国际分子医学杂志。2017年5月；39(5): 1242–1254.
晚期糖基化终产物通过上调BAG3促进原代大鼠血管平滑肌细胞的增殖和迁移
,1,2 ,1 ,1 ,1 ,1 ,1 ,1和1
李存书
1中国医科大学第一医院心内科，辽宁沈阳110001
2中国辽宁省大连市第二人民医院心内科116000
叶昌
1中国医科大学第一医院心内科，辽宁沈阳110001
袁丽（音）
1中国医科大学第一医院心内科，辽宁沈阳110001
陈爽
1中国医科大学第一医院心内科，辽宁沈阳110001
陈银涛
1中国医科大学第一医院心内科，辽宁沈阳110001
宁业
1中国医科大学第一医院心内科，辽宁沈阳110001
冬雪代
1中国医科大学第一医院心内科，辽宁沈阳110001
孙应贤
1中国医科大学第一医院心内科，辽宁沈阳110001
1中国医科大学第一医院心内科，辽宁沈阳110001
2中国辽宁省大连市第二人民医院心内科116000
2016年11月22日收到；2017年3月24日接受。
摘要
本研究旨在探讨活性氧物种（ROS）在晚期糖基化终产物（AGE）诱导的血管平滑肌细胞（VSMC）增殖和迁移中的作用，以及Bcl-2相关阿坦基因3（BAG3）是否参与该过程。提取并培养原代大鼠VSMC在体外MTT法检测细胞活力，EdU掺入法检测细胞增殖。通过伤口愈合和Transwell分析检测细胞迁移。用qPCR和western blot分析检测BAG3。采用转录和翻译抑制剂（分别为放线菌素D和环己酰亚胺）研究AGEs对VSMC中BAG3表达的影响。将含有针对大鼠BAG3或对照shRNA的短发夹RNA（shRNA）的慢病毒质粒转导至VSMC。用2′，7′-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）染色检测细胞活性氧（ROS）。四甲基罗丹明甲酯（TMRE）染色检测线粒体膜电位。AGEs以剂量和时间依赖性的方式显著增加BAG3的表达。此外，AGEs主要通过增加RNA合成而不是抑制RNA翻译来增加BAG3 mRNA的表达。BAG3敲除降低AGEs诱导的VSMC增殖和迁移。BAG3基因敲除降低了ROS的生成，并维持了VSMC的线粒体膜电位。ROS产量减少N个-乙酰半胱氨酸（NAC）是一种有效的抗氧化剂，也能减少VSMCs的增殖和迁移。总的来说，本研究首次证明AGEs可以通过上调BAG3的表达来增加ROS的生成，并促进VSMC的增殖和迁移。本研究表明，BAG3应被视为预防和/或治疗糖尿病血管并发症的潜在靶点。
关键词：晚期糖基化终产物、血管平滑肌细胞、增殖、迁移、Bcl-2相关athanogene 3、氧化应激
介绍
血管平滑肌细胞（VSMC）是血管壁的主要细胞成分之一，主要负责调节血流分布和血压(1,2). 在生理条件下，VSMC保持极低的增殖率，但它们具有高度可塑性，可以从分化表型转化为去分化表型，作为对环境变化的适应性反应(2–4). 在表型调控过程中，血管平滑肌细胞的特点是增殖和迁移能力增强，细胞外基质蛋白沉积增加，这些共同会加速动脉粥样硬化、高血压和糖尿病血管并发症(5,6). 越来越多的研究表明，包括生长因子、细胞因子、有丝分裂原、细胞粘附、细胞间接触、机械影响、细胞外基质相互作用在内的多种因素可能控制VSMC的表型调制(7). 在糖尿病患者中，越来越多的证据表明晚期糖基化终产物（AGEs）的产生和积累在调节VSMC的增殖和迁移中起着重要作用(8–11)表明AGEs是各种血管疾病，尤其是糖尿病血管并发症的重要介质。
AGEs是由蛋白质、脂质或DNA中的糖和胺基团之间的缓慢非酶糖基化反应引起的，可在糖尿病患者中形成和积累(12). AGE的形成可以激活受体（RAGE），并进一步导致包括核因子-κB（NF-κB）在内的多种信号通路的异常激活(11)，丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）(12)和PI3K/AKT(13). 我们之前的研究还表明，AGEs可以通过减少VSMC中组织蛋白酶D来促进增殖和抑制自噬(14). 值得注意的是，通过增加活性氧（ROS）的产生，有几种途径参与氧化应激(14–17)表明氧化应激可能是AGEs诱导的VSMC增殖和迁移的重要因素。然而，潜在的机制如此复杂，仍有许多有待探索。
