单元格代表。2020年1月21日；30（3）：820-835.e10。
内聚蛋白破坏胚胎干细胞中多梳依赖性染色体的相互作用
,1,5 ,1,5 ,2,5 ,2,5 ,三 ,1 ,1 ,1 ,1 ,1 ,1 ,2 ,1 ,三 ,2,4,∗和1,6,∗∗
詹姆斯·罗德斯
1英国牛津OX1 3QU牛津大学南帕克斯路牛津大学生物化学系
安吉丽卡·费尔德曼
1英国牛津OX1 3QU牛津大学南帕克斯路牛津大学生物化学系
本雅明·埃尔南德斯·罗德里格斯
2德国明斯特48149 Roentgenstrasse 20，马克斯·普朗克分子生物医学研究所
诺埃利亚·迪亚斯
2德国明斯特48149 Roentgenstrasse 20，马克斯·普朗克分子生物医学研究所
吉尔·M·布朗
三英国牛津OX3 9DS牛津大学MRC威瑟尔分子医学研究所MRC分子血液学单元
Nadezda A.Fursova公司
1英国牛津OX1 3QU牛津大学南帕克斯路牛津大学生物化学系
尼尔·P·布莱克利奇
1牛津大学生物化学系，英国牛津OX1 3QU公园南路
Praveen Prathapan公司
1牛津大学生物化学系，英国牛津OX1 3QU公园南路
保拉·多布里奇
1英国牛津OX1 3QU牛津大学南帕克斯路牛津大学生物化学系
迈尔斯·K·侯赛因
1英国牛津OX1 3QU牛津大学南帕克斯路牛津大学生物化学系
Aleksander Szczurek公司
1英国牛津OX1 3QU牛津大学南帕克斯路牛津大学生物化学系
凯·克鲁斯
2德国明斯特48149 Roentgenstrasse 20，马克斯·普朗克分子生物医学研究所
金·纳斯迈思
1英国牛津OX1 3QU牛津大学南帕克斯路牛津大学生物化学系
维罗妮卡·J·巴克尔
三英国牛津OX3 9DS牛津大学MRC威瑟尔分子医学研究所MRC分子血液学单元
胡安·瓦奎里萨斯
2德国明斯特48149 Roentgenstrasse 20，马克斯·普朗克分子生物医学研究所
4英国伦敦帝国理工学院医学院临床科学研究所伦敦医学科学研究所
罗伯特·克洛泽
1英国牛津OX1 3QU牛津大学南帕克斯路牛津大学生物化学系
1英国牛津OX1 3QU牛津大学南帕克斯路牛津大学生物化学系
2德国明斯特48149 Roentgenstrasse 20，马克斯·普朗克分子生物医学研究所
三英国牛津OX3 9DS牛津大学MRC威瑟尔分子医学研究所MRC分子血液学单元
4MRC伦敦医学科学研究院、临床科学研究所、医学院、伦敦帝国理工学院、伦敦杜坎路、英国W12 0NN
5这些作者贡献均等
6潜在联系人
2019年3月30日收到；2019年11月25日修订；2019年12月16日验收。
这是一篇CC BY许可下的开放存取文章(http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/).
- 补充材料
文件S1。图S1-S9和表S1
GUID:79FB8AA3-1C3A-4D4E-8C73-0DD0E919DACE
表S2 Capture-C杂交探针，与图3、5和6相关
GUID:0ACB2EC3-7F71-4A0A-AFFA-448D3081EF1F
文件S2。文章和补充信息
GUID:35A6D2D9-73C7-428C-A4C6-A5684352229F
- 数据可用性声明
本研究中报告的高通量数据已存放在ArrayExpress上。本文中报告的Capture-C数据的登录号是ArrayExpress：电子邮箱-7840，对于cChIP-seq ArrayExpress：电子邮箱-7817，对于cRNA-seq-ArrayExpress：电子邮箱-7818对于Hi-C ArrayExpress：电子邮箱-7816。本研究中使用的公开数据见表S1。本研究中用于数据分析的所有R和Perl脚本均可根据要求提供。
总结
染色体组织如何与基因组功能相关，目前尚不清楚。内聚素、环挤压和CCCTC-结合因子（CTCF）被提议创建拓扑关联域（TAD）来调节基因表达。在这里，我们检查了缺乏凝集素的胚胎干细胞的染色体构象，发现与其他细胞类型一样，凝集素是产生TAD和调节A/B区隔的必要条件。然而，在缺乏凝集素的情况下，我们发现了一系列长期存在的染色体相互作用。这些对应于多梳抑制系统占据的基因组区域，并且依赖于PRC1。重要的是，我们发现内聚素可以抵消这些多梳依赖的相互作用，但不能抵消超增强器之间的相互作用。这种破坏性活动独立于CTCF和绝缘，似乎通过多梳系统调节基因抑制。因此，我们发现粘着蛋白破坏了多梳依赖性染色体的相互作用，从而调节胚胎干细胞中的基因表达。
关键词：凝集素、多梳、TAD、环挤压、Hi-C、基因调控
使用Hi-C、Capture-C和DNA-FISH，Rhodes等人。发现多梳靶基因之间的相互作用独立于胚胎干细胞中的凝集素发生。这依赖于PRC1，这些相互作用被内聚素介导的环挤压破坏。去除凝集素后，多聚体占用基因的基因阻遏作用增强，相互作用增强。
介绍
基因组的空间组织影响基因转录和其他基于DNA的基本过程。最近，全基因组染色体构象捕获（Hi-C）大大提高了我们对染色体组织的理解(Rowley和Corces，2018年). 这表明具有相似转录活性和染色质修饰的染色体的超大碱基区域倾向于优先相互作用。当这些相互作用涉及染色体的活性区域时，它们被称为A区，而活性较弱区域之间的相互作用被称为B区(Lieberman-Aiden等人。，2009). 在亚兆基尺度上，染色体被划分为拓扑关联域（TAD），对应于染色质的相邻区域，这些区域的相互作用比域外的染色质更频繁(Dixon等人。，2012,Nora等人。，2012,Rao等人。，2014). 越来越多的证据表明，TAD的形成是通过一个称为环挤压的过程进行的。有人提出，凝集素可以利用其ATP酶活性挤压染色质环，这受到CTCF占据的绝缘体DNA元件的限制或终止(Fudenberg等人。，2016,Sanborn等人。，2015). 这一过程被认为是构建和隔离染色体，限制远端基因调控元件对给定TAD内基因的影响。事实上，TAD边界的改变可能会导致基因表达紊乱和人类疾病(Despang等人。，2019,卡夫等人。，2019,Lupiáñez等人。，2015). 重要的是，内聚素在环挤压中的作用似乎与它在姐妹染色单体内聚中的基本且特征鲜明的作用不同(Guacci等人。，1997,Michaelis等人。，1997).
