过氧化物酶体输入受体PEX19法尼基化对过氧化物酶膜蛋白识别的变构调节

法尼基识别的突变分析

根据法尼基化PEX19 CTD的结构，我们突变了形成法尼基结合囊的残基（螺旋α1中的M179R，螺旋α2中的I195K和螺旋α4中的M255R，图2c；补充表1)损害疏水性接触并评估特定蛋白质-脂质相互作用的功能重要性。¹H、，¹⁵N核磁共振相关谱(补充图4a)相应的PEX19-CTD变体的结果表明，所研究的所有突变蛋白都保持其结构完整性。虽然这些蛋白突变体是完全法尼基化的在体外与野生型蛋白质相比，法尼基的引入导致了不同的化学位移变化。M179R和I195K与野生型PEX19 CTD在非法尼基和法尼基状态下的化学位移差异主要涉及突变位点附近的残基，与替换相应残基引入的局部效应一致(补充图4b). 相反，M255R突变体具有显著且广泛的效应，表明PEX19 M255R突变体中法尼酰基的识别和构象发生了改变。为了探讨M255R突变是否导致法尼基部分被部分排除在结合腔之外，我们比较了{¹高}-¹⁵法尼基化后野生型和M255R PEX19 CTD的N异核NOE值。值得注意的是，虽然观察到螺旋核心结构域的类似值，但在M255R PEX19变体中，野生型PEX19的C末端残基法尼基化诱导的异核NOE值增加不太明显(补充图4c). 减少的NOE值表明C末端区域的灵活性增加。对于非法尼酰化蛋白，尾部没有变得完全柔性这一事实意味着在M255R PEX19 CTD变体中，法尼酰基团没有完全排除在空腔之外。在任何情况下，C末端区域的灵活性显著增加，这与减弱的蛋白-肉桂酰基相互作用一致，并表明M255R变体中的疏水性法尼基部分和/或暂时暴露。

为了进一步证明突变蛋白中法尼基的（部分）溶剂暴露，我们采用疏水相互作用色谱法。法尼基和非法尼基野生型和突变PEX19 CTD蛋白的表面疏水性差异被测定(图3a；补充图4d). 正如预期的那样，法尼基的引入通常会增加PEX19 CTD对野生型和突变体的疏水性。然而，对于所有PEX19 CTD变体，与法尼基化相关的疏水性变化显著较大，并且从M179R增加到I195K再增加到M255R。这与这些突变体中法尼基的暴露增加一致，可能是由于空间位阻和/或结合腔中引入的电荷所致。疏水相互作用色谱分析显示M255R取代的最显著影响与M255R变体中法尼基部分的显著暴露一致(图3a)。

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图3

影响法尼基识别的PEX19变体的功能和生化分析。

(一)疏水相互作用色谱分析。使用递减（NH）的线性梯度从丁基Sepharose FF柱中洗脱蛋白质₄)₂SO公司₄浓度。对于PEX19 CTD野生型和每个变体，法尼化蛋白与非法尼化形式相比表现出更大的洗脱体积(补充图4d). 该图显示了与野生型蛋白质（设置为1）相比，每个蛋白质的法尼基和非法尼基状态的疏水性的相对差异。(b条)PEX19变体对PEX19缺陷成纤维细胞的功能补充。通过编码全长PEX19变异体和eGFP-PTS1的双顺反子表达载体转染PEX19缺陷的成纤维细胞，将含有所示单氨基酸取代的PEX19导入PEX19缺失的纤维细胞。通过荧光显微镜监测模型过氧化物酶体蛋白转运底物eGFP-PTS1的定位（左栏）。采用免疫荧光显微镜（中柱）检测内源性PEX14作为过氧化物酶体膜蛋白。点状染色模式和eGFP-PTS1和PEX14的共同定位表明功能性过氧化物酶体蛋白转运（合并，右栏）。为了更好地进行比较，上部面板中显示了PEX19缺陷细胞仅表达来自载体的eGFP-PTS1。比例尺：10μm。右侧所示的名称是指GFP本地化。(c（c）)Δ的定量分析PEX19型-单个PEX19变异体的表型互补。通过分析三个独立转染实验中的至少100个细胞获得值。所示数据代表平均值±标准差(d日)法尼基化突变体的免疫印迹分析表明，所有变体均在野生型水平表达，除C296S（箭头）外，均为法尼基体内（箭头）。