Bcl-2-associated athanogene 3（BAG3）是BAG家族的成员，在细胞凋亡、自噬、增殖、粘附、迁移和分化等多种细胞行为中起着重要作用(18–20). 正如先前的研究总结，BAG3的表达可能在多种人类原发性肿瘤中上调(21). 除心肌细胞和骨骼肌细胞外，正常组织很少表达BAG3，但其表达是在暴露于各种应激刺激后诱导的(22). 近年来，越来越多的证据表明，BAG3还与多种心血管疾病有关，如心肌肥厚、扩张型心肌病、Takotsubo心肌病和慢性心力衰竭(23–26). 迄今为止，BAG3在血管平滑肌细胞增殖和迁移中的作用尚未被探讨。
因此，本研究旨在探讨ROS在AGE诱导的血管平滑肌细胞增殖和迁移中的作用，以及BAG3是否参与这一过程。
材料和方法
道德声明
本研究中使用的动物按照NIH《实验动物护理和使用指南》进行治疗。程序符合中国医科大学动物实验委员会伦理标准（项目识别码SCXK-2013-0001）。
材料
实时聚合酶链反应（qPCR）系统购自Applied Biosystems（美国加利福尼亚州福斯特市）。Click-iT Nascent RNA Capture试剂盒购自Invitrogen（Carlsbad，CA，USA）。Western blot分析相关设备购自Invitrogen。EdU Alexa Fluor 555成像套件从Invitrogen购买。四甲基罗丹明甲酯（TMRE）购自Molecular Probes（尤金，俄勒冈州，美国）。2′，7′-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA），N个-乙酰半胱氨酸（NAC）、环己酰亚胺（CHX）和放线菌素D购自西格玛（美国密苏里州圣路易斯）。BSA和AGEs-BSA来自默克-密理博公司（德国达姆施塔特）。荧光显微镜（CKX41-F32FL）购自奥林巴斯（日本东京）。Microchemi 4.2购自DNR Bio-Imaging Systems，Ltd.（以色列耶路撒冷）。Transwell相关设备（8-µm pore）从BD Biosciences（美国新泽西州富兰克林湖）购买。微孔板阅读器购自Bio-Rad（Hercules，CA，USA）。BAG3（sc-292154）和3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH；sc-47724）的抗体购自Santa Cruz Biotechnology，Inc.（美国加利福尼亚州圣克鲁斯）。慢病毒载体购自GeneChem（中国上海）。
大鼠原代VSMC的分离培养
新生大鼠（1-2天大）通过颈椎脱位处死，用75%酒精消毒，然后移至干净的长椅上。切除胸主动脉，去除血管内外层。然后按照我们之前的研究所述分离初生大鼠VSMC(14). 在包括10%胎牛血清（FBS）和青霉素-链霉素（100 U/ml-100）在内的完整培养基中培养VSMCµg/ml），37°C，5%CO2以及之前描述的增湿大气(14,27). 媒体每隔一天更换一次。在原代细胞达到80-90%的融合后，将0.25%的胰蛋白酶加入培养板中进行消化。30秒后，使用含有血清的培养基终止消化。随后，将部分细胞移到新的培养皿中。细胞贴壁后，用完全培养基培养，即VSMC的第2代。使用这些方法，获得第2代至第8代之间的细胞，并将其用于下一个实验。
BAG3质粒的构建及细胞转染
