播公司1通过克隆其两个替代启动子P1和P2，这两个启动子以前曾被报道含有调控元件[21]转化荧光素酶报告质粒(图2a） 。将这些质粒转染到等基因HMLE和HMLE-Twist细胞后[33,34]分别代表上皮或间充质表型，我们发现启动子P1与Twist表达的间充质细胞中荧光素酶表达增加相关(图2b） 而启动子P2在这两种条件下几乎没有活性。为了进一步缩小调控区域，我们创建了一个覆盖近端启动子更有限区域的载体，我们称之为P1b。通过发光分析，我们发现P1b区域可以诱导转录活性，几乎与完整启动子一样多(图2c） ●●●●。因此，我们得出结论澳大利亚广播公司1上皮/间充质状态的表达发生在P1b近端启动子区。

在单独的窗口中打开

图2

澳大利亚广播公司1间充质细胞系中的表达通过其近端启动子中的E-box基序进行差异调节。(一)该示意图概述了澳大利亚广播公司1替代启动子。(b条)替代近端启动子P1或P2诱导的发光显示在年-轴(n个=4个技术副本）。误差线表示一个标准偏差。统计显著性如所示图1. (c（c）)启动子P1或启动子片段P1a和P1b诱导的发光显示在年-轴(n个=4个技术副本）。误差线表示一个标准偏差。(d日)这表明引入P1b启动子片段的突变破坏了E-box、SP1和LXR基序的结合能力。突变标记为粗体。(e（电子）)发光显示在x个-MCF7、HMLE、MDA-MB-231和HMLE-Twist细胞系中每个突变启动子的轴(n个=4个技术副本，每个）。误差线表示一个标准偏差。每个实验至少进行三次生物复制，并显示代表性数据*第页< 0.05, **第页< 0.01, ***第页< 0.001.

在P1b启动子区域内，有几个记录在案的调控元件，包括E-box、SP1和LXR元件[21]. 为了分离对特定元素的调节，我们使用定点突变对每个元素进行突变(图2d） ●●●●。然后，我们将这些构建体转染到四个细胞系中——MCF7和HMLE，代表上皮状态，MDA-MB-231和HMLE Twist作为间充质，并测量发光(图2e） ●●●●。这些实验至少重复了三次。这表明LXR元件的突变在所有情况下都降低了转录，证实了其作为一种强激活因子的既定作用澳大利亚广播公司1表达式[35,36]. 然而，这一调控在两种癌细胞表型中都能看到，因此不能解释澳大利亚广播公司1在EMT中。

与LXR相反，E-box和SP1元件的突变确实在调控上表现出状态特异性差异，其中E-box突变导致澳大利亚广播公司1在上皮状态下，SP1导致间充质状态下的抑制（也可能在上皮中，尽管没有达到统计学意义）。我们认为这意味着E-box结合转录因子抑制澳大利亚广播公司1在上皮状态下表达，而SP1结合因子诱导澳大利亚广播公司1在间充质状态下表达。然而，由于E-box突变与更大的整体表达变化相关，我们选择跟踪该元素。