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生理学代表。2014年1月1日；2（1）：e00199。
2014年1月13日在线发布。 数字对象标识：10.1002/物理2.199
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1‐NAME‐和血管紧张素II诱导高血压的TRPV4缺陷小鼠的血压和内皮功能特征

西岛义森, 郑晓东, 海利·隆德, 马克托·铃木, 大卫·L·马特森,和大卫·X·张
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摘要

瞬时受体电位香草醛4型（TRPV4）是一种内皮细胞钙2+导管和阻力动脉中有助于内皮介导扩张的进入通道。我们研究了TRPV4在高血压条件下调节血压和内皮功能的作用。TRPV4缺乏（TRPV4−/−)和野生型（WT）对照小鼠在饮用水中给予l-NAME（0.5 g/l）7天，或皮下输注血管紧张素（Ang）II（600纳克/千克/分钟）14天，并通过无线电遥测测量血压。TRPV4型−/−小鼠的基线平均动脉压（MAP）较低（12小时日间MAP，94±2 vs.WT对照组99±2 mmHg）。l‐NAME治疗导致TRPV4的MAP略微增加−/−小鼠（第7天，13±4%）与WT对照组（6±2%）相比，但血管紧张素II诱导的MAP增加与TRPV4相似−/−和WT小鼠（第14天，分别为53±6%和37±11%，P（P）< 0.05). 慢性输注Ang II的WT小鼠可减少乙酰胆碱（ACh）诱导的扩张（扩张至10−5mol/L ACh，71±5%对92±2%）和TRPV4激动剂GSK1016790A诱导的肠系膜小动脉扩张（10−8mol/L GSK1016790A，14±5%对77±7%的对照）。然而，Ang II治疗并不影响TRPV4的ACh扩张−/−老鼠。从机制上讲，血管紧张素II并没有显著改变肠系膜动脉中TRPV4总蛋白的表达或TRPV4激动剂诱导的Ca2+肠系膜内皮细胞原位反应。这些结果表明，TRPV4通道在l‐NAME诱导的高血压中的血压调节作用较小，但在Ang II诱导的内皮功能障碍中可能起重要作用。

关键词：内皮、内皮衍生的超极化因子、高血压、肠系膜动脉、一氧化氮、TRPV4

我们研究了瞬时受体电位香草醛4型（TRPV4）在正常条件下调节体内血管张力和应对高血压挑战中的作用。我们的结果表明，TRPV4通道可能在压力下血管张力和内皮功能的控制中发挥复杂的作用。

介绍

内皮细胞通过释放一些血管扩张因子调节血管张力，包括一氧化氮（NO）、前列环素（PGI）2)和内皮衍生超极化因子（EDHFs）（Edwards等人。2010). 各种受体激动剂，如乙酰胆碱（ACh）和缓激肽，以及机械力（如剪切应力），增加内皮细胞内钙2+浓度（[Ca2+]我)（尼利乌斯和德罗格曼斯2001)随后导致内皮血管舒张因子的合成和释放。内皮细胞[Ca增加2+]我还激活中、小电导钙2+激活的钾通道（IK钙和SK钙)导致内皮依赖性超极化（EDH）。这种超极化可以通过肌内皮缝隙连接直接传递到心肌细胞，诱导血管舒张。此外，K+通过内皮细胞K流出的离子钙通道可以通过激活平滑肌诱导心肌细胞超极化和松弛，向内纠正钾+（K）红外)通道和Na+/K（K）+ATP酶（Edwards等人。2010).

越来越多的证据表明，瞬时受体电位（TRP）香草醛4（V4）是TRP超家族的成员，是一种内皮细胞钙2+进入通道参与NO和/或EDH介导的血管舒张反应，以响应几个啮齿动物导管和阻力动脉中的流量和受体激动剂（Köhler等人。2006; Hartmannsgruber等人。2007; Loot等人。2008; Earley等人。2009; Zhang等人。2009; Mendoza等人。2010; Adapala等人。2011; Rath等人。2012; Sonkusare等人。2012; Ma等人。2013). TRPV4通道也在人冠状动脉（HCA）的内皮细胞中表达，并有助于冠状动脉疾病（CAD）患者冠状动脉的血流诱导扩张（Bubolz等人。2012; Zheng等人。2013). 值得注意的是，流动诱导的HCA扩张是由活性氧物种（ROS）介导的，即过氧化氢（H2哦2)在出现疾病时，这是一种显著的EDHF（Miura等人。2003; Liu等人。2011; Zhang等人。2012). 尽管TRPV4介导的血管扩张在体外孤立动脉中具有良好的特征，但TRPV4在体内调节血管张力中的功能作用仍不完全清楚。输注TRPV4激动剂导致麻醉小鼠和大鼠低血压（Willette等人。2008; Gao等人。2009; Zhang等人。2009; 高和王2010); 然而，口服活性TRPV4拮抗剂在7天的药物治疗中并未影响平均动脉压（MAP）或心率（HR）（Thorneloe等人。2012). 此外，在TRPV4缺陷型（TRPV4−/−)小鼠和另一个敲除品系中MAP降低的趋势（Willette等人。2008; Earley等人。2009; Zhang等人。2009). 这些研究表明，TRPV4在血压的基础控制中可能没有发挥重要作用。TRPV4是否有助于在应激条件下调节体内血管张力尚待确定。