基于这些观察结果，超分辨率染色体成像已被应用于测试集成Hi-C实验中产生的组织概念是否在单个细胞中也很明显(Bintu等人。，2018,Finn等人。，2019,Miron等人。，2019). 这揭示了相邻的球形染色体结构，这些结构独立于内聚蛋白和环挤压，并且在单个细胞之间存在空间异质性。此外，单细胞Hi-C实验表明TAD内的相互作用很少(Flyamer等人。，2017). 这表明TAD不是静态结构实体，而是由相互作用的倾向导致的，只有在整体Hi-C分析中对细胞群体进行平均时，这种倾向才会变得明显。
鉴于TADs不是固定结构，粘附素和环挤压在调节间期染色体结构和功能方面还有哪些额外的作用，这仍然是一个基本问题。最近解决这些问题的尝试表明，内聚素调节超增强剂和A/B室之间的相互作用(Nuebler等人。，2018,Rao等人。，2017,施瓦泽等人。，2017)并有助于积极引导远距离增强子进入体细胞中的靶基因(Hadjur等人。，2009). 然而，这些过程在不同细胞类型中的作用程度、它们与CTCF/TAD的关系以及它们在基因调控中的作用仍不明确。
为了解决这些问题，我们去除了小鼠胚胎干细胞（ESCs）中的凝集素，并用Hi-C检测了染色体相互作用(Rao等人。，2017,施瓦泽等人。，2017). 然而，在缺乏凝集素的情况下，我们发现与多梳抑制复合物（PRC1和PRC2）占据的基因组区域相对应的一系列长距离高频相互作用持续存在。这些相互作用依赖于PRC1，有趣的是，我们发现多梳染色质结构域之间的相互作用在缺乏凝聚力的情况下增强，并且这种作用是细胞类型特异性的。通过单细胞分析，我们证明了凝集素分离了多梳染色质结构域，解释了Hi-C观察到的影响。去除CTCF和破坏TAD不会加强这些相互作用，揭示了凝集素通过独立于CTCF和绝缘的机制对抗多梳染色质结构域的结合。此外，我们发现内聚素丢失后多梳染色质域相互作用的增加似乎对基因表达有功能性影响。总之，这些发现揭示了凝集素在干扰多梳依赖性染色体相互作用和ESCs基因抑制中的作用。
结果
ESCs中存在与凝集素无关的染色体相互作用
我们选择研究ESCs中内聚蛋白的丢失，因为它们是非转基因的二倍体，并且有丰富的现有基因组信息来表征其染色体结构和染色质修饰。为此，我们使用基于CRISPR/Cas9的基因组工程，并开发了一种ESC细胞系，在该细胞系中，凝集素亚基SCC1（RAD21）可以通过生长素诱导的脱基因快速去除(夏目漱石等人。，2016;A、 1B和S1（第一阶段）A） ●●●●。为了检查在没有粘着素的情况下染色体的相互作用，我们用生长素处理细胞6小时，以使粘着素损失的影响显现出来，并进行比较就地高-C(Díaz等人。，2018,Rao等人。，2014)SCC1脱谐ESC矩阵（SCC1二甘醇)和控制ESC。与之前的调查结果一致(Rao等人。，2017,施瓦泽等人。，2017,Wutz等人。，2017)，凝集素的去除导致TAD的完全丧失(图S1B和S1C）和适度增强的A/B区室化(图S1D） ●●●●。然而，对Hi-C基质的目视检查也显示了许多在对照细胞中明显的相互作用，并且在缺乏凝集素的情况下持续存在(C） ●●●●。然后，我们使用计算方法来识别整个基因组中这些持久的相互作用(Rao等人。，2014)在凝集素缺失细胞中发现336个高相互作用频率位点。有趣的是，当我们检测是否存在与这些相互作用位点相关的DNA结合因子或染色质特征时，形成多梳抑制复合物（PRC1和PRC2）的蛋白质大量富集(D） ●●●●。当在相互作用位点检测PRC1、PRC2及其组蛋白修饰时，这种关联进一步明显(E和S1（第一阶段）E） ●●●●。这些位点上最丰富的多梳蛋白是PRC1组分RING1B。当我们更详细地检查其占有率时，我们发现85%（287/336）的交互作用具有与至少一个交互作用位点相关的RING1B，65%（218/336）在两个交互作用部位都具有RING1B。相反，与RING1B结合位点无关的相互作用（49/336[15%]）丰富了与活性转录基因相关的特征(图S1G） 极少数是在超级增强器之间（4/336[1%]）。有趣的是，当我们研究RING1B相关的相互作用时，它们往往涉及比平均长度更长的多梳染色质结构域，这些结构域高度富集多梳蛋白质，这表明多梳染色素结构域的大小可能会影响相互作用频率(图S1E和S1F）。多梳染色质结构域可与启动子和增强子关联(Rada-Iglesias等人。，2011). 我们发现，在缺乏凝集素的情况下持续存在的多梳染色质结构域大多与启动子相关，但不富集二价染色质状态(Azuara等人。，2006,Bernstein等人。，2006;图S1H和S1I）。因此，ESCs中内聚素的去除导致A/B区隔的加强和TAD的丢失，但一些强烈的染色体相互作用持续存在，这些往往与多梳系统占据的染色体区域相对应。
与ESCs中多梳染色质结构域相对应的凝聚力无关的染色体相互作用
（A） 说明为Hi-C开发的TIR1和SCC1 mAID GFP细胞系的基因型的示意图。
（B） SCC1-mAID-GFP ESCs±生长素免疫荧光显微镜图像（6 h）。用抗层粘连蛋白B1抗体标记核膜。比例尺，10μm（底部）。
（C） 对照组中的Hi-C（TIR1线+生长素）（左）和SCC1二甘醇（SCC1-mAID-GFP系+生长素）（右）细胞在生长素处理后以40-kb分辨率显示。SCC1上确定的峰值二甘醇Hi-C矩阵显示为黑色圆圈。基因组坐标如下图和矩阵右侧所示。
（D） 成对相互作用位点组蛋白修饰和蛋白质的富集与匹配随机相互作用位点的富集相比。
（E） 染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）快照显示了在缺乏凝集素的情况下持续存在的相互作用下的RING1B、H2AK119ub1、SUZ12和H3K27me3。上面以20kb的分辨率显示了Hi-C矩阵。用于此图的ChIP-seq数据集如所示表S1.
多囊介导在缺乏内聚蛋白的情况下持续存在的相互作用
在ESCs中，已知多梳染色质结构域可以相互关联，即使是在很长的距离上(Bonev等人。，2017,Denholtz等人。，2013,Joshi等人。，2015,Schoenfeld等人。，2015). 为了确定在缺乏凝集素的情况下持续存在的位点是否依赖于多梳系统来形成，在RING1B中添加了一个AID标签，删除了密切相关的paralog RING1A(A、 2B和S2系列A） ●●●●。然后我们用生长素处理细胞6小时，以去除RING1B（RING1B二甘醇)并执行就地去除PRC1后对基因组依赖性接触概率和TAD的检查显示，这些特征未受影响(C和2D），A/B分隔略有增加(图S2B） 。然而，在缺乏凝集素的情况下持续存在的位点上的相互作用从Hi-C基质中消失了(E、 2F和S2系列C） ●●●●。因此，在ESCs中，PRC1对A/B区隔化和TAD的作用很小，但对长距离染色体相互作用负责，这种作用在缺乏凝聚力的情况下也持续存在。
多囊介导在缺乏内聚蛋白的情况下持续存在的相互作用
（A） AID-RING1B细胞系基因型示意图。
（B） AID-RING1B ESCs±生长素免疫荧光显微镜图像（6 h）。用抗层粘连蛋白B1和RING1B抗体标记细胞。比例尺，10μm。
（C） 对照组或RING1B中Hi-C的基因差异接触概率度（AID-RING1B+生长素）细胞。
（D） 对照和RING1B的总TAD分析二甘醇分辨率为10-kb的细胞。有效接触概率显示在ESC Hi-C发布的TAD间隔集合中(Bonev等人。，2017).
（E） 控制中的Hi-C和RING1B二甘醇在5-kb分辨率下，细胞在没有内聚蛋白（黑圈）的情况下持续相互作用。RING1B ChIP-seq显示在矩阵的上方和左侧。
（F） 对照组和RING1B中Hi-C的聚合分析二甘醇在不存在粘着蛋白的情况下持续存在的相互作用的细胞（n＝336）。
内聚素去除增强长程多梳染色质结构域相互作用
在缺乏凝集素的情况下，我们注意到在Hi-C基质中，多梳染色质结构域之间的相互作用频率经常增加，这表明凝集素可能调节这些相互作用(C和A） ●●●●。事实上，对缺乏凝集素时持续存在的相互作用以及我们已经证明依赖PRC1形成的相互作用的综合分析显示，相互作用频率显著增加(B和第3章A） ●●●●。此外，相互作用频率的增加比内聚素去除导致的分隔作用的适度增加更为显著(B、 底部面板，以及图S3B） 。重要的是，这种影响并不是由于PRC1占用率增加所致，因为RING1B结合与正常黏附素水平的细胞相似，甚至略低(C和3D）。这表明凝集素调节多梳染色质结构域的相互作用而不影响PRC1的占有率。
内聚素去除增强长程多梳染色质结构域相互作用
（A） Hi-C说明SCC1中强度增加的相互作用二甘醇细胞系以20kb分辨率显示。RING1B ChIP-seq显示在矩阵的上方和左侧。
（B） 对照组和SCC1的Hi-C聚合分析二甘醇在没有凝集素（n=336）的情况下持续存在的峰值细胞（顶部面板）或在B隔间（底部面板）的一组距离匹配的控制位点处的细胞。在每个聚集图中，聚集矩阵中心50 kb处富集分数的修剪平均值显示在左下角，作为富集的量化。
（C） 控制中的RING1B和SCC1的ChIP-seq二甘醇如（A）所示的相互作用位点的细胞。
（D） RING1B处的RING1B-ChIP-seq信号（metaplots，左；boxplots，右）峰值重叠交互作用，在没有内聚蛋白的情况下持续存在。
（E） Capture-C之间的交互配置文件Nkx2-1型启动子和在对照和SCC1中选择的近端和远端RING1B占据位点二甘醇细胞。RING1B ChIP-seq峰如下面的蓝色条所示。的位置Nkx2-1型启动子用蓝色箭头/条表示，相互作用位点为染色体上的黑色条。读取密度对应于捕获中250个DpnII限制片段的平均标准化读取。
（F） 对照组和SCC1中的聚集Capture-C信号二甘醇相互作用位点的细胞根据与捕获位点的距离进行分离。SCC1中仅存在多梳靶基因启动子和RING1B占据位点之间的相互作用二甘醇如图所示。读取密度归一化为顶点的控制信号，x轴表示与DpnII片段中相互作用位点的距离。
（G） 对照组和SCC1中的平均Hi-C接触强度度在没有内聚素的情况下持续存在的相互作用中，根据相互作用之间的距离进行分离。
为了进一步探索多梳依赖性相互作用及其由凝集素调控，我们使用了一种称为Capture-C的技术，该技术在提高灵敏度和分辨率方面优于Hi-C，可以查询基因组中特定区域的相互作用(Hughes等人。，2014). 使用Capture-C，我们重点研究了与多梳染色质结构域相关的18个基因，并在去除凝集素后检查了它们的相互作用。有趣的是，我们的分析表明，在缺乏凝聚力的情况下，相邻的多梳染色质结构域之间的相互作用趋于不变或略有减少(E、 3F和第3章D–S3I）。相比之下，长距离发生的相互作用，通常是在不同的TAD之间，显示出它们的相互作用强度增加，而且这比内聚素去除导致的分隔作用的适度增加更为明显(E、 3F和第3章D–S3G）。重要的是，PRC1去除后，这些相互作用消失，表明它们依赖于完整的多梳染色质结构域(图S3C–S3E）。当我们在Hi-C分析中检查相关性相关相互作用时，这种距离依赖效应也很明显(G和第3章H） 但当我们检测其他缺乏多梳染色质结构域的受抑制基因启动子之间的相互作用时却没有(图S3J） ●●●●。
即使在我们的快速失活条件下，凝集素的去除也可能影响细胞周期的进展，因为凝集素在姐妹染色单体的凝聚力和有丝分裂的进展中起着重要作用(Peters等人。，2008). 事实上，当我们检测凝集素缺失细胞时，与对照组相比，有丝分裂细胞有轻微的积累(图S4A和S4B）。为了确保对多梳染色质结构域相互作用的影响不是由于细胞周期的改变，我们用诺卡唑处理细胞6小时，以诱导有丝分裂细胞的类似增加(图S4A和S4B）并重复Capture-C分析(图S4C–S4E）。重要的是，我们观察到多梳染色质结构域的相互作用没有改变，或略有减弱，这表明粘蛋白对多梳染色质结构域的影响与其在有丝分裂过程中的作用无关。因此，凝集素对染色体上非常接近的多梳染色质结构域之间的相互作用几乎没有影响，但可以抵消由长距离分隔的多梳染色体结构域之间相互作用，而不受其对细胞周期的影响。
凝集素对多梳染色质结构域的影响具有细胞类型特异性
在确定了凝集素在调节多梳染色质结构域相互作用中的作用后，我们渴望了解这是ESCs独有的还是其他细胞类型共享的。为了解决这个有趣的问题，我们使用来自其他细胞类型的Hi-C检测了多梳染色质结构域之间的相互作用，其中内聚素功能受到了干扰(A） ●●●●。小鼠肝细胞(施瓦泽等人。，2017)，我们观察到一些证据表明多梳染色质结构域之间存在关联，并且这些关联在没有内聚蛋白装载复合物成分NIPBL的情况下变得略强，这也会导致染色体内聚蛋白的丢失。然而，多梳染色质结构域的相互作用似乎要弱得多，去除内聚蛋白后对相互作用的影响比ESC中的作用更为微妙。相反，在三种不同的癌细胞系中，HAP1(Haarhuis等人。，2017)，HCT116(Rao等人。，2017)，和HeLa(Wutz等人。，2017)，我们在对照细胞中没有观察到多梳染色质结构域之间存在明显的点状相互作用，并且在去除SCC1（HCT116和HeLa）或去除凝集素装载体成分SCC4（HAP1）后，这些位点没有相互作用。总之，这些观察结果表明，黏连蛋白在破坏强多梳-染色质结构域相互作用中所起的作用是ESCs所特有的，其中多梳系统高度表达，并且已知在基因调控中发挥核心作用(Boyer等人。，2006,Endoh等人。，2008,Lee等人。，2006).