BAG3质粒的构建由GeneChem完成。如前所述，用Lipofectamine 2000试剂（Invitrogen）转染细胞(28). 含有针对大鼠BAG3或对照shRNA的短发夹RNA（shRNA）的慢病毒质粒用绿色荧光蛋白（GFP）标记并用于击倒实验。有五种shRNA寡核苷酸对大鼠BAG3具有特异性，即shBAG3#1、#2、#3、#4和#5。对照shRNA和shBAG3#1、#2、#3、#4和#5的滴度为8×108, 4×108, 4×108, 3×108, 3×108和4×108TU/ml。将细胞接种到6孔培养板中，并在感染倍数（MOI）为100的情况下与载体上清液培养12 h，然后去除旧培养基并用含有10%FBS的DMEM替换。培养2天后，在荧光显微镜下观察细胞，并使用以下公式计算转导效率：转导效率=GFP+单元格/总单元格。消化后，转导细胞再培养2天。为了证实转导成功，分别用定量PCR（qPCR）和western blot分析BAG3的mRNA和蛋白表达水平。
蛋白质印迹分析
Western blot分析如我们之前的研究所述(14,29). 简单地说，将细胞溶解在放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解缓冲液中30分钟，然后使用BCA蛋白检测试剂盒（中国上海贝约泰）测量总蛋白浓度。热变性后，样品在12或14%三甘氨酸梯度凝胶上进行分析，然后转移到PVDF膜上，并在室温下用5%脱脂牛奶在三甘氨酸缓冲溶液（TBS）中封闭1.5小时。将膜与一级抗体在4°C下孵育过夜。用TBS冲洗三次后，在室温下用二级抗体培养膜1.5小时。洗涤步骤后，用增强化学发光（ECL）（Amersham Biosciences，Piscataway，NJ，USA）检测免疫反应结合。使用ImageJ 1.47软件量化带强度，GAPDH作为对照。
3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化铵（MTT）测定
MTT法测定细胞活力。VSMC以4×10的密度接种在96 well板中三细胞/孔。培养48 h后，将细胞与MTT溶液（最终浓度，5 mg/ml）在37°C下培养4 h。然后取下含有MTT的培养基，用100替换µl二甲基亚砜。然后在线性和轨道振动筛上轻轻旋转平板5分钟，以完全溶解沉淀。在570 nm波长下，用微孔板阅读器测量吸光度。细胞活力百分比根据以下公式计算：细胞活力（%）=治疗组的光密度（OD）/对照组的OD×100%。
教育部合并分析
如我们之前的研究所述(14,30)根据制造商的说明，通过使用Click-iT™EdU Alexa Fluor 555成像试剂盒进行EdU掺入分析，确定VSMC中的DNA合成速率。简单地说，细胞在37°C下用EdU标记溶液培养8小时，然后在室温下用4%冷甲醛固定30分钟。在用1%Triton X-100渗透后，细胞与Click-iT反应鸡尾酒（Invitrogen）反应30分钟。随后，细胞的DNA含量用Hoechst 33258染色30分钟。最后，用ImageJ 1.47软件对EdU标记的细胞进行计数，并归一化为Hoechst-染色的细胞总数。每个实验中至少有500个细胞被计数，EdU阳性细胞表示为总细胞的百分比。
伤口愈合试验
80–90%汇合处的细胞被200-µl移液管尖端，与BSA或AGEs孵育24小时。在显微镜下拍摄0和24小时划痕前缘的多个视图。实验独立进行三次。
Transwell迁移分析
对于Transwell迁移分析，细胞以2×10的密度接种6上部腔室中的细胞。下腔充满BSA或AGEs。培养24小时后，用棉签轻轻擦洗去除上腔细胞，固定下腔细胞并用Hoechst 33258染色。三个实验是独立进行的。通过滤镜的细胞在荧光显微镜下用紫外线拍摄。使用ImageJ 1.47软件对五个具有代表性的显微镜视野中的Hoechst标记细胞进行计数。
RNA提取和qPCR
