外源性雌激素抑制DMPA治疗的人源化小鼠中细胞相关HIV‐1的生殖道传播

2.2. 人性化小鼠

在动物实验之前，获得了俄亥俄州立大学IACUC的伦理批准，并且体内从2015年12月至2016年9月，按照实验动物研究所《实验动物护理和使用指南》的原则执行了相关程序。六至八周龄NOD‐scid‐IL‐2Rgc^无效的（NSG）雌性小鼠（n=65）从Jackson Laboratory（Bar Harbor，ME，USA）获得，并在12小时至12小时的光-暗循环下饲养随意获得食物和水。对于NSG小鼠植入，将hPBMC解冻、清洗并重新悬浮在PBS中，然后静脉注射（10⁷每只老鼠的细胞数）。注射hPBMC后14天和24天，用外周血评估hPBMC植入情况。血液与红细胞裂解缓冲液（eBioscience，加利福尼亚州圣地亚哥，美国）和用Live/Dead Fixable near‐IR（Invitrogen，Eugene，OR，美国）、抗人CD45 BV510（H130）、抗鼠CD45 PerCP（30‐F11）（BioLegend，加利福尼亚州圣迭戈，美国）以及抗人CD3 FITC（UCHT1）（BD Bioscienses，加利福尼亚州圣荷西，美国）抗体染色。细胞固定在Cytofix中^TM（TM）缓冲液（BD Biosciences），并由FACSCanto II流式细胞仪（BD bioscience）采集。数据由FACSDiva（BD Biosciences）获取，并使用FlowJo软件（Tree Star Inc.，Ashland OR，USA）进行分析。与移植骨髓、肝脏和胸腺（BLT）人源化小鼠不同，hPBMC移植NSG（hPBMC‐NSG）小鼠的下生殖道粘膜组织中未发现人类细胞33因此，本研究使用这些小鼠（而非BLT小鼠）来探讨外源性性类固醇对阴道粘膜完整性和生殖器HIV传播的影响，由于NSG小鼠阴道粘膜上皮中没有HIV‐1靶细胞，因此外源性类固醇介导的影响对人类免疫细胞浸润或下生殖道功能产生的混淆可能性降至最低。

2.3. 外源性类固醇给药

hPBMC‐NSG小鼠皮下注射1 mg DMPA（Depo‐Provera^®; 法玛西亚和美国纽约州纽约市Upjohn Co.）进行粘膜通透性分析或启动HIV‐1传播研究前5天（图1a） ●●●●。该剂量可使小鼠的血清水平接近启动DMPA的女性的峰值血清浓度34如前所述，对小鼠进行ivag，给其注射市售E霜（Premarin^®; 惠氏制药公司（美国宾夕法尼亚州费城辉瑞公司的子公司）或其活性成分（辉瑞公司）在进行渗透性分析或开始传播研究之前的3天内每天服用一次（图1a） ●●●●。如前所述，处于发情周期发情阶段的未经处理的NSG小鼠为用于评估生殖器粘膜渗透性和完整性的实验提供了对照。

在单独的窗口中打开

图1

外源性DMPA或E不影响NSG小鼠的hPBMC植入。（a） 用于评估服用DMPA和E对NSG小鼠hPBMC植入、生殖器粘膜通透性和HIV-1敏感性的影响的研究设计示意图。为了确定DMPA和E对植入的影响，在hPBMC给药后14天和24天获取外周血（未经处理的NSG小鼠提供对照）。（b，c）流式细胞术研究未发现小鼠CD45百分比的组间差异⁺细胞和人CD45⁺CD3（CD3）⁺hPBMC给药后的细胞；左侧面板显示了具有代表性的等高线图；象限数表示人口百分比。数据来自每组3只动物的2个独立实验（bar表示平均值±SD）。使用单因素方差分析和Dunnett的多重比较检验进行统计分析。DMPA，仓库醋酸甲羟孕酮；E、 ivag雌激素霜；hPBMC‐NSG（hPBMC植入NOD‐scid‐IL‐2Rgc^无效的)老鼠。