此前，有报道称，当SCC1耗尽时，人类癌细胞系（HCT116）中超级增强子之间的相互作用增加(Rao等人。，2017). 因此，我们热衷于探索这种效应是否也是细胞类型特异性的。当我们重新分析SCC1缺失HCT116细胞中的Hi-C数据时，我们还发现了超增强剂之间相互作用增加的证据，特别是在远距离(B） 。在小鼠肝细胞中，对超增强相互作用也有类似的影响(施瓦泽等人。，2017)和另一种人类癌症细胞系（HeLa）(Wutz等人。，2017). 然而，有趣的是，ESC中的凝集素耗竭对超增强器产生了完全不同的影响。在对照细胞中，超增强子之间的相互作用是明显的，但在黏附素缺失的细胞中，与其他类型的细胞相比，这些相互作用减弱或消失(B） 。在CTCF耗尽的细胞中也观察到这种效应(Nora等人。，2017)，表明凝聚素和CTCF支持而不是破坏ESC中的超增强相互作用。总之，这些观察结果揭示了粘附素在调节ESCs染色体相互作用中出乎意料的细胞类型特异性作用，粘附素支持超级增强子相互作用并破坏长程多梳染色质结构域相互作用。
凝集素独立于CTCF和绝缘材料对抗多梳染色质结构域相互作用
凝集素破坏多梳染色质域相互作用的能力可能与凝集素固有的过程有关，如环挤压，或依赖凝集素与CTCF的功能，如超增强剂的情况。为了区分这些可能性，我们在一个细胞系中进行了Capture-C，其中通过去除CTCF破坏了绝缘，但保留了粘附素和环挤出(A、 5B、，第5章A、 和S5B；Nora等人。，2017). 与内聚素的损失相反，CTCF的去除并没有加强远端多梳染色质结构域的相互作用(D、 5E、，第5章C、 和S5D）。当我们检测在相同条件下使用已发表的Hi-C去除CTCF后，在没有凝集素的情况下在同一细胞系中持续存在的相互作用时，这一点也很明显(Nora等人。，2017;C和5F）。因此，凝集素通过一个独立于CTCF和绝缘的过程抵消多梳染色质域的相互作用。
凝集素独立于CTCF和绝缘材料对抗多梳染色质结构域相互作用
（A） CTCF-AID-GFP细胞系基因型示意图(Nora等人。，2017).
（B） CTCF-AID-GFP细胞±生长素（48 h）的活细胞显微镜图像。比例尺，10μm（底部）。
（C） CTCF-AID-GFP细胞±生长素中Hi-C的聚集分析(Nora等人。，2017)在缺乏凝集素的情况下持续存在的相互作用（n=336）。在每个聚集图中，聚集矩阵中心50 kb处富集分数的修剪平均值显示在左下角，作为富集的量化。
（D） Capture-C之间的交互配置文件Nkx2-1型启动子和选定的近端和远端RING1B在CTCF-AID-GFP细胞中占据位置±生长素。RING1B ChIP-seq峰如下面的蓝色条所示。的位置Nkx2-1型启动子用蓝色箭头/条表示，相互作用位点为染色体上的黑色条。读取密度对应于捕获中250个DpnII限制片段的平均标准化读取。
（E） CTCF-AID-GFP细胞中的聚集Capture-C信号±生长素在相互作用中持续存在，这种相互作用是基于与捕获位点的距离分离的凝集素缺失。SCC1中仅存在多梳靶基因启动子和RING1B占据位点之间的相互作用二甘醇如图所示。在不含生长素的CTCF-AID-GFP细胞中，读取密度被归一化为峰值信号，x轴表示与DpnII片段中相互作用位点的距离。
（F） CTCF-AID-GFP细胞中的平均Hi-C接触强度±相互作用时的生长素，这种相互作用持续存在基于相互作用之间距离分离的凝集素缺失。
多梳染色质结构域相互作用被凝集素破坏
基于染色体信息采集的方法非常敏感，可以识别罕见的相互作用事件，例如在集成Hi-C分析中导致TAD出现的事件。然而，无论是Hi-C还是Capture-C都没有揭示这些相互作用的绝对频率。因此，为了表征多梳染色质结构域的相互作用，并确定内聚素调节这些相互作用的程度，我们开始测量单个细胞中的相互作用。我们专注于一对基因(霍克斯D10和直径x2)具有多梳染色质结构域，在Hi-C中表现出更强的相互作用(C） 和Capture-C(A） 去除粘连蛋白后。我们生成了唯一标记霍克斯D10/直径x2基因座和第二组具有相似相互作用的多梳靶基因，Nkx2-3/Pax2(图S7)，并执行非变性RASER-FISH(Brown等人。，2018)测量单个细胞中这些位点之间的三维距离(B、，S6系列C、 和第7页A） ●●●●。这揭示了粘连蛋白完整的细胞中的距离分布，包括一些近距离的细胞(C、，S6系列D、，第7页B、 和S7D）。当去除凝集素时，非常近距离的数量变大，这与在Hi-C和Capture-C中观察到的多梳染色质结构域之间的接触概率增加一致(). 此外，为了测试这是否取决于凝集素的失活和PRC1的存在，我们开发了一个双脱细胞系，其中SCC1和RING1B通过添加生长素同时耗尽(图S6A） ●●●●。这一行的Capture-C显示霍克斯D10和直径x2(图S6B） 。类似地，在没有凝集素和PRC1的情况下霍克斯D10/直径x2和Nkx2-3/Pax2在荧光中就地杂交（FISH）大大减少(C和第7页B） 。总之，这表明凝集素可以抵消单个细胞中的多梳染色质结构域关联。
多梳染色质结构域相互作用被凝集素破坏
（A） 控件和SCC1中HoxD10（顶部）和Dlx2（底部）视点的Capture-C交互配置文件二甘醇线。RING1B ChIP-seq峰值显示为蓝色条，TAD间隔显示为黑色条。
（B） RASER-FISH的代表性图像显示信号分为接触（顶部对，相距0.0905μm）和非接触（底部对，相距1.1629μm）。探针用于Dlx2（绿色）和HoxD10（红色）。比例尺，5μm。
（C） 显示所示单元格行中Dlx2和HoxD10之间3D距离测量值的小提琴图。虚线显示了每个细胞系n=376–409等位基因的中位数和四分位范围。
（D） 绝对接触概率，表示根据（B）和（C）中的观察结果判断为共定位的信号百分比（参见STAR方法).