使用Qiagen RNeasy Mini试剂盒提取总RNA。浓度测定后，进行cDNA合成。利用引物设计软件合成了每个片段的正、反义引物：BAG3正、5′-CATCCAGGAGTGAAAGTG-3′和反义引子5′-TCTGAACCG-3′；GAPDH正、5′-GCACGTCTGAAC-3′和反义引物5′-TGGTGAAGACGCAGGA-3′。使用7500 Real-Time-PCR系统运行qPCR并进行分析。结果与GAPDH的结果进行了标准化，并以任意单位表示。
新生RNA的标记和捕获
根据制造商的说明，使用Click-iT Nascent RNA捕获试剂盒检测新合成的RNA。5-乙基尿苷（EU）是一种炔修饰的尿苷类似物，可有效且自然地并入新生RNA中。细胞在0.2 mM EU中培养4 h，并使用Trizol试剂（Invitrogen）分离标记有EU的总RNA。然后将EU标记的RNA在具有0.5mM生物素叠氮化物的Click-iT反应缓冲液中进行生物素化，随后在链霉亲和素磁珠上捕获。
线粒体膜电位的测量
我们使用TMRE（Ex/Em，549/573 nm）检测线粒体膜电位的变化，如我们之前的研究所述(31). 简单地说，将未固定的活细胞与100 nM TMRE在黑暗中在37°C和5%CO中培养30分钟2清洗后，在荧光显微镜下对细胞进行分析。用ImageJ定量TMRE染色的荧光强度。
细胞内活性氧的测定
如我们之前的研究所述，使用DCFH-DA（Ex/Em，485/530 nm）方法测量细胞内ROS的形成(31). DCFH-DA经ROS氧化后转变为荧光化合物二氯荧光素（DCF）。简单地说，在37°C和5%CO中用最终浓度为5 mM的DCFH-DA培养细胞2在黑暗中放置40分钟。清洗后，在荧光显微镜下分析细胞。使用ImageJ对DCFH-DA染色的荧光强度进行定量。
统计分析
数据是从至少三个单独的实验中获得的。连续变量表示为平均值±SD，并通过单向方差分析或Student t检验进行测试。所有统计分析均使用Windows的SPSS统计数据（版本17.0；SPSS，芝加哥，伊利诺伊州，美国）进行，p值<0.05被认为具有统计学意义。
结果
AGEs增加原代大鼠VSMC BAG3的表达
用不同浓度的AGEs（25、50、100和200）处理细胞µg/ml）和BSA（2.5、5、10和20µg/ml）分别持续24小时。我们发现AGEs增加了BAG3 mRNA()和蛋白质()分别使用qPCR和western blot分析以剂量依赖性方式在VSMC中表达。接下来，我们研究转录和翻译抑制剂（分别为放线菌素D和CHX）是否可以调节AGEs对VSMC中BAG3表达的影响。qPCR结果表明，放线菌素D显著降低AGEs诱导的BAG3 mRNA表达，而CHX无影响()这表明AGEs主要通过增加RNA合成而不是抑制RNA翻译来增加BAG3 mRNA的表达。接下来，为了进一步支持这些观察结果，我们使用Click-iT Nascent RNA捕获试剂盒来分离新合成的RNA，评估了AGEs对BAG3 mRNA表达的影响。qPCR结果表明，AGEs在24小时显著增加了BAG3的mRNA合成，在浓度为100时的最大刺激效应µ克/毫升(). 然后，用acti-nomycin D和100培养细胞µg/ml AGEs或10µg/ml BSA，用于不同时间（0、1、2、4、8和24小时）。我们发现AGEs以时间依赖的方式增加BAG3新生mRNA的表达(). 因此，在下一个实验中，我们使用了剂量（100µg/ml AGEs/10µg/ml BSA）和时间（24小时）来确定AGE诱导VSMC增殖和迁移的分子机制。
晚期糖基化终产物（AGEs）增加培养的原代大鼠血管平滑肌细胞（VSMCs）中Bcl-2-相关athanogene 3（BAG3）的表达。用不同浓度的AGEs（25、50、100和200）处理细胞µg/ml）和BSA（2.5、5、10和20µg/ml）。分别通过（A）RT-PCR和（B）蛋白质印迹检测BAG3的mRNA和蛋白质表达水平。（C） 放线菌素D（10µg/ml），转录抑制剂和环己酰亚胺（CHX）（20µ采用翻译抑制剂g/ml）研究AGEs对BAG3 mRNA表达的影响。（D） 使用Click-iT新生RNA捕获试剂盒标记和分离新合成的RNA。（E）细胞与10µg/ml放线菌素D和100µg/ml AGEs或10µ分别在0、1、2、4、8和24 h内以g/ml牛血清白蛋白（BSA）处理，然后用RT-PCR检测BAG3的mRNA表达。实验重复三次，结果可重复。*与对照组相比p<0.05。