2.4. HIV‐1感染

10⁶hPBMCs/ml用含有10%FBS、2 mM L-谷氨酰胺、1 mM丙酮酸钠、非必需氨基酸、50μM 2‐ME、100 U/ml青霉素、100μg/ml链霉素和50μg/ml庆大霉素（Mediatech，Manassas，VA，USA）的RPMI‐1640进行培养（后文称为完全培养基）。在含有5μg/ml植物血凝素（PHA）（Sigma‐Aldrich，St.Louis，MO，USA）的完整培养基中刺激细胞48小时。细胞离心，重新悬浮（2 x 10⁶细胞/ml），补充10 IU/ml重组人IL-2（rhIL-2）（PeproTech，Rocky Hill，NJ，USA），再培养5天。hPBMC接种600 TCID₅₀HIV-1 BaL3524小时，并重新悬浮在PBS（10⁸细胞/ml）体内感染（感染HIV-1的人PBMC培养物的一部分用于荧光素酶基因报告分析，以确认HIV-1感染性）。对于感染，用赛拉嗪和氯胺酮盐酸盐麻醉hPBMC‐NSG小鼠36和ivag接种10⁶（10μl）感染HIV‐1的huPBMC。10天后对小鼠实施安乐死，以评估HIV-1感染状况。值得注意的是，小鼠在hPBMC给药24天后被安乐死，而NSG小鼠的典型临床症状和移植物抗宿主病死亡率分别发生在hPBNC植入后25天和40天内37在安乐死时，血浆从血液中分离出来并储存在−80°C下。大约2/3的脾脏被转移到冷冻的完整培养基中，其余部分放置在4%的缓冲甲醛中24小时（美国伊利诺伊州罗克福德的Thermo Scientific）。将放置在培养基中的脾组织加工成单细胞悬浮液，并在完整培养基中培养（10⁶细胞/ml）补充rhIL‐2（每3天补充一次培养基）。8天后，将上清液与TZM-bl指示细胞孵育，以检测感染性HIV-1颗粒。在这些分析中，未感染小鼠的脾细胞提供了阴性对照，在完全培养基中稀释的HIV-1 BaL作为阳性对照。OSU临床实验室使用雅培的实时PCR检测（FDA批准的HIV RNA病毒载量检测）对血浆HIV‐1载量进行量化。我们研究中用于评估HIV感染状况的所有分析都是由不知道小鼠治疗组分配的研究人员进行的。

2.5. 粘膜渗透性测定

为了评估生殖器粘膜对低分子量（LMW）分子的渗透性，给镇静小鼠静脉注射10μl PBS溶液，该溶液含有70 kDa的德克萨斯红葡聚糖和路西法黄CH锂（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）。45分钟后对小鼠实施安乐死，并使用FV1000共焦光谱显微镜系统（美国宾夕法尼亚州中心山谷奥林巴斯）和ImageJ软件确定荧光分子渗入阴道组织24,38为了评估hPBMC进入阴道组织的情况，如上所述激活未感染的hPBMC。8天后，用5μM羧基荧光素琥珀酰酯（CellTrace CFSE；美国加利福尼亚州卡尔斯巴德市生命科技公司）标记细胞，并将其重新悬浮在PBS中（10⁸细胞/ml），并用10μl这种悬浮液接种小鼠ivag。15小时后，对小鼠实施安乐死，切除阴道，组织用甲醛固定，琼脂糖包埋，DAPI染色。使用共焦显微镜和ImageJ软件，利用CSFE标记的人外周血单个核细胞的荧光信号评估白细胞浸润阴道粘膜下组织的深度。通过连续扫描获得共焦图像，以防止荧光交叉。

2.6. DSG-1蛋白和HIV-1 p24抗原

为了评估桥粒糖蛋白-1（DSG‐1）蛋白的表达，将安乐死小鼠阴道组织切除后固定在缓冲甲醛中。如前所述，对DSG‐1表达进行量化24使用前面描述的方法，在去石蜡化和抗原提取、用5%牛血清白蛋白隔夜封闭、用兔单克隆抗CD45（EP322Y）和山羊多克隆抗HIV p24（ab53841）孵育后，在脾组织切片中确定HIV-1 p24蛋白表达（Abcam，Cambridge，MA，USA）24处理样品进行共焦显微镜分析，如上所述。

3.2. 外源性E阻止DMPA介导的生殖道粘膜屏障功能丧失

由于DMPA和E不影响NSG小鼠的hPBMC植入，因此我们探讨了这些化合物对生殖器粘膜屏障功能的影响。我们首先定义了DMPA和E对DSG-1阴道表达的影响，DSG-1是维持皮肤和肠上皮屏障功能所需的细胞细胞粘附分子39,40在早期对野生型小鼠的研究中，我们确定，系统性DMPA治疗显著降低了DSG‐1的阴道组织表达，而不影响生殖粘膜中表达的其他细胞-细胞粘附分子的水平，包括紧密连接蛋白1、克劳丁-1和闭塞蛋白24在当前研究中，我们测量了处于发情期且未经外源性类固醇治疗的hPBMC‐NSG小鼠阴道组织中DSG‐1蛋白的表达；DMPA处理；或服用DMPA和ivag E霜。为了排除E霜物理特性产生任何观察到的效果的可能性，其他hPBMC‐NSG小鼠接受DMPA注射并静脉注射E霜的药理活性成分（即纯E）。这些研究显示，未经治疗的对照小鼠和给予DMPA和雌激素（E霜或纯E）的hPBMC‐NSG小鼠中DSG‐1蛋白表达具有可比性，但仅给予DMPA的小鼠阴道组织中DSG­1表达显著降低（图2).