（E） 生长素处理（UNT）前后PCGF2-Halo-JF549 SCC1-mAID-GFP细胞的最大强度投影（+AUX）。核焦点示例（多梳体）用箭头表示。比例尺，5μm。
（F） 比较PCGF2-Halo-JF549 SCC1中每个单元多梳体数量的箱线图二甘醇ESCs未经处理（35个细胞，UNT，蓝色）和生长素处理（6小时）后（28个细胞，+AUX，红色）（左）。多梳体在（5283个病灶，UNT，蓝色）和生长素（6小时）处理前（4321个病灶，+AUX，红色）的平均荧光强度（中间）和体积（右侧）。
以前的研究报告称，在Hi-C中显示强相互作用的位点并不总是等同于单个细胞中的频繁相互作用(Bonev等人。，2017,Fudenberg和Imakaev，2017年). 因此，我们希望通过确定可能被认为是接触的FISH探针测量值的数量来准确量化多梳染色质域相互作用的频率(Cattoni等人。，2017). 这表明霍克斯D10和直径x2多梳染色质结构域接触（接近187nm）的时间为2%(D） ●●●●。去除粘着蛋白后，接触频率增加到5.6%，这表明当粘着蛋白存在时，它的作用是破坏多梳抑制系统所占据的染色质区域之间的相互作用。重要的是，多梳染色质结构域之间增加的关联依赖于凝集素和PRC1，因为它们的同时去除将相互作用频率降低到0.7%。再次，当我们检查与Nkx2-3个和Pax2（帕克斯）基因(图S7C） ●●●●。此外，这些相互作用依赖于多梳系统，因为仅去除PRC1时的频率与去除PRC1和凝集素时的频率相似(图S7C） ●●●●。同样重要的是要指出，这些相互作用值可能低估了多梳染色质结构域相互作用的绝对频率，因为特定位点对之间的相互作用可能在单个细胞之间发生变化。
在ESCs中，多梳蛋白富集在100多个细胞学上不同的称为多梳体的病灶中，据报道在这些病灶中发生多梳染色质结构域相互作用(Blackledge等人，2019年,Isono等人。，2013,Ren等人。，2008). 考虑到去除凝聚素后多梳染色质结构域之间的关联增加，我们很好奇这是否也会影响多梳体的性质。为了检验这种可能性，我们对对照细胞和黏合素缺失细胞中的多梳体进行了成像(E和6F）。有趣的是，去除凝聚素后，多梳体的数量、强度或体积没有明显变化。有一个轻微的趋势，即多梳弹体数量更多、强度更低，但这些微小变化的相关性需要更详细的研究。然而，我们的观察表明，这些多梳体特征与我们在Hi-C、Capture-C和DNA-FISH中测量的多梳染色质结构域相互作用的增加没有直接联系，这些相互作用是在去除凝集素后进行的(和). 这与我们最近的研究结果一致，即当失去多梳染色质结构域相互作用时，ESCs中多梳小体的数量仅受到轻微影响(Blackledge等人，2019年). 因此，尚不清楚多梳体在多大程度上代表了多梳染色质结构域之间的相互作用，或者只是多梳蛋白质在单个结构域的堆积。然而，我们的单细胞测量量化了多梳染色质结构域在单个细胞中相互作用的频率，并表明，尽管没有显著改变多梳体，但内聚素破坏了多梳染色体结构域的相互作用。
缺乏凝集素时多梳染色质结构域关联增加抑制基因表达
在脊椎动物中，多梳抑制复合物在维持不应表达的细胞类型中基因的抑制方面发挥着重要作用(Schuettengruber等人。，2017). 这被认为依赖于染色质修饰，在某些情况下，依赖于多梳染色质相互作用的形成(Eskeland等人。，2010,Kundu等人。，2017). 在这里，我们证明了凝聚力抵消并破坏了多梳染色质结构域及其相关基因之间的长程相互作用。因此，我们有兴趣测试凝集素是否影响多梳介导的基因抑制。为了检验这种可能性，我们在去除凝集素前后进行了校准RNA-seq（cRNA-seq）。与之前在内聚素缺失后的分析一致，基因表达的变化不大，只有几百个基因的转录发生了显著变化(Rao等人。，2017;A） ●●●●。然而，我们也观察到基因转录发生了更细微和广泛的减少，这与黏着素在支持启动子-增强子相互作用和基因表达中的拟议作用相一致(Hadjur等人。，2009,Schwarzer等人。，2017). 然而，值得注意的是，在表达显著降低的基因中，RING1B结合基因的比例过高（251/365），这表明它们受到了不均衡的影响(B） 。重要的是，这些转录变化通过RNA-FISH验证(图S8A和S8B），独立于对细胞周期的任何影响(图S8C） ，并且倾向于对应具有特别高水平的多梳，但不与三Thorax相关的染色质修饰的基因(图S8D和S8E）。可检测表达的多梳结合基因的更详细分析(图S8我们的cRNA-seq中的I和S8J）表明，如果该基因与另一个多梳染色质结构域相互作用，在去除内聚素后，表达量的减少幅度更大(C和7D）。相比之下，上调基因的数量要少得多，尽管多梳染色质结构域略微丰富(图S8F） ，平均更接近TAD边界和附近的超级增强子(图S8G） ●●●●。有趣的是，这些基因在CTCF缺失后表达也增加(图S8H；Nora等人。，2017)，表明对表达的影响可能是由于绝缘层的损失。综上所述，这些观察结果表明，凝集素及其环挤压活性在抵消长程多梳染色质结构域相互作用和调节多梳系统的基因抑制中起着直接作用。
缺乏凝集素时多梳染色质结构域关联增加抑制基因表达
（A） Scc1-mAID-GFP细胞±生长素（6 h）基因表达变化的MA图。表达增加或减少的基因数量（p-adj<0.05和>1.5倍）显示为红色。log2倍变化的密度显示在右侧。
（B） 基因启动子处的RING1B结合（来自TSS（转录起始点）的±1 kb，蓝条），与所有基因（右）相比，去除内聚蛋白后，基因表达降低（左）。下调基因中RING1B结合基因富集的经验p值：p<0.0001（n=10000随机测试）。
（C） 表达的RING1B结合基因与Hi-C中的另一个RING1B-结合位点相互作用（右）或不相互作用（左）时，基因表达量的变化幅度。
（D） Hi-C（左为40-kb分辨率，右为10-kb分辨率）、cRNA-seq和RING1B ChIP-seq，用于两个在去除凝集素后增强了Hi-C中相互作用的基因，其基因表达降低。
讨论
凝集素如何作用于塑造染色体结构和功能，目前尚不清楚。在这里，我们使用degron等位基因和染色体构象捕获方法，确定了一系列在没有内聚蛋白的情况下持续存在的长程相互作用，并对应于多梳染色质结构域(). 我们证明PRC1对这些相互作用的形成至关重要(). 在没有粘连蛋白的情况下，多梳染色质结构域的相互作用增强，表明它们通常被粘连蛋白抵消(). 这种对强多梳染色质结构域相互作用的影响是ESCs所独有的，因为ESCs的多梳蛋白质水平较高，并且多梳系统在基因调控中起着重要作用(). 重要的是，凝集素独立于CTCF和绝缘调节这些相互作用(). 利用细胞成像技术，我们可视化了多梳染色质结构域的相互作用，量化了它们的频率，并进一步证明了凝集素在干扰单个细胞中多梳染色素结构域相互作用中的作用，而不受多梳小体的影响(). 最后，我们证明了凝集素对多梳染色质结构域相互作用的调节似乎可以调节多梳靶基因的表达(). 这些发现揭示了多梳系统形成长距离转录抑制性染色体相互作用的能力与凝集素之间的联系，凝集素似乎积极地抵消和调节这一过程(图S9).