BAG3促进原代大鼠VSMC的增殖
为了进一步研究BAG3在VSMC增殖中的作用，我们产生了含有抗BAG3 shRNA（shBAG3）的慢病毒载体，以降低VSMC中BAG3的表达。GFP的测量+荧光显微镜下的细胞显示，慢病毒载体在100MOI下的转导效率为80-90%(). qPCR结果()和western blot分析()结果表明，两种shRNAs（shBAG3#3和shBAG3#5）分别显著降低了VSMC中BAG3的mRNA和蛋白表达。重要的是，MTT分析结果()和EdU染色()一致证明，BAG3的强制敲除显著降低了VSMC的细胞活力和增殖。
Bcl-2相关athanogene 3（BAG3）对原代大鼠血管平滑肌细胞（VSMC）增殖的影响。（A） 我们生成了含有针对BAG3（shBAG3）的shRNAs的慢病毒载体，以敲低VSMC中BAG3的表达。分别用（B）RT-PCR和（C）western blotting检测BAG3的mRNA和蛋白表达水平。*与对照组相比p<0.05。（D） 通过3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化铵（MTT）测定细胞活力。通过（E）EdU染色测定细胞增殖，（F）EdU掺入量计算为EdU+细胞/总细胞，通过ImageJ量化。实验重复三次，结果可重复。*与对照组相比p<0.05。
AGEs通过BAG3促进原代大鼠VSMC的增殖
为了研究BAG3在AGEs诱导的血管平滑肌细胞增殖中的潜在作用，用100µg/ml AGEs或10µg/ml BSA 24小时。MTT分析结果()和EdU染色()表明BAG3基因敲除可显著降低AGEs诱导的VSMC增殖。
晚期糖基化终产物（AGEs）通过Bcl-2-相关的athanogene 3（BAG3）促进原代大鼠血管平滑肌细胞（VSMC）的增殖。转染shRNAs抗BAG3（shBAG3）的VSMC用100µg/ml AGEs或10µ（A）通过MTT法测定细胞活力。（B） 通过EdU染色测定细胞增殖，EdU掺入量计算为EdU+细胞/总细胞，通过ImageJ量化。实验重复三次，结果可重复。*与对照组比较p<0.05；#与craft+AGEs组相比，p<0.05。
AGEs通过BAG3促进原代大鼠VSMC的迁移
细胞用100µg/ml AGEs或10µ伤后愈合试验表明，与对照组相比，AGEs显著增加了VSMC的迁移(). Transwell分析表明，AGE治疗组的侵袭细胞数量显著高于对照组(). 然后我们继续研究BAG3在VSMC迁移中的潜在作用。伤口愈合试验结果()和Transwell分析()证明BAG3基因敲除显著降低了VSMC的迁移。
高级糖基化终产物（AGEs）通过Bcl-2-相关无核基因3（BAG3）促进大鼠原代血管平滑肌细胞（VSMC）的迁移。VSMC接受100次治疗µg/ml AGEs或10µ（A）通过伤口愈合试验和（B）Transwell试验检测细胞迁移。（C） 迁移细胞通过ImageJ进行定量。然后通过（D）伤口愈合试验和（E）Transwell试验检测转染shRNAs抗BAG3（shBAG3）的VSMC的迁移。实验重复三次，结果可重复。*与对照组相比p<0.05。
BAG3基因敲除降低氧化应激并维持VSMC线粒体膜电位
DCHF-DA检测结果表明，BAG3基因敲除明显降低了VSMC中ROS的生成(). 活性氧主要来自线粒体中的线粒体呼吸链复合物(32). 然后我们研究了BAG3对线粒体的潜在影响。TMRE的结果表明，BAG3基因敲除逆转了AGEs引起的线粒体膜电位下降().
