RNA干扰阻断TRIM25通过TGF-β信号抑制胃癌细胞的迁移和侵袭

GC细胞中TRIM25的敲除

调查TRIM25功能在体外，我们检测了6个GC细胞系中TRIM25的表达。如所示图1D选择TRIM25在mRNA和蛋白水平均较高表达的MGC-803和AGS，研究TRIM25的功能。将两个特异于TRIM25的siRNA（siTRIM25-1和siTRIM256-2）和一个阴性对照siRNA（siNC）转染到MGC-803和AGS细胞中，随后通过免疫印迹和qRT-PCR分析测定TRIM25水平。如所示图2A、B，这两种siRNAs均有效抑制TRIM25的表达，并选择效率更高的siTRIM25-1进行进一步检测。

在单独的窗口中打开

图2

在GC细胞中，通过siRNA转染抑制TRIM25的表达。

TRIM25在MGC-803中的表达(A类)和AGS细胞(B类)通过qRT-PCR（左面板）和免疫印迹（中面板和右面板）进行分析。WT：野生型细胞；siNC：干扰siRNA-转染细胞；siTRIM25-1、siTRIM256-2:TRIM25-siRNA-1或TRIM25-siRNA-2转染细胞(*P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01).

TRIM25 siRNA对GC细胞增殖的影响

然后通过CCK-8分析评估细胞增殖。有趣的是，转染siTRIM25-1的细胞与转染siNC的细胞和野生型对照（WT）细胞具有相似的增殖率(图3A,P（P） < 0.05），表明TRIM25对GC细胞增殖无影响。

在单独的窗口中打开

图3

TRIM25表达减少抑制GC细胞的迁移和侵袭。

(A类)CCK-8法检测MGC-803和AGS细胞增殖。(B类)用无三角包被的transwell室检测经TRIM25 siRNA-1或对照siRNA处理的MGC-803和AGS细胞的迁移。(C类)用基质包被的跨阱室评估TRIM25 siRNA-1或对照siRNA处理的MGC-803和AGS细胞的侵袭能力。比例尺：100μm。WT：野生型细胞；siNC：干扰siRNA-转染细胞；siTRIM25-1:TRIM25-siRNA-1转染细胞(***P（P） < 0.01）。

TRIM25 siRNA对胃癌细胞转移的影响

为了确定TRIM25-siRNA是否能够影响肿瘤细胞转移，通过跨阱分析在MGC-803和转染siTRIM25-1或siNC的AGS细胞中测定细胞迁移和侵袭能力。与对照组（WT和siNC）相比，转染TRIM25 siRNA后MGC-803和AGS细胞的迁移分别减少了47.0%和39.0%(图3B). 类似地，TRIM25 siRNA转染的细胞在MGC-803和AGS细胞中均表现出抑制侵袭性。侵袭性分别下降了61.7%和37.3%(图3C).

GC中TRIM25相关通路的研究

为了鉴定GC中的TRIM25相关途径，利用TCGA STAD数据集的数据进行了基因集富集分析（GESA）。如所示图4A迁移、E-cadherin和TGF-β信号通路与TRIM25表达密切相关。

在单独的窗口中打开

图4

TRIM25表达影响迁移、E-cadherin和TGF-β信号通路。

(A类)使用TCGA数据集执行GSEA。TRIM25的高表达与迁移、E-cadherin和TGF-β信号通路密切相关。(B、 C类)用TRIM25 siRNA-1或对照siRNA转染MGC-803和AGS细胞48 h后，通过免疫印迹法检测上述三种通路相关基因的表达(D、 E类)转染后6 h通过免疫印迹法评估Smad2和Smad4的磷酸化。WT：野生型细胞；siNC：干扰siRNA-转染细胞；siTRIM25-1:TRIM25-siRNA-1转染细胞(*P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01, ***P（P） < 0.001).

然后，我们分析了在转染siTRIM25或siRNA对照后48小时，MGC-803和AGS细胞中迁移（基质金属蛋白酶[MMMP]-2和MMP-9）、E-钙粘蛋白（E-钙粘蛋白、β-catenin和纤连蛋白1[FN1]）和TGF-β信号传导（TGF-β1和骨形态发生蛋白[BBM]-4）途径相关蛋白的表达。如所示图4B、CTRIM25 siRNA处理导致MMP-2、MMP-9、β-catenin、FN1、TGF-β1和BMP-4的表达显著降低，E-cadherin的表达显著增加。这些结果进一步验证了GSEA数据。