接下来，我们研究了法尼基化对PEX19功能活性的作用。我们用表达PEX19变体和eGFP SKL作为过氧化物酶体靶向信号1（PTS1）标记的双顺反子载体转染PEX19缺陷细胞。PEX19缺陷的成纤维细胞的特征是缺乏进口活性过氧化物酶体，这表现为过氧化物酶基质标记物对细胞质的定位错误以及过氧化物质体膜标记物PEX14对线粒体的定位错误²³eGFP-SKL和PEX14的重叠点状模式表明了进口活性过氧化物酶体的互补性和再现性。在人类补体试验中，比较了全长野生型和PEX19变异体及其突变对法尼基相互作用的影响ΔPEX19成纤维细胞。然而，野生型PEX19将过氧化物酶体蛋白转运恢复到60%，在PEX19 C296S中功能互补性降低到46%，在PEX19 I195K中进一步降低到23%。M179R和M255R突变不能挽救ΔPEX19表型(图3b，c). 如免疫印迹分析所示，野生型和突变型蛋白质的表达量相似，并且是法尼基化的体内-C296S变体除外，该变体缺乏法尼基化位点(图3d). 互补效率的统计分析表明，在缺乏法尼基化（C296S）的情况下，过氧化物酶体蛋白输入部分受损。影响法尼基识别和PMP货物结合（I195K，M179R）的突变强烈损害过氧化物酶体的形成。值得注意的是，在PEX19突变体（M255R）中没有观察到过氧化物酶体生物发生的挽救，该突变体干扰分子内法尼基识别，即使该残基远离PMP结合表面。我们还考虑了PEX19 CTD突变体的互补缺陷可能是由于法尼基部分的暴露导致疏水性增加而导致定位改变引起的。为此，免疫荧光显微镜显示，导入缺陷与PEX19与过氧化物酶体的强相关性或与任何其他膜结合亚细胞隔室的定位错误无关(补充图5)。

体外法尼基化

体外法尼基化分析按所述进行^29,30在50 mM Tris–HCl、pH 8.0、20 mM KCl、5 mM MgCl中₂，10μM氯化锌₂和10 mM二硫苏糖醇。将10 ml与100μM PEX19的反应体积与130μM法尼基焦磷酸（Sigma-Aldrich）和250 nM法尼烷基转移酶在37°C下孵育1 h。随后的Ni²⁺亲和层析（镍-硝基三乙酸）去除FTase。在HiLoad 16/60 Superdex 75（GE Healthcare）上通过尺寸排除色谱进一步纯化法尼基化PEX19，并将其储存在20 mM磷酸钾中，pH 6.5和50 mM NaCl。通过SDS凝胶电泳和¹H、，¹⁵N HSQC核磁共振波谱。

核磁共振波谱

在298 K的温度下，使用带有TCI防冻头的Bruker Avance III 600-MHz光谱仪、带有TXI探针头的Avance III 750-MHz光谱机或带有TXI-防冻头的Avance 900仪器获得核磁共振谱。使用NMRPipe处理光谱³¹和Sparky一起分析³².主干分配是使用MARS半自动完成的³³根据HNCA、HNCACB、CBCA（CO）NH、H（C）CH-TOCSY和（H）CCH-TOCSY光谱获得主干和侧链分配³⁴。¹³C-和¹⁵记录了混合时间为70 ms的N编辑NOESY光谱，以导出距离约束。对于PEX19和法尼基之间的NOE，使用特定同位素标记样品获得同位素编辑和过滤的3D NOESY光谱（70和100 ms混合时间）。¹⁵N个R（右）₁,R（右）₂松弛速率和{¹高}-¹⁵在Avance III 750 MHz光谱仪上记录了N个异核NOE³⁵。局部相关时间由¹⁵N个R（右）₂/R（右）₁比率³⁵为了测定溶剂顺磁弛豫增强速率，将钆-二乙烯-三胺-五乙酸-双甲基酰胺（Gd（DTPA-BMA））滴定至蛋白质样品^36,37,38.饱和度恢复¹H、，¹⁵在0、1、2、3、5、7和10 mM Gd（DTPA-BMA）的浓度下，记录了N个恢复时间为0.01至3 s的HSQC实验。根据方程式，峰值强度拟合为指数恢复函数I（τ）=I₀−Aexp（−R（右）₁τ)，其中τ是恢复延迟，I（τ）是针对恢复延迟测量的峰值强度τ,我₀是最大峰值强度，R（右）₁是纵向质子弛豫速率，A是信号振幅。为了获得sPRE值，质子R（右）₁收集所有Gd测量浓度的速率（DTPA-BMA）c（c）_对位以及方程的线性回归R（右）₁ （c）_对位)=米_sPRE公司 c（c）_对位+执行了，其中R（右）₁ （c）_对位)是质子R（右）₁在浓度下测量c（c）_对位顺磁性化合物的斜率米_sPRE公司对应于sPRE和是合适的质子R（右）₁在没有顺磁性化合物的情况下³⁶为了进行核磁共振滴定，将ALDP肽（序列：AAKAGMNRVFLQRLL，人类ALDP的残基62-76）溶解到核磁共振缓冲液中的浓度为5 mM，并添加到¹⁵N标记的PEX19 CTD，在同一缓冲液中具有或不具有法尼基化，蛋白-肽摩尔比为1:10。