在单独的窗口中打开

图2

DMPA介导的阴道DSG‐1蛋白表达减少在给予DMPA的hPBMC‐NSG小鼠和E.hPBMC∙NSG鼠中被消除。hPBMC▪NSG老鼠未经治疗或接受DMPA、DMPA和ivag E乳膏或DMPA和ivag纯E治疗。如方法中所述，从安乐死小鼠的阴道组织中收集以量化DSG-1蛋白表达。（a） 阴道DSG‐1蛋白表达的代表性共焦显微镜图像；L（阴道腔）；DAPI（蓝色）；DSG‐1（绿色）；白线界定阴道粘膜上皮；比例尺表示100μm。（b） DSG‐1蛋白表达的量化显示，单独服用DMPA的hPBMC‐NSG小鼠的水平显著降低。每组3只动物的2个独立实验数据（bar表示平均值±SD）。使用单因素方差分析和Dunnett的多重比较检验进行统计分析。hPBMC‐NSG（hPBMC植入NOD‐scid‐IL‐2Rgc^无效的)小鼠；DMPA，仓库醋酸甲羟孕酮；E、 阴道雌激素霜；纯E，E霜的药理活性成分；DSG‐1，桥粒蛋白‐1。

在后续研究中，我们使用相同处理的小鼠组来描述全身给予DMPA和ivag E对LMW分子和活化的人类白细胞的阴道粘膜通透性的影响。与DMPA治疗的hPBMC‐NSG小鼠相比，这些研究发现，在未经治疗的小鼠和服用DMPA和ivag E或DMPA和纯E的hPBMC-NSG小鼠中，荧光LMW分子和白细胞的粘膜渗透性降低（图三). 因为我们在接受DMPA和E霜或纯E治疗的hPBMC‐NSG小鼠（与仅接受DMPA治疗的小鼠相比）中发现DSG‐1蛋白的阴道组织表达相似，LMW分子和活化的人类白细胞的阴道组织渗透性相对降低，这些研究还解决了E本身对加强生殖道粘膜屏障功能的作用。

在单独的窗口中打开

图3

DMPA和外源性E联合治疗可消除DMPA介导的阴道粘膜通透性增加。hPBMC‐NSG小鼠未经治疗或按图所示进行治疗2如方法所述，从安乐死小鼠的阴道组织中切除，以评估LMW分子或CFSE标记的hPBMC的通透性。（a，b）典型图像显示，与未经治疗的对照组或注射DMPA和ivag E的动物相比，注射DMPA的hPBMC‐NSG小鼠对LMW分子和活化人类白细胞的渗透性增加；比例尺表示100μm。（a） L（阴道腔）；DAPI（蓝色）路西法黄（绿色）；70 kDa德克萨斯红右旋糖酐（红色）和（b）L（阴道腔）；DAPI（蓝色）；CFSE标记的hPBMC（绿色）；白线划出阴道粘膜上皮。（c） 量化hPBMC渗入阴道粘膜下层组织的深度，发现在单独服用DMPA的小鼠中，hPBMC的渗入深度显著加深。显示的数据来自每组3只动物的2个独立实验（条形表示平均值±SD）。使用单因素方差分析和Dunnett的多重比较检验进行统计分析。hPBMC‐NSG（hPBMC植入NOD‐scid‐IL‐2Rgc^无效的)小鼠；DMPA，仓库醋酸甲羟孕酮；CFSE，羧基荧光素琥珀酰亚胺酯；E、 雌激素霜；纯E，E霜的药理活性成分。

我们感谢俄亥俄州中东南部地区美国红十字会和OSU的比较病理学和小鼠表型共享资源、校园显微镜和成像设备、临床微生物学和特殊功能实验室以及大学实验动物资源提供的支持。我们进一步感谢辉瑞公司（纽约州纽约市）通过其化合物转移计划提供试剂，以及NIH艾滋病试剂计划提供HIV-1Ba-L（苏珊娜·加特纳、米库拉斯·波波维奇和罗伯特·加洛）和TZM-bl（约翰·卡佩斯、吴晓云和Tranzyme公司）。