Bcl-2-相关athanogene 3（BAG3）对血管平滑肌细胞（VSMC）氧化应激和线粒体膜电位的影响。（A） 用2′，7′-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）（Ex/Em，485/530 nm）标记细胞，检测活性氧（ROS），并用荧光显微镜（比例尺，20µm） ●●●●。（B） DCFH-DA染色的荧光强度使用由加扰组归一化的ImageJ进行量化，*与打乱组相比p<0.05。（C） 线粒体用四甲基罗丹明甲酯（TMRE）（Ex/Em，549/573 nm）标记以检测线粒体膜电位，并用荧光显微镜（标尺，20µm） ●●●●。（D） 使用ImageJ量化TMRE染色的荧光强度，并通过打乱组进行标准化，*与打乱组相比p<0.05；#与scramb+晚期糖基化终产物（AGE）组相比，p<0.05。
AGEs通过氧化应激促进原代大鼠VSMC的增殖和迁移
活性氧，如超氧阴离子和过氧化氢，在调节血管平滑肌细胞的增殖和迁移中起着至关重要的作用。我们验证了AGEs对VSMC增殖和迁移的刺激作用涉及ROS生成的假设。接下来，我们使用NAC（一种有效的抗氧化剂）来研究氧化应激对VSMC的潜在影响。细胞与100µg/ml NAC和100µg/ml AGEs或10µDCFH-DA检测结果表明，NAC能完全阻止AGE刺激后细胞内ROS水平的产生(). 此外，EdU染色的结果()和MTT分析()一致证明NAC显著降低AGEs诱导的VSMC增殖。伤口愈合的结果()和Transwell分析()一致证明NAC显著减少AGEs诱导的VSMC迁移。总的来说，我们的结果表明细胞内ROS的生成在AGE诱导的VSMC增殖和迁移中具有重要作用。
晚期糖基化终产物（AGEs）通过氧化应激促进血管平滑肌细胞（VSMC）的增殖和迁移。细胞与100µ克/毫升N个-乙酰半胱氨酸（NAC）和100µg/ml AGEs或10µ用DCHF-DA法检测活性氧（ROS）。（B） 用ImageJ定量2′，7′-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）染色的荧光强度，并用打乱组归一化。（C和D）通过EdU分析检测细胞增殖。*p<0.05和#与BSA组相比，p<0.05。（E） 采用3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化铵（MTT）法检测细胞活力。用（F）伤口愈合试验和（G和H）Transwell试验检测细胞迁移。实验重复三次，结果可重复。*与BSA对照组相比p＜0.05。
讨论
本研究证实了BAG3在调节AGEs诱导的VSMC增殖和迁移中的新作用。我们发现AGEs通过上调BAG3的表达促进VSMC的增殖和迁移，其中ROS起着重要作用。
体内AGEs在高血糖环境和衰老过程中缓慢形成，并在糖尿病的各种微血管和大血管并发症中发挥作用(13). 越来越多的证据表明，AGEs促进血管平滑肌细胞的增殖和迁移，从而加速经皮冠状动脉介入治疗后的动脉粥样硬化和再狭窄(9,33,34). 我们的结果与之前的研究一致。AGEs及其受体RAGE之间的相互作用在AGEs诱导的细胞损伤中起重要作用。众所周知，血管功能障碍中的AGEs激活了RAGE的过度表达，导致细胞凋亡、氧化应激和炎症反应(35). 越来越多的证据表明，AGE-RAGE与正反馈回路的相互作用与VSMC的功能障碍有关(10,36–38). 之前的一项研究发现，100µg/ml AGEs通过RAGE/氧化应激途径增强血管钙化(38). 在血管钙化过程中，VSMCs的增殖和迁移起着至关重要的作用。在这些先前研究的基础上，本研究继续探索AGEs促进VSMCs增殖和迁移的机制。我们发现AGEs显著促进BAG3的表达，BAG3基因敲除降低AGEs诱导的VSMC的增殖和迁移。