最初，凝集素破坏抑制性多梳染色质结构域相互作用的观察可能看起来违反直觉。为什么细胞破坏染色体的相互作用是有利的，比如在多梳染色质结构域之间形成的染色体相互作用，这些结构域起保护作用，防止不适当的基因表达？一个简单的解释可能是，如果不加以控制，形成核并促进抑制性染色质相互作用的因素的渐进结合可能会导致不可逆转的沉默状态。在多能干细胞或早期发育阶段，这种静态状态可能有害，因为许多被多梳染色质域占据并参与长程相互作用的基因必须在发育后期表达。这可能解释了为什么粘连蛋白破坏ESCs中的多梳染色质结构域相互作用。多梳染色质结构域相互作用被认为发生在多梳体内(Bantignies等人。，2011,Isono等人。，2013)和多梳体最近已与相分离联系在一起(Plys等人。，2019,Tatavosian等人。，2019). 然而，我们发现，去除内聚素后，多梳染色质域相互作用的增加对多梳体特征的影响很小，而去除多梳染色素域相互作用对多梳体内的影响不大(Blackledge等人，2019年). 这表明多梳染色质结构域的相互作用与多梳体和相分离并不是密不可分的。然而，基于凝集素破坏多梳染色质结构域相互作用的能力，很容易推测凝集素可能在间期染色体上广泛发挥作用，以抵消停滞的可能性，这与聚合物建模和环挤压模拟的预测一致(Nuebler等人。，2018). 通过周期性地打破自结合染色质结构域，环挤压可能为细胞核中的因子提供机会，以便在未来的基因表达计划需要时，不断对基因组的这些区域进行取样。基于这些观察结果，在未来的工作中，更详细地了解这些效应对干细胞生物学、分化和发育中多梳染色质结构域相互作用和基因表达的相关性将非常重要。
有趣的是，癌细胞中的超增强子之间的相互作用以前被证明是独立于凝集素发生的，并且在去除凝集素后，长程超增强子关联也增加了(Rao等人。，2017). 从概念上讲，内聚素和环挤压可以抵消多梳染色质结构域的相互作用以缓解停滞状态，人们可以设想周期性破坏超增强子关联以及它们与基因启动子的相互作用如何支持对基因调控相互作用的持续重新评估。为了测试这些观察结果的普遍性，我们检查了内聚蛋白的去除是否对ESC中的超增强剂有类似的影响。与癌细胞中凝集素对抗超增强剂相互作用的情况不同，在ESCs中，凝集素是超增强剂交互作用所必需的，这也依赖于CTCF.这一有趣的观察表明，内聚蛋白支持ESC中超增强相互作用的过程与破坏多梳染色质结构域相互作用的不同，因为内聚蛋白（而非CTCF）的耗竭稳定了多梳染色素结构域的相互作用。更重要的是，这也表明凝集素对染色体相互作用具有显著的细胞类型特异性影响。当我们检测癌细胞中的多梳染色质域相互作用时，这一点更加明显，其中野生型细胞中不存在长程相互作用，当去除凝集素时也不会增加。这些观察结果表明，对不同细胞类型中凝集素功能的详细分析可能揭示出凝集素在形成染色体相互作用中新的和意想不到的作用。
我们证明了凝集素在破坏多梳染色质结构域相互作用中起着重要作用。虽然实现这一目的的明确机制尚待确定，但我们推测这可能取决于包裹的染色质通过内聚蛋白复合体挤出的拓扑方式；然而，通过其他机制通过多梳结构域的内聚蛋白移位也可能破坏相互作用。我们设想，在靠近多梳染色质结构域的染色体上加载凝集素，然后进行环挤压，可以通过暂时取代PRC1或破坏多梳染色素结构域之间的生化链接，从而中断与其他多梳染色蛋白结构域的相互作用，无论它们是在染色体上还是在染色体之间被大距离分开(图S9). 这也解释了为什么CTCF及其在停止挤压中的拟议活性不会影响我们观察到的凝集素抵消多梳染色质域相互作用的能力。相反，CTCF和环挤压的终止可能通过限制无约束环挤压可能导致的染色质混合，将基因调节元件的活性限制在CTCF位点之间的区域。为了进一步了解粘着蛋白如何破坏多梳染色质结构域，在未来的工作中，解剖粘着蛋白复合物的哪些成分是这一过程所必需的也很重要。最近使用基于小干扰RNA（siRNA）的敲除方法表明，这些效应可能部分依赖于凝集素亚基基质抗原（SA）的SA1副序列(Cuadrado等人。，2019). 然而，要确定这些效应的相关性以及其他凝集素复合体亚单位对多梳染色质结构域相互作用的破坏所起的作用，需要快速的基于脱基的耗尽方法，以减轻敲除方法固有的二次效应。
最后，凝集素最能表征其在复制后和细胞分裂期间将姐妹染色单体结合在一起的作用。相反，染色体复合体的其他结构维持，例如细菌SMC-ScpAB和真核细胞凝聚素，被认为在通过环挤压过程分离染色体中发挥作用(Goloborodko等人。，2016,纳斯迈思，2001,Wang等人。，2017). 我们的观察提供了证据表明，除了在姐妹染色单体内聚中的作用外，凝集素还在染色体的分离区域中保持其原始SMC复合体的活性，这一点从它在破坏长程多梳染色质结构域相互作用中的作用中可以看出。
STAR★方法
实验模型和主题细节
细胞培养
所有细胞系均来自野生型雄性E14小鼠ESCs细胞背景。ESCs在明胶涂层板上生长，培养基为DMEM，添加10%FBS、青霉素/链霉素、5μM 2-巯基乙醇、2 mM L-谷氨酰胺、非必需氨基酸和10 ng/mL重组白血病抑制因子（LIF）。
蛋白质降解和诺卡唑治疗
治疗前一天，ESCs被放置在10厘米的盘子上。介质被平衡（37°C和5%CO）替换2)含有生长素钠盐（500μM）（西格玛）或100 ng/ml诺卡唑（西格马）的培养基。在胰蛋白酶化和细胞计数（在含有生长素的培养基中）之前，将细胞培养6小时或48小时（CTCF-AID）。100000个细胞用于Hi-C，其余用于western印迹，以确认蛋白质降解。
方法详细信息
细胞系的产生、培养和处理
克隆
pSpCas9（BB）-2A-Puro（PX459）用于构建CRISPR/Cas9载体（Addgene 48139）。将以下gRNA寡聚体克隆到BbsI限制性位点中：
ROSA26 CGCCCATCTTCTAGAAAGAC公司
SCC1 3′CCACGGTTCCATATTATCG公司
环1A 5’UTR CTCAGCGGAGCCCCGCTTGG
RING1A内含子3 GCGACCGTGCAGCTGACGTT
环1B 5′GCACAGCCTGACATTTCT
PCGF2 3′CCCTTTCCTCAAGGGGGCA公司
对于同源性导向的基因靶向和修复，Gibson Assembly生成了500-1000 bp的同源臂。
基因编辑
的编码顺序水稻通过pX459 ROSA26和pUC19 ROSA-TIR1的共转染，将TIR1和剪接受体杂合导入ROSA26位点。由此产生的ESC为ROSA-TIR1。
通过pX459 SCC13′和pUC19 SCC1-mAID-eGFP的共转染，将mini-AID和eGFP导入ROSA-TIR1 ESCs中SCC1的C末端。产生的ESC为ROSA-TIR1 SCC1-mAID-eGFP（SCC1-AID）。
通过共转染跨越外显子1至3的两个gRNA（pX459 RING1A 5′UTR和pX459RING1A内含子3），从ROSA-TIR1-ESCs中删除RING1A。由此产生的ESC为ROSA-TIR1 RING1AΔ。
通过pX459 RING1B 5′和pUC19 AID-RING1B的共转染，在ROSA-TIR1 RING1AΔESCs的RING1BN端引入全长AID。由此产生的ESC为ROSA-TIR1 RING1AΔAID-RING1B（RING1B-AID）。
通过pX459 SCC1 3′和pUC19 SCC1-mAID-GFP的共转染，在ROSA-TIR1 RING1AΔAID-RING1B ESCs中SCC1的C末端引入了mini-AID和GFP。产生的ESC为ROSA-TIR1 RING1AΔAID-RING1B SCC1-mAID-GFP（SCC1-AID RING1B-AID）。
通过共转染pX459 PCGF2 3′和pUC19 PCGF2-HT，将HaloTag导入SCC1-mAID-eGFP ESCs中PCGF2的C末端。用500 nM Halo-TMR标记转染细胞，并用脂质体2000转染FACS筛选鉴定功能性HaloTagCells克隆。第二天传代细胞，用嘌呤霉素（1μg/ml）筛选转染细胞两天。在去除嘌呤霉素8天后，通过PCR和蛋白质印迹对菌落进行挑选和基因分型。
现场低单元输入的Hi-C库生成
我们表演了就地Hi-C开启控制（TIR1+生长素），SCC1二甘醇（SCC1-AID+生长素），RING1B二甘醇（RING1B-AID+生长素）ESC(Díaz等人。，2018)在生物副本中。100000个ESCs在1%甲醛中交联，并在室温下旋转培养10分钟（20 rpm）。通过添加甘氨酸（0.2 M）并在室温下以温和旋转（20 rpm）孵育5 min来终止反应。用1 mL冷PBS清洗细胞三次（在4°C下以300 g离心5分钟），然后在250μL冰镇溶液中轻轻再悬浮就地Hi-C缓冲液（10 mM Tris-Cl pH 8.0，10 mM NaCl，0.2%IGEPAL CA-630，cOmplete Ultra蛋白酶抑制剂）并在冰上培养15分钟。然后将样品离心并重悬于250μl就地Hi-C缓冲区。细胞离心（13000 g，在4°C下5分钟），并重新悬浮在250μl冰镇10x NEB2缓冲液中。将细胞核离心（13000g，在4°C下5分钟），并通过将其重悬在50μl 0.4%SDS中并在65°C下孵育10分钟来使其透化。通过添加25μl 10%Triton X-100和145μl无核水对SDS进行淬火，并在37°C下摇晃培养45分钟（650 rpm）。通过在20μl 10x NEB2.1缓冲液中添加100 U MboI，在37°C下旋转90分钟来消化染色质。在62°C下加热灭活MboI 20分钟。