结构计算

使用CYANA 3.0自动进行NOE交叉峰分配和结构计算，并进行扭角动力学，然后进行手动检查³⁹使用Dundee PRODRG2服务器对法尼基半胱氨酸进行参数化⁴⁰使用从PRODRG2服务器导出的PDB坐标手动准备CYANA库，并定义了所有可旋转的二面角。异戊二烯双键的二面角固定为反式根据我们的核磁共振分析，将脂质定义为（2E类,6E类)-法尼醇。对于最后一个类异戊二烯单元，甲基根据其碳化学位移进行立体定向分配。14号是反式甲基，因为它有一个上升场¹³C化学位移与发现的频率范围相同¹³C化学位移反式甲基4和10（～20 p.p.m.）。15号是顺式基于向下场的甲基¹³C化学位移（～28 p.p.m.）。法尼烷基原子编号请参见补充图2a。在结构计算期间，未施加法尼基-芳基约束。使用CYANA的内部校准函数将蛋白质-蛋白质和蛋白质-法尼酰NOE峰值强度转换为距离上限。明确的距离约束源自CYANA，主干二面角约束源自TALOS⁺（参考。⁴¹)和剩余偶极耦合约束用于使用CNS进行水净化（参考。⁴²). 对于水精炼，参数和拓扑文件取自PRODRG2服务器，立体化学与CYANA中的相同。所有结构都通过iCing验证(http://nmr.cmbi.ru.nl/结冰/). 用PyMol（Schrödinger）生成分子图像。

分子间NOE

基于初始¹³C编辑，¹³C、，¹⁵N过滤NOESY实验，我们能够识别与ALDP肽苯丙氨酸环接触的脯氨酸和甲基的亚甲基。芳香族频率可以明确地指定给ALDP肽，因为它们是唯一的。ALDP甲基频率也观察到强烈的NOE(补充图8a)但由于ALDP肽中含有大量甲基残基，因此无法明确指定。然而，这些NOE证实了PMP配体中涉及芳香残基和甲基的许多接触与法尼基PEX19建立了一种特殊的络合物。由于与未标记同位素的法尼基残基重叠，因此不可能将NOE分配给其他ALDP残基。为了提高灵敏度和减少光谱重叠，PEX19 CTD均匀²H、，¹³C、，¹⁵N-标记，Leu和Val甲基除外。使用以下方法测量PEX19 CTD与未标记ALDP肽结合的复合物的分子间NOE¹³C编辑的NOESY实验³⁴从这些实验中，下午≈0.9时的质子化学位移明确地归属于Leu182或Leu183(补充图8a)。

停靠计算

根据NMR滴定和NOESY实验，对配合物PEX19 CTD-ALDP进行了模糊和明确的限制。HADDOCK对接服务器的专家界面²⁵用于执行对接计算。法尼基化PEX19 CTD的NMR结构和ALDP肽的螺旋片段（残基68-76:NRVFLQRLL）分别用作第一和第二分子。将CSP>0.05 p.p.m.的PEX19残基（Leu172、Met175、Ser177、Asn181、Leu182、Leu 183、Ser184、Lys185、Y189、L192）和ALDP肽中的Phe71用作活性残基，将6.5º以内的残基作为被动残基处理。在迭代0、1和水精炼期间，分别计算了2000、400和400个结构。最小群集大小设置为10。模糊距离约束由ω导出₁-过滤/Ω₂-编辑NOESY实验，涉及PEX19 Leu182或Leu183的甲基质子和Pro273或Pro274的亚甲基质子到Phe71的ALDP芳香质子。

微型热泳分析

将N末端荧光标记肽LALKLRLQVLLLARV（对应于人类PEX11B（肽专业实验室股份有限公司，海德堡）的186–200残基）溶解至200 nM浓度于20 mM磷酸钾、pH 6.5、50 mM氯化钠、20%甲醇和0.1%吐温中。对于野生型PEX19 CTD，在相同的缓冲液中连续稀释未标记的具有或不具有法尼基化的PEX19 CTD，使其浓度从612μM到18 nM。将等量的蛋白质和肽溶液彻底混合，并在15000下离心克持续5分钟。将上清液转移到微尺度热电泳分析（MST）毛细管中，并使用纳米温度单体NT 0.15T进行测量。使用PEX19 CTD野生型三次单独测量的归一化荧光值来确定离解常数。