本研究旨在利用意识TRPV4进一步探讨TRPV4在血压调节中的作用−/−小鼠接受了两种不同的高血压挑战，包括N个G公司硝基精氨酸甲酯（l‐NAME）、一氧化氮合酶（NOS）抑制剂和血管紧张素（Ang）II（Ribeiro等人。1992; Rajagopalan等人。1996; 马特森1998; Jung等人。2003). 有证据表明，TRPV4与EDHF介导的小阻力动脉扩张更密切相关（Köhler等人。2006; Earley等人。2009; Zhang等人。2009; Mendoza等人。2010; Rath等人。2012; Sonkusare等人。2012)EDHF可能是心血管疾病或危险因素（Félétou和Vanhoutte2004). 由于Ang II通过ROS介导的机制降低了血管NO的生物利用度，损害了内皮依赖性舒张，这种内皮功能障碍与各种血管疾病有关（Rajagopalan等人。1996; 图伊兹和希夫林2000; Jung等人。2003; 加里多和格林德林2009)，我们还研究了TRPV4在血管紧张素II诱导的内皮介导的舒张损伤中的潜在作用。

方法

动物

共有55只雄性野生型（WT）C57BL/6J和32只雄性TRPV4基因敲除（TRPV4）−/−)（铃木等人。2003)本研究使用3-4个月龄的小鼠。小鼠被安置在我们的动物设施中，昼夜循环12/12小时，可以随意获得食物和水。这项研究得到了机构审查委员会的批准。所有实验均按照机构动物护理和使用委员会指南进行。使用以下引物通过聚合酶链反应（PCR）进行基因分型：TRPV4（正向5′-TGT TCG GGG TGG TTT GGC CAG GAT AT‐3′和反向5′-GCT GAA CCA AAG GAC ACT TGC ATA G‐3’；WT中796 bp产物，TRPV4中无信号−/−)和淘汰新霉素盒（正向5′-GCT GCA TAC GCT TGA TCC GGC TAC‐3′反向5′-TAA AGC ACG AGG AAG CGG TCA GCC‐3'；TRPV4中366 bp的产物−/−).

血压测量

WT和TRPV4−/−用戊巴比妥钠（50mg/kg，i.p.）麻醉小鼠，并根据需要给予补充麻醉。使用无菌技术，将无线遥测设备（型号TA11PA‐C10；Data Sciences International，St.Paul，MN）的导管尖端插入左颈动脉，并将遥测仪的身体植入动物背部的皮下。在手术和麻醉恢复期间，将动物置于37–38°C的加热垫上。术后服用抗生素（头孢唑林，25mg/kg，皮下注射）和止痛药（卡普洛芬，5mg/kg，静脉注射）。让小鼠从植入中恢复7天，然后测量动态MAP和HR。以500 Hz的频率每分钟收集10秒的数据，并在12小时光照、12小时黑暗和24小时周期内平均收集数据。在药物治疗前3天记录基线参数。将l‐NAME添加到饮用水（0.5 g/l）中7天，然后进行3天的清洗期。对于Ang II诱导的高血压，用2%异氟烷麻醉小鼠，并在动物的肩胛中部前部皮下植入渗透微型泵（微渗透泵模型1002；Alzet，Cupertino，CA）。血管紧张素II以每分钟600纳克/千克的输注速度输送14天。一些小鼠接受生理盐水作为假手术对照。在体内研究结束时，用戊巴比妥（100 mg/kg，i.p.）对动物实施安乐死，并解剖肠系膜动脉以检测血管反应性、钙2+成像和蛋白质表达实验。

视频显微镜

用于测量WT和TRPV4中的血管反应性−/−小鼠，一级或二级分支（100–200μm） 用两个玻璃微移液管从肠系膜上动脉插管，以连续视频显微镜测量直径，如前所述（Mendoza等人。2010). 在无流量条件下，将血管加压至60 mmHg的壁内压力，并在37°C的Krebs生理盐水溶液（PSS）中用21%O气体平衡1 h2和5%CO2用U‐46619（10–100 nmol/L）对血管进行预限制，使内径约为基线内径的30–50%。收缩达到稳定状态后，对ACh（10−9–10−5摩尔/升），GSK1016790A（10−9–10−7mol/L），一种选择性TRPV4激动剂，或硝普钠（SNP；10−10–10−5用L‐NAME（100）治疗30分钟前后测定mol/L）μ摩尔/升）。为了研究平滑肌超极化在ACh诱导的扩张中的作用，在存在L‐NAME的情况下，用高K（60 mmol/L）Krebs预狭窄动脉。每次实验结束时，罂粟碱（10−4mol/L），一种内皮非依赖性血管扩张剂，添加到血管浴中，以确定扩张剂反应正常化的最大扩张。血管舒张反应表示为相对于U‐46619收缩的最大舒张百分比，100%表示最大直径的完全舒张。