通过添加0.4 mM生物素-14-dCTP（Thermo Fisher Scientific）、10 mM dATP/dGTP/dTTP（每个二核苷酸0.75μl）和5 U/μl DNA聚合酶I Klenow（8μl；新英格兰生物实验室）的混合物来填充限制酶产生的悬液，并在37°C下旋转培养90分钟。DNA片段在无核水（657μl）、10x T4 DNA连接酶缓冲液（120μl），10%Triton X-100（100μl）和20 mg/mL BSA（12μl）以及5 Weiss U/μl T4 DNA连接酶（5μl，分两个阶段；Thermo Fisher Scientific）中通过在20°C温和旋转培养4小时进行连接酶。将细胞核离心（2500 g，室温下5分钟），并重新悬浮在500μl提取缓冲液中。用20μl 20 mg/mL蛋白酶K（Applichem）在55°C下，摇晃（1000 rpm）消化蛋白质30 min。添加130μL 5M NaCl，然后在65°C下摇晃过夜培养（1000 rpm）。将苯酚-氯仿-异戊醇（25:24:1；Sigma-aldrich）提取的DNA重新悬浮在30μl 10mM Tris pH 8.0（Applichem）中，并在37°C下与10 mg/ml RNase A（1μl；Applichem）孵育15分钟。为了从非门控片段中去除生物素，DNA样品在20°C下在10μl 10x NEB2缓冲液（新英格兰生物实验室）、1 mM dNTPs混合液（10μl）、20 mg/mL BSA（0.5μl），3 U/μl T4 DNA聚合酶（5μl；新英格兰生物实验）和无核酸水（高达100μl）的混合液中孵育4h而不旋转。使用Covaris S220仪器剪切样品（2个周期，每个50 s，10%负荷，4个强度，200个周期/次）。使用Dynabeads MyOne Streptavidin C1珠将生物素化片段拉下。使用NEBNext Ultra end Repair模块（新英格兰生物实验室）在珠子上对文库进行末端修复，并在1x B&W（10 mM Tris-Cl pH 7.4，1 mM EDTA，2 M NaCl）+0.1%Triton X-100上清洗两次，再悬浮在50μl中，然后转移到1.5 mL试管中。使用NEBNext®Ultra dA-Tailing模块（新英格兰生物实验室）添加Illumina测序适配器。在每个样品的4个平行反应中完成文库的最终扩增，如下所示：10μl的珠结合文库、25μl的2x NEBNext Ultra II Q5 Master Mix、5μl的10μM通用PCR引物、5μl的10μM索引PCR引物和10μl无核酸水。
按照程序分别对样品进行条形码编码和放大10个循环（Tir1+Aux_Batch1、Ring1B+Aux_ Batch1，Scc1+Aux _Batch3）、12个循环（Ring1B+Aux_3）或14个循环（Tir1+Aux_Batch、Scc1+Aux_Patch3）：98°C 1分钟，（98°C 10秒，65°C 75秒，斜坡1.50°C/s），重复10-14次，65°C5分钟，4°C保持。
将四个反应合并到一个试管中，并使用Ampure XP珠（Beckman Coulter）选择尺寸。使用Qubit dsDNA HS检测试剂盒和2100生物分析仪（安捷伦）上的DNA HS试剂盒对最终的Hi-C文库进行量化。首先在Illumina MiSeq（2x84bp配对-end；MiSeq试剂盒v3-150周期）上汇集文库并进行浅测序，以评估文库质量。然后在Illumina NextSeq上对其进行测序（2x80 bp配对-end；NextSerq 500/550高输出试剂盒v2-150周期）。
捕获-C
Capture-C库生成
Capture-C文库的制备如前所述(Davies等人。，2016). 107将小鼠ES细胞胰蛋白酶化，收集于50ml猎鹰管中的9.3ml培养基中，在室温下与1.25mL 16%甲醛交联10min。用1.5ml 1 M甘氨酸淬灭细胞，用PBS洗涤，并在4°C下旋转溶解20分钟（溶解缓冲液：10 mM Tris pH 8，10 mM NaCl，0.2%NP-40，补充完整蛋白酶抑制剂），然后在−80°C下快速冷冻在1 mL溶解缓冲液中。然后将裂解液在冰上解冻，造粒并重新悬浮在650μl 1x DpnII缓冲液（NEB）中。将三个1.5ml试管（每个试管含有200μl裂解液）与SDS并行处理（0.28%最终浓度，1小时，37°C，500rpm振荡间隔，30s开/30s关），用胰蛋白酶淬火（1.67%，37°C下1h，500rpm振动间隔，30s-开/30秒关）用3x10μl重组DpnII进行24小时消化（37°C，间隔500rpm，30s开/30s关）。用8μl T4连接酶（240 U）以1440μl的体积（16°C下20小时）单独连接每个染色质小份。随后，对含有连接性染色质的细胞核进行造粒、反向交联，并对连接性DNA进行酚-氯仿纯化。将样品重新悬浮在300μl水中，并进行13x超声处理（Bioruptor Pico，30 s打开，30 s关闭），或直至碎片大小达到约200 bp。使用AmpureX珠（Beckman Coulter，选择比：0.85x/0.4x）选择碎片大小，并通过生物分析仪评估正确大小。使用NEBNext DNA文库预处理试剂集（新英格兰生物实验室：E6040S/L）和NEBNext多重寡核苷酸（用于Illumina引物集1（新英格兰）和2（新英格兰。使用Herculase II融合聚合酶试剂盒（安捷伦）将文库扩增7倍。
Capture-C杂交和测序
5′生物素化探针（参见表S2)使用Hughes实验室的在线工具（CapSequm，http://apps.molbiol.ox.ac.uk/CaptureC/cgi-bin/CapSequem.cgi)长度为70-120bp，每个感兴趣的启动子有两个探针。各探针以2.9nM混合。两次采集样品，第一次和第二次采集分别进行72小时和24小时的杂交。为了平衡试管之间的捕获差异，在杂交之前将文库合并。用于控制，SCC1二甘醇，环1B二甘醇和SCC1二甘醇环1B二甘醇每个重复1.5μg单独杂交，然后合并进行第二轮杂交。在第一次捕获之前，分别以2μg的浓度对CTCF±AUX进行复用。按照制造商的说明，使用Nimblegen SeqCap（罗氏，Nimblegin SeqCap EZ HE-oligo试剂盒A，Nimbleden SeqCap-EZ HE-oligo试剂盒B，Nimbleten SeqCap-EZ附件试剂盒v2，Nimblen SeqCap EZ杂交和清洗试剂盒）进行72小时的杂交，然后进行24小时的杂交（双捕获）。使用SensiMix SYBR（Bioline，UK）和KAPA Illumina DNA标准（Roche）通过qPCR对捕获的文库摩尔浓度进行量化，并在Illuminia NextSeq 500平台上对三个生物复制品进行测序。
校准RNA-seq和ChIP-seq
校准总RNA-seq（cRNA-seg）
为了制备cRNA-seq的RNA，将500万只小鼠ESC（SCC1-AID±生长素）与200万只小鼠混合果蝇属SG4细胞。根据制造商的方案，使用RNeasy Mini试剂盒（QIAGEN）提取总RNA，然后用TURBO无DNA试剂盒（ThermoScientific）处理。使用2100生物分析仪RNA 6000 Pico试剂盒（安捷伦）评估RNA质量。为了构建文库，首先使用NEB下一个rRNA耗尽试剂盒（NEB）耗尽每个样本的rRNA。然后使用NEBNext Ultra II定向RNA-seq试剂盒（NEB）从200 ng RNA中制备RNA-seq文库。为了量化每一个样本的尖峰细胞混合的一致性，根据制造商的协议，使用Quick-DNA Miniprep试剂盒（Zymo Research）从混合小鼠和苍蝇细胞的小份中分离基因组DNA。按照制造商的指南，使用NEBNext Ultra II FS DNA文库准备试剂盒（NEB）构建50 ng基因组DNA的文库。NEBNext Multiplex Oligos用于索引库。使用2100生物分析仪高灵敏度DNA试剂盒（Agilent）分析所有文库的平均大小，并使用SensiMix SYBR（英国Bioline）和KAPA Illumina DNA标准品（罗氏）通过qPCR测量文库浓度。cRNA-seq和gDNA-seq文库在Illumina NextSeq 500平台上测序为四个独立的生物复制品的80 bp配对读码。
校准的ChIP-seq
5000万控制或SCC1二甘醇mESCs在固定前与500000个HEK293细胞混合。在室温下，将细胞在1%甲醛中固定10分钟。通过添加最终浓度为125μM的甘氨酸来猝灭甲醛。所有后续步骤如前所述(King和Klose，2017年). 对三个生物复制品的文库进行测序。
鱼类
RASER（单链核酸外切酶切除后的分辨率）-FISH
RASER-FISH的实施如前所述(Brown等人。，2018)有微小的变化。简单地说，细胞生长在盖玻片上，在最终浓度下用BrdU/BrdC混合物（3:1）标记24小时。将细胞固定在4%PFA（vol/vol）中15分钟，并在0.2%Triton X-100（vol/vol）中渗透10分钟。然后用DAPI（PBS中0.5μg/mL）对细胞进行染色，暴露在254nm波长的紫外线下15分钟，然后在37°C下用5 U/μL的核酸外切酶III（NEB）处理15分钟。标记探针（每个100 ng）在杂交混合物中于90°C下变性5分钟，并在37°C下预退火10分钟。将盖玻片与准备好的探针在37°C下杂交过夜。杂交后，在37°C的2x SSC中两次清洗盖玻片30 min，在RT的1xSSC中清洗一次。盖玻片在3%BSA（wt/vol）中被阻断，并用羊抗地高辛FITC 1/50（Roche，11207741910）检测地高辛，然后用兔抗羊FITC 1/100（Vector Laboratories，FI-6000）检测。盖玻片用DAPI染色（PBS中0.5μg/mL），用PBS洗涤并安装Vectashield（Vector Laboratories）。