荧光偏振

ALDP肽（62-AAKAGMNRVFLQRLL-76）N端与异硫氰酸荧光素（FITC）融合，购自肽专业实验室股份有限公司。将冻干粉末溶解在1 ml水中，形成5 mM储备溶液。隔夜透析含有50 mM Tris pH 8.0，50 mM NaCl的缓冲液，去除三氟乙酸盐反离子。对于每个结合曲线的测定，使用恒定浓度的20 nM标记肽和不断增加的PEX19 CTD变体浓度进行12点滴定。PEX19 CTD的起始浓度为1 mM，12个系列稀释液达到0.5μM。然后将反应混合物转移到96孔中Optiplate公司并在PerkinElmer EnVision平板读取器中测量为三倍。

疏水相互作用色谱法

将纯化的PEX19 CTD和变体调整为含有650 mM（NH）的缓冲液₄)₂SO公司₄将500μg蛋白质置于平衡的丁基Sepharose FF柱（20 mM磷酸钾，pH 6.5，50 mM氯化钠和650 mM（NH₄)₂SO公司₄). 洗涤后，结合蛋白以线性下降（NH）洗脱₄)₂SO公司₄浓度（650–0 mM（NH₄)₂SO公司₄，20毫升）。使用280 nm吸收检测洗脱蛋白。结合强度由洗脱体积表示，并与蛋白质疏水性相关。

成纤维细胞过氧化物酶体蛋白导入检测

编码eGFP-PTS1和非标记PEX14（pMF1220）的双顺反子表达质粒⁴³由Marc Fransen（比利时鲁汶）提供。pIRES2-HsPEX19-eGFP-PTS1是通过将PEX14的开放阅读框（BglII/SalI）替换为DNA盒来构建的，DNA盒编码来自pAH05的BamHI/SalI消化的人类PEX19的全长开放阅读框。⁴⁴). 使用引物对，通过Quickchange XL定点突变试剂盒（Stratagene）将单点突变引入PEX19序列(补充表1). 编码PEX19变异体和eGFP-PTS1的双顺反子表达载体被转染到人细胞系ΔPEX19 T中，该细胞系来源于PEX19缺陷的Zellweger患者成纤维细胞²¹以过氧化物酶体生物生成缺陷为特征的ΔPEX19 T细胞通过如下所述的功能互补分析进行常规鉴定，并使用Venor GeM Advance Mycoplasm Detection Kit（Minerva Biolabs）检查支原体污染。根据Amaxa Cell Line Nucleofector Kit R协议（Lonza Cologne AG），转染效率始终在90%左右。转染72小时后，使用抗人PEX14的多克隆抗血清对细胞进行荧光和免疫荧光显微镜检查（参考文献。⁴⁵)（1:400稀释）或抗人PEX19的单克隆抗体（BD Biosciences，MA5-17266 Thermo Scientific；1:400稀释的）。对每个pIRES-PEX19-eGFP-PTS1表达质粒的三个独立转染进行统计分析。根据eGFP-PTS1荧光模式的出现，每个实验中大约100个细胞被直观地分为三类，（i）点状染色模式显示的过氧化物酶体输入的完全互补，（ii）用少量点的弥散细胞溶质染色显示的部分互补，（iii）没有互补作用，只导致细胞溶质染色。所有显微照片均记录在带有蔡司Plan-Apochromat×63/1.4油物镜和Axiocam MR数字相机的蔡司Axioplan 2显微镜上，并使用AxioVision 4.6软件（德国耶拿蔡司）进行处理。使用抗HsPEX19的单克隆小鼠抗体（BD Biosciences，MA5-17266；1:1000稀释），通过免疫印迹分析评估PEX19表达的稳态水平(补充图9)。

我们感谢A.Itzen和H.Kooshapur（TU München）对手稿的批判性阅读；S.Holton、N.Schüller、C.Williams、K.Fodor（汉堡EMBL Hamburg）提供表达质粒、材料和讨论，N.Raschke（慕尼黑大学）、E.Becker和J.Wolf（波鸿大学）提供样品制备和实验帮助。我们感谢J.Boisbouvier，IBS Grenoble捐赠立体选择性甲基标记前体；S.Duhr和S.Blanke（NanoTemper Technologies GmbH，慕尼黑）提供支持，H.Waldmann（MPI Dortmund）提供自旋标签前体。我们感谢巴伐利亚核磁共振中心（BNMRZ）的核磁共振测量时间。这项工作得到了德国联邦科学院（SFB594，FOR1905 to M.S.，ER178/4-1 to E.R.）和欧盟FP7 NMI3项目（M.S.）的支持。美国承认Elitenetzwerk拜仁的支持；捷克共和国教育、青年和体育部K.T.，项目CEITEC 2020（LQ1601）；T.M.来自EMBO长期奖学金、奥地利科学基金会（FWF）的Schrödinger奖学金、澳大利亚科学院（Austrian Academy of Sciences）的APART-Fellowship以及巴伐利亚分子生物系统研究网络框架内的巴伐利亚科学、研究和艺术部。资助者在研究设计中没有任何角色，数据收集和分析、决定出版或准备手稿。