BAG3在一系列细胞过程中发挥重要作用，包括细胞增殖、迁移、凋亡、自噬、粘附和细胞周期进展(18–20,39). 一些证据表明，BAG3在各种肿瘤中的表达升高，包括胶质母细胞瘤、急性淋巴细胞白血病和前列腺癌(40–42). 然而，除了心肌细胞和骨骼肌细胞外，正常组织很少表达BAG3(22). BAG3的表达可由多种刺激物诱导，如早期生长反应基因-1（Egr-1）(43)，热冲击系数-1（HSF-1）(44)，蛋白酶体抑制剂(45)重金属以及热应激(46,47). BAG3在正常组织中很少表达，但其表达是在各种应激刺激下诱导的，这似乎是一种保护机制(22). 以往的研究表明，BAG3参与了各种心血管疾病，如心肌肥厚、扩张型心肌病、Takotsubo心肌病和慢性心力衰竭(23–26). 然而，BAG3的表达与VSMC增殖和迁移的关系尚不清楚。
本研究首次发现经AGEs处理的VSMC中BAG3表达的动态变化，并证明shBAG3可以减少AGEs诱导的VSMC的增殖和迁移。据我们所知，目前关于AGE和BAG3的数据很少。然而，有理由推测未折叠蛋白反应（UPR）是一种主要的调节剂。内质网（ER）负责大约三分之一的细胞蛋白质的翻译后修饰、折叠和运输(48). 在生理条件下，ER可以在折叠和错误折叠的蛋白质之间保持平衡。然而，当未折叠/错误折叠的蛋白质积累损害内质网稳态时，内质网应激就会发生，这可能会进一步激活UPR(48). 总结如下(49)，AGEs在不同类型的细胞中诱导UPR，包括内皮细胞、神经元、胰腺细胞和足细胞，表明这种串扰是导致代谢性疾病的潜在病理机制。同时，BAG3作为一种分子伴侣，在蛋白质质量控制中起着重要作用，可以感知错误折叠的蛋白质并将其引导至蛋白质降解系统(50). 因此，BAG3的增加表达似乎可以防止极端刺激下的细胞死亡。然而，AGEs诱导VSMC中BAG3表达的确切机制值得进一步研究。
此外，我们的数据表明shBAG3减少了VSMC的增殖和迁移以及活性氧的产生；NAC减少ROS生成的同时也抑制了VSMC的增殖和迁移。这些结果表明，BAG3是活性氧的调节器。之前的研究(51)发现BAG3过表达显著降低了缺氧/复氧损伤后心肌细胞脂质过氧化产物MDA含量，但增加了SOD和GSH-Px活性（两种重要的抗氧化酶），这表明BAG3在减少心肌细胞ROS产生方面起着重要作用。这两项研究之间的差异表明，BAG3调节ROS的机制在不同的细胞类型中可能不同，这是由于不同的信号通路所致。在VSMC中，ROS主要由氧化呼吸过程中的NOX活性和线粒体呼吸电子传递链产生(32). 活性氧包括超氧阴离子、羟基自由基和过氧化氢，这是氧化应激的破坏特征(17). 先前的研究表明，ROS通过调节氧化还原敏感的转录和转导途径参与各种血管细胞信号传导(52). 此外，越来越多的证据表明ROS的积累在VSMC的增殖和迁移中起着重要作用(15–17). 因此，在糖尿病血管并发症的过程中，减少ROS的产生可能是一种有希望的治疗策略，可以防止血管平滑肌细胞的增殖和迁移。
总之，本研究首次证明AGEs通过上调BAG3的表达增加ROS的生成，促进VSMC的增殖和迁移。本研究表明，BAG3是预防和/或治疗糖尿病血管并发症的潜在靶点。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（81470417和81670231）的资助。
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