探针和缺口翻译标签
化石探针WIBR1-0935O10（Nkx2.3 mm9；chr19；43659682-43698592[https://bacpacresources.org/]). 通过缺口翻译对探针进行标记，以用于FISH，如下所示：在缺口翻译之前，用RNase（0.02 U）（Sigma）处理1μg DNA，在37°C下处理30分钟，在以下反应混合物中在16°C下进行缺口翻译1小时；50 mM三氯化碳，5 mM氯化镁2，2.5μg BSA，10 mMβ-巯基乙醇，50 mM dAGC，20μM半抗原/荧光[digoxigenin-11-dUTP（Sigma）；Cy3-dUTP（GE Healthcare）]，15 U重组DNase1（Sigma]）和10 U DNA聚合酶I（NEB），最终体积为50μL，H20
成像设备和设置
在配备100x/1.40 NA UPLSAPO油浸物镜（Olympus）、CoolSnap HQ2 CCD相机（光度计）、DAPI（激发390/18；发射435/40）、FITC（激发475/28；发射525/45）和TRITC（激发542/27；发射593/45）的DeltaVision Elite系统（Applied Precision）上，在20°C下进行宽场荧光成像过滤器。以150nm的z步长采集12位图像堆栈，得到64.5nm x 64.5nm x 150nm的体素大小。使用惠更斯反卷积经典最大似然估计（科学体积成像B.V.）进行图像恢复。
smRNA-鱼类
单分子RNA荧光就地杂交（smRNA-FISH）已按照标准方法（Stellaris）进行。简单地说，用生长素处理生长在10 cm培养板上的菌落中的ESC 48小时，并用胰蛋白酶消化法收获，在4%甲醛中固定10分钟，在70%乙醇中渗透至少30分钟。将细胞离心、再悬浮并转移到杂交混合物中，该混合物由20%硫酸右旋糖酐、10%甲酰胺、2x SSC组成，探针（Q670）针对指示基因的内含子，总体积为200μl。在37°C下过夜培养后，用不含硫酸右旋糖酐（2x SSC）的杂交缓冲液多次清洗细胞，用DAPI（DNA）和Agglutin-A488（细胞膜）与Vectashide（Vectorlabs）混合染色，并将其涂在盖玻片上，形成细胞单层。使用运行Cell Sens软件的Olympus IX-83系统采集图像，该系统配备63x 1.4 NA油物镜和1200x1200px2 sCMOS相机（Photometrics），91.5 nm像素大小。图像堆栈共包含30个图像，以350 nm Z间隔采集。
多梳体的特性
多梳体成像
对活细胞中的Polycomb尸体进行成像，PCGF2-HaloTag SCC1度至少在成像前5小时，将细胞置于凝胶化的35 mm Petri培养皿、14 mm Microwell 1.5盖玻片培养皿（MatTek）上。用500 nm Halo-JF549标记细胞(Grimm等人。，2015)在37°C下保持15分钟，然后进行三次清洗，将培养基换成氟硼酸盐DMEM（Thermo Fisher Scientific）进行成像，并按照上述一般ESC培养进行补充。在37°C下，将细胞在添加有10μg/mL Hoechst 33258（Thermo Fisher Scientific）的氟硼酸盐DMEM中再培养30分钟，并在成像前再次清洗。在37°C加热、加湿的CO中，使用连接到旋转盘共焦系统（UltraView VoX PerkinElmer）的IX81奥林巴斯显微镜，使用EMCCD相机（ImagEM，Hamamatsu Photonics）进行成像2-控制室。Z堆栈是使用PlanApo 100x/1.4 N.a.油浸物镜，使用Volocity软件（PerkinElmer）加热至37°C获得的。PCGF2-HaloTag-JF549用561nm激光在15%激光功率下1.25s曝光，SCC1-AID-GFP用488nm激光在40%激光功率下1s曝光，而Hoechst用405nm激光在20%激光功率下250ms曝光。Z堆栈以150 nm的间隔采集。在两个生物复制品中，每个条件下至少有28个细胞被成像。
FACS公司
将细胞胰蛋白酶化并在PBS中4%甲醛中固定15分钟。在PBS内两次洗涤后，固定细胞在90%甲醇中渗透。在PBS中进行三次洗涤，然后在PBS（PBS-BSA）中5%牛血清白蛋白稀释的抗H3S10p一级抗体中培养1小时。然后将细胞在PBS中清洗三次，再悬浮在PBS-BSA中的抗鼠Alexa594二级抗体中。DNA在1μg/ml DAPI中孵育10分钟后染色。DAPI和H3S10p免疫荧光强度用BD-Calibur细胞分选仪通过FACS测定。
抗体
RAD21，1:1000（Abcam，ab154769），RING1B（western）1:1000（Klose Lab），RING1B（ChIP-seq）1:1000
量化和统计分析
不同的无酒精饮料品牌
高碳数据分析
对于每个库，使用Bowtie2在“非常敏感”模式下根据mm10参考基因组（UCSC）独立映射配对读取。未映射的读取被截断8bp并反复重新对齐，直到找到有效对齐或截断的读取小于30bp。下游分析中仅保留映射质量（MAPQ）>=30的唯一映射读取。然后使用Biopython“限制”模块计算预测的限制片段。将唯一映射的读取分配给片段、片段对对和对，过滤自带片段、PCR重复、距离最近限制位点映射超过5kb的读取对，以及无信息的连接产物(Cournac等人。，2012). 基因组以10 kb的分辨率装箱，通过计算每个箱子中有效片段对的数量来构建Hi-C矩阵。在使用每个染色体的KR矩阵平衡对矩阵进行标准化之前，屏蔽每个箱子中片段中位数少于10%的箱子(Knight and Ruiz，2012年).
观察/预期（OE）Hi-C矩阵生成
通过计算具有相同距离的所有位点的平均接触强度，获得预期的Hi-C接触值。然后，通过将每个归一化的观测值除以该距离对应的期望值，将归一化Hi-C矩阵转换为观测/期望（O/E）矩阵。分别对每条染色体进行O/E矩阵生成。
A/B隔间量化
按照前面描述的程序进行A/B隔间计算(Lieberman-Aiden等人。，2009,Flyamer等人。，2017). 简单地说，通过计算第i行和第j列的Pearson相关性，将500 kb分辨率下每条染色体的O/E矩阵转换为相关矩阵。相关矩阵的第一个特征向量形成了隔室向量。为了确保正值表示A（活动）区室，负值表示B（非活动）区室，我们使用GC含量作为代理：如果具有负条目的区域的平均GC含量高于具有正条目的区域的平均GC含量，则特征向量符号反转。比较不同条件下的绝对染色体内相关值，作为划分的测量。
高峰期呼叫
使用内部CPU实现的HiCCUP，在100kb分辨率矩阵中调用SCC1-AID峰值(Rao等人。，2014). 如前所述，获得每个像素的富集度和FDR值(Rao等人。，2014). 峰值必须（i）在油炸圈饼附近至少有2.25倍的富集度，（ii）在油煎圈饼附近的FDR≤0.05，（iii）在其余的邻里中FDR≤0.1，以及（iv）在峰值中心有29个接触点的最小观测值。这些特定值的稳健性已在大量区域中进行了视觉验证，以尽量减少假阳性。
聚合Hi-C特征分析（TAD、峰值和A/B隔间）
公布的ESC TAD时间间隔用于总TAD分析(Bonev等人。，2017). 为了计算总TAD图，提取O/E矩阵的子集并求平均值，以获得输出子矩阵。使用Scipy Python包中“最近”设置的“imresize”插值不同大小的子矩阵。使用每个组的TAD和峰值调用（有关参数详细信息，请参阅上面的“平均Hi-C特性分析”一节）。对于TAD，O/E矩阵的聚合分析以10kb的分辨率进行计算(Flyamer等人。，2017)峰值分辨率为10kb。为了计算聚合峰值分析，我们使用了coolpup.py(Flyamer等人。，2019)500kb窗口上的10kb分辨率非平衡矩阵。Cis公司将多梳结构域和至少相隔250kb的超增强子之间的相互作用与一组100个移位区域进行比较，以计算富集分数并消除覆盖和距离相关伪影。染色体X、Y和MT被排除在这些分析之外。聚集矩阵中心50kb处浓缩分数的修剪平均值显示为浓缩值。使用观察到的与预期的富集试验和迭代校正矩阵获得了类似的结果。
Hi-C峰处的ChIP-seq读数富集定量
中的数据集表S1使用实验室中的标准管道进行处理（请参阅下面的cChIP-seq读取处理）。使用MACS2构建堆，并使用获得的床图文件量化读取计数丰富性。使用HOMER中的函数annotatePeaks.pl分别量化每个交互的源和汇的读取计数丰富性(Heinz等人。，2010)带有选项-给定大小-原始。对于每个峰值，使用源和汇之间的平均值量化平均富集度。对1000个距离和染色体匹配的随机源-库对重复了这一过程。通过将观察到的富集度除以随机源-库对的平均富集度来量化折叠富集度。
聚合峰值分析间隔
远距离匹配的A和B隔间
TAD及其A和B隔间标识下载自(Bonev等人。，2017). 选择与SCC1中调用的环路数相同数量的A和B隔间同源对二甘醇细胞系。为了使数据分析更具可比性，以允许两个成对的100kb区域与SCC1的距离和染色体匹配的方式，选择了各自隔室中TAD的对照100kb区二甘醇称为循环。
捕获-C
Capture-C数据分析