蛋白质印迹

肠系膜小动脉（100-200μm） 解剖脂肪和结缔组织，并在添加蛋白酶抑制剂鸡尾酒（德国曼海姆罗氏）的冰冷裂解缓冲液（50 mmol/L Tris‐HCl[pH7.40]、150 mmol/L-NaCl、0.5%Nonide P‐40、1%脱氧胆酸、0.1%十二烷基硫酸钠[SDS]）中均质，并在1000℃下离心克在4°C下保持10分钟（Mendoza等人。2010). 蛋白质浓度是通过使用BCA（双茚二酸）蛋白质检测试剂盒（伊利诺伊州罗克福德的Thermo Scientific）测定的。蛋白质样品（10μg） 在10%凝胶上通过SDS‐PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）分离，并转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。在室温下用10%的牛奶或BSA封闭膜3小时，并在4°C下用适当的抗体培养过夜，包括抗-TRPV4抗体（ACC‐034；Alomone Labs，Jerusalem，Israel）或抗-TRPV抗体β隔离血管的肌动蛋白（A5441，克隆AC‐15；密苏里州圣路易斯Sigma‐Aldrich）抗体（含2%牛奶的Tween‐20[TBST]三缓冲盐水中的1:700和含2%BSA的TBST中的1:40000），或抗涡轮绿荧光蛋白（tGFP）抗体（含有2%牛奶的TBST的1:15000，AB513；俄罗斯莫斯科埃夫罗根）TRPV4转染内皮细胞（Zheng等人。2013). 在添加山羊抗兔或山羊抗鼠二级抗体（对于TRPV4和GFP，在含有2%牛奶的TBST中为1:10000；β‐肌动蛋白，在TBST中1:20000，含5%BSA），在室温下保持2小时。使用ECL Plus试剂开发膜（Amersham，GE Healthcare，Pittsburgh，PA）。一些膜在剥离缓冲溶液（伊利诺伊州罗克福德的Thermo Scientific）中剥离，并用抗eNOS抗体（在含2%牛奶的TBST中为1:1000；猫号9572S；马萨诸塞州丹佛市的Cell Signaling Technology）进行重制，然后用山羊抗兔抗体（在含有2%牛奶的TPST中为1:2000）进行重造。

细胞表面蛋白分离

根据制造商的协议，从Lonza（Walkersville，MD）获得人冠状动脉内皮细胞（HCAECs），并将其保存在全生长培养基（Lonza-EGM-2MV）中。为了检测Ang II对TRPV4细胞表面蛋白表达的影响，用编码人类TRPV4‐GFP融合蛋白的重组慢病毒转导第6代细胞（Zheng等人。2013). 转导后的一天，将细胞接种到60毫米或100毫米的培养皿上，并生长到90–95%的汇合处，再培养2–3天。然后，将细胞与Ang II（500 nmol/L）在全生长培养基中孵育1或24小时。根据制造商的说明，使用Pierce的细胞表面蛋白分离试剂盒从HCAEC中分离质膜蛋白，并稍作修改。简言之，用冰冷的磷酸盐缓冲盐水（PBS，Invitrogen，Grand Island，NY）清洗细胞两次，并在4°C下在含有0.25 mg/mL磺基琥珀酰亚胺-2-（生物胺基）乙基-1,3-二硫代丙酸盐（磺基-NHS-SS-生物素）的PBS中培养，轻轻摇晃。培养30分钟后，添加淬火溶液以停止生物素化反应。用冰镇Tris缓冲盐水（TBS）洗涤细胞三次，然后在添加蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液（50 mmol/L Tris‐HCl[pH7.40]、150 mmol/L-NaCl、0.5%Nonide P‐40、1%脱氧胆酸和0.1%SDS）中进行裂解。细胞裂解物在12000℃离心克在4°C下保持10分钟，取澄清的上清液，并用BCA法（Thermo Scientific）测定蛋白质浓度。为了分离生物素化的蛋白质，蛋白质样品（200μg） 与50混合μL NeutraAvidin琼脂糖珠（以50%浆料提供），并在4°C下旋转3小时。免疫沉淀蛋白通过5000℃离心收集克2分钟，用补充有蛋白酶抑制剂的洗涤缓冲液洗涤4-5次，然后用100洗脱μ通过在95°C下加热5分钟，用50 mmol/L二硫苏糖醇（DTT）制成L的1×Laemmli样品缓冲液（Bio-Rad，Hercules，CA）。洗脱的蛋白质（7μ五十、 相当于15μg总蛋白）和总蛋白裂解物（7μg） 如前所述，通过Western blotting进行分析。

[Ca的测量2+]我

内皮细胞[Ca2+]我如我们之前所述，使用fura‐2 AM在HCAEC中测量（Mendoza et al。2010; Zheng等人。2013). HCAEC被镀到35毫米的玻璃底培养皿上，并生长到60-70%的汇合处。细胞负载呋喃-2AM（5μ