小干扰RNA（siRNAs）、质粒和细胞转染

靶向TRIM25（siTRIM25-1，5′-GGGAUGAGUUCGAGUUUCUUUU-3′；siTRIM256-2，5′-GGCUCAACACUUGAUAUAU-3′）和干扰siRNA（siNC）的siRNA购自Genepharm Technologies（中国上海）。Genewiz公司（中国上海）将人TRIM25 CDNA克隆到pcDNA3表达载体（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）中。pcDNA3表达载体作为阴性对照（NC）。根据制造商的方案，通过使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）进行所有转染。

RNA提取、cDNA合成和实时定量PCR

使用TRizol试剂（Invitrogen）从组织样本或细胞中分离出总RNA，并根据制造商的协议（美国马里兰州汉诺威Fermentas）将其反向转录到cDNA。定量实时PCR（qRT-PCR）是使用ABI 7300实时PCR机器（加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司）和SYBR Green PCR试剂盒（美国伊利诺伊州罗克福德赛默飞世尔科学公司）进行的。用2-（ΔCt）方法计算基因（TRIM25和GAPDH）的相对表达。此处列出了使用的引物（TRIM25正向，5′-GTCTCACCAGAAACAGTTCC-3′；TRIM25反向，5′-ATCAACAGCTGATTCC-3’；GAPDH-forward，5′-CACACTCTCCACCTTG-3′；GAPDH反向，5’-CACACCCTGCTGTGTGTAG-3′）。

免疫印迹和抗体

用新鲜添加的蛋白酶抑制剂（Sigma-Aldrich，St Louis，MO，USA）在冰镇RIPA裂解缓冲液（1%NP40，0.5%Na-deoxycolic acid和PBS中0.1%SDS）中裂解细胞。用SDS-PAGE分离含有等量蛋白质的全细胞裂解物，并转移到聚偏二氟乙烯膜上（Millipore，Bredford，MA，USA）。用5%脱脂牛奶封闭膜，然后在4°C下与一级抗体孵育过夜。根据制造商的说明，使用适当的二级抗体在室温下观察膜1小时，然后使用增强化学发光（ECL）系统（皮尔斯，罗克福德，伊利诺伊州，美国）。免疫印迹信号的强度通过Image J软件（美国国立卫生研究院）的密度计进行定量。所有实验至少重复三次。主要抗体来源如下：TRIM25、转化生长因子（TGF）-β1、骨形态发生蛋白（BMP）-4、纤维连接蛋白1（FN1）、基质金属蛋白酶（MMP）-2和MMP-9，Abcam（美国马萨诸塞州剑桥）；E-cadherin、β-catenin、p-Smad2、p-Smad4、Smad2，Smad4和GAPDH，细胞信号技术（丹弗斯，马萨诸塞州，美国）。辣根过氧化物酶结合二级抗体购自Beyotime（中国上海）。

细胞生长分析

将MGC-803和AGS细胞置于6孔板中，培养24 h，然后转染siNC或siTRIM25-1。48小时后，将细胞接种到96个平板上，并使用CCK-8（日本熊本Dojindo实验室）在0、24、48和72小时测定细胞增殖。在指定的时间点，细胞在37°C的正常培养基中的CCK-8溶液中培养1小时。用设置为450 nM的微孔板读卡器测量每个孔的吸光度。所有实验均一式三份。

迁移和侵袭试验

将siNC、siTRIM25-1、TRIM25表达质粒或对照质粒（NC）转染12孔板上的MGC-803和AGS细胞。迁移试验，转染后48小时，1×10⁵将无血清培养基中的细胞添加到transwell插入物的上腔（8m孔径；康宁Costar，美国纽约州纽约市）。为了进行入侵检测，使用Matrigel涂层膜将细胞添加到上腔（BD Bioscience，Franklin Lakes，NJ，USA）。对于转染TRIM25表达质粒或NC的细胞，如图所示，向上腔添加DMSO或10μM TGF-β抑制剂SB431542（Sigma-Aldrich）。将含有20%FBS的培养基添加到下室。24小时后，没有通过毛孔迁移或侵入的细胞被棉签完全清除。迁移或侵入的细胞用4%多聚甲醛固定，用0.2%结晶紫染色，显微镜下计数。

生物信息学分析

基因表达数据在癌症基因组图谱网站（TCGA，https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/)用于胃腺癌（STAD）项目。为了通过TRIM25探索GC发病的生物途径，如前所述进行了基因集富集分析（GSEA）²¹.

本研究得到上海市卫生和计划生育委员会科研项目（20124321）的资助。