Fastq文件与mm10基因组对齐，并使用HiCUP（v0.5.7）过滤(Wingett等人。，2015)和鲍蒂2(Langmead等人。，2009)碎片大小设置为100bp-800bp。然后使用Bioconductor软件包Chicago处理成对的bam文件(凯恩斯等人。，2016)（版本：1.0.4）根据芝加哥渐晕图，使用内置mESC-2reps重量设置。根据芝加哥得分>=5，将相互作用“峰值”称为“峰值”，距离小于10个碎片的相互作用峰值合并为一个峰值。从ChicagoData对象中提取加权平均读取计数。为了在测线图中进行可视化，针对每个DpnII片段，计算每个样本的每个启动子读取百分比（PRPP），以标准化读取计数。简单地说，读取计数除以与样本中捕获的启动子对齐的读取的总覆盖率，再乘以捕获的启动子数，然后再乘以100，得到每个DpnII限制性片段捕获的每个启动子的%读取数（PRPP=N/cov*nprom（非只读存储器）∗100). 出于显示目的，将读数乘以1000,、和（mPRPP）。用于骨料峰值分析(和)在单个DpnII片段水平上，使用得分>=5的芝加哥默认阈值确定显著富集的相互作用。由于多梳占据位点之间的峰大于平均DpnII片段，与<10 DpnII碎片距离的相互作用合并为一个峰。然后将峰值定义为对照样品（如果此样品中存在峰值）或存在峰值的样品中的局部最大值。为了使不同距离的相互作用具有可比性，然后将所有样本归一化为对照组峰值时的PRPP。对于中的骨料分析和多梳靶基因启动子与一组严格的RING1B峰之间的相互作用(Fursova等人。，2019)已考虑。
校准的RNA-seq（cRNA-seq/ChIP-seq）
读取计数定量和差异基因表达分析
对于差异基因表达分析，在使用自定义Perl脚本进行峰值归一化之前，使用定制的非冗余mm10基因集从原始bam文件中获取读取计数。为了生成非冗余的mm10基因集（n=20633），筛选了mm10-refGene基因，以删除序列可映射性差且转录高度相似的非常短的基因。为了确定生长素治疗后基因表达的显著变化，使用了利用DESeq2软件包的自定义R脚本(Love等人。，2014). 为了纳入峰值校准，使用DESeq2大小因子对原始mm10读取计数进行标准化，该大小因子是根据前面描述的一组独特dm6 refGene基因的读取计数计算的(Taruttis等人。，2017). 定量之前，果蝇属使用实际峰值比（dm6/mm10）对读数进行预归一化，该比值来自相应的gDNA-seq样本。使用p-adj<0.05和折叠变化>1.5的阈值来确定基因表达的显著变化。为了可视化，从DESeq2表中提取标准化读取计数，并用于量化RPKM。在添加0.01的假计数后，这些是log2转换。使用包装统计数据中的R Bioconductor函数cor（方法=“spearman”）计算复制相关性，结果>0.99。鉴于高再现性，对重复数据的DEseq2标准化读取计数进行汇总，对RPKM进行标准化，并对log2进行如上所述的转换，以便在.
cChIP-seq的读取计数定量和富集分析
对于cChIP-seq分析，读数在一组自定义的RING1B峰中进行量化。使用R Bioconductor包“GenomicFeatures”中的函数summarizeOverlaps（）量化成对读取(劳伦斯等人。，2013)选项mode=“联合”在log10转换之前添加了伪计数8。使用R Bioconductor stats软件包中的cor（method='spearman'）函数对重复数据进行比较，结果>0.99。对于池读取计数，使用samtools合并BAM文件，并使用上述过程从合并的BAM文件中量化读取。使用deepTools套件中的computeMatrix和plotHeatmap函数获得Metaprofiles(Ramírez等人。，2015).
鱼类
图像分析
如前所述(Brown等人。，2018). 简单地说，3D距离测量是使用ImageJ中的内部脚本进行的(https://imagej.net/欢迎). 作为预处理步骤，对图像区域进行彩色校正，以对齐绿色和红色通道图像。通过从0.1μm TetraSpeck®（Molecular Probes®）的图像中进行测量并计算每个颜色通道中图像之间的视偏移量，计算色度校正参数。仅在没有复制信号提示的情况下选择细胞进行分析。手动识别信号对，然后以识别位置为中心自动生成20×20像素和7-15 z步长的子体积。在每个识别的区域中，应用阈值来分割焦点。首先，图像区域被饱和到超过最高96.5%的强度水平，以减少噪声像素的影响，然后计算阈值为处理图像最大强度值的90%。对绿色和红色通道重复此操作。分割后，对信号质心位置进行数学计算，并将质心间3D距离测量值与.png图像一起输出以进行视觉检查。
接触概率阈值计算
为了评估我们的盈利间距离测量中有多大比例可能被视为共发事件，我们应用了以下基本原理，如下所述(Cattoni等人。，2017). 为了在真实、非理想的实验条件下测量共定位精度的误差，我们根据实验条件，将同一个磷探针与细胞中的二氧合酶（FITC检测）和Cy3进行标记和杂交。在我们的实验系统中，这两种颜色之间测量的距离范围显示共定位精度误差为73nm±38nm（平均值±SD）。由此，我们保守地假设，如果两个探针的分离距离小于187 nm（即平均值+3xSD），则有99%的机会实现共定位。
smRNA-鱼类
使用定制的ImageJ/Fiji脚本分析图像。简单地说，相对稀疏的smFISH斑点是从图像堆栈的2D最大投影中识别出来的。每个条件下从3个生物复制品中获得约3000个细胞。
多梳体的特性
多梳弹体分析
为了分割单个核中的多梳体进行分析，首先使用ImageJ中的TANGO基于Hoechst荧光手动分割核(Ollion等人。，2013). 使用Olympus cellSens软件对z堆栈的561 nm通道进行解卷积（约束迭代解卷积，5个周期）。SCC1-AID-GFP信号的丢失用于确认生长素处理对每个细胞核都是成功的。使用Hoechst派生的分段和使用自定义脚本识别的单个Polycomb体屏蔽去卷积561 nm z堆栈中的核。简单地说，用一个4像素的滚动球和一个用Otsu阈值法生成的Polycomb体掩模对分割的细胞核进行背景减除。ImageJ中的3D对象计数器用于量化遮罩Polycomb物体的特性，其输出通过自定义R脚本进行处理和分析。
数据和代码可用性
本研究中报告的高通量数据已存放在ArrayExpress上。本文报告的Capture-C数据的登录号为ArrayExpress：电子邮箱-7840，对于cChIP-seq ArrayExpress：电子表格-7817，对于cRNA-seq ArrayExpress：电子邮箱-7818对于Hi-C ArrayExpress：电子表格-7816。本研究中使用的公开数据见表S1。本研究中用于数据分析的所有R和Perl脚本均可根据要求提供。
致谢
我们要感谢Elphège Nora和Benoit Bruneau提供CTCF脱细胞系。我们要感谢尼尔·布罗克多夫（Neil Brockdorff）和弗朗西斯·巴尔（Francis Barr）对手稿的评论。我们感谢英国牛津动物学系的Amanda Williams对NextSeq 500的测序支持。我们感谢Jim Hughes、Damien Downes和Priscila Hirschfeld在发表之前为Capture-C提供建议、协议和探针。我们还要感谢怀特黑德研究所（马萨诸塞州剑桥）的Leah Bury在模型和图形抽象方面的帮助。
克洛泽实验室的工作得到了威康信托基金会（209400/Z/17/Z）、欧洲研究委员会（681440）和李斯特预防医学研究所的支持。A.F.得到了亨利·威康爵士信托基金的资助。纳斯米思实验室的工作得到了威康信托基金（107935/Z/15/Z）、英国癌症研究院（26747）和欧洲研究委员会（294401提案）的支持。Vaquerizas实验室的工作得到了Max Planck Society、Deutsche Forschungsgemeinschaft（DFG）Priority Programme SPP2202 Spatial Genome Architecture in Development and Disease（VA 1456/1项目）和英国医学研究委员会的支持。Buckle实验室的工作受到了MRC（MC_U_00016/1）和Wolfson Imaging Centre Oxford的支持，沃尔夫森基金会（联合MRC/BBSRC/EPSRC）和威康信托基金会。
作者贡献
概念化、J.D.P.R.、A.F.、B.H.-R、N.D.、J.M.V.和R.J.K。；方法学、J.D.P.R.、A.F.、B.H.-R、N.D.、J.M.B.、N.A.F.，N.P.B.、P.D.、M.H.、A.S.和K.K。；调查、J.D.P.R.、A.F.、B.H.R.、N.D.、J.M.B.、N.A.F.，P.D.、M.H.、A.S.、P.P.和K.K。；形式分析，A.F.、B.H.-R.、N.A.F.，M.H.、A.S.、J.M.B.和K.K。；资源、J.D.P.R.、A.F.、N.P.B.、P.P.、K.K.、J.M.B.、M.H.和A.S。；写作——原稿、J.D.P.R.、A.F.、B.H.-R、N.D.、J.M.V和R.J.K。；写作——审查与编辑、J.D.P.R.、A.F.、B.H.-R、N.D.、N.P.B.、N.F.、M.H.、P.D.、K.A.N.、V.J.B.、J.M.V.和R.J.K。；融资收购、A.F.、K.A.N.、V.J.B.、J.M.V.和R.J.K。；监理、K.A.N.、V.J.B.、J.M.V.和R.J.K。
补充信息
表S2：Capture-C杂交探针，与图3、5和6相关
工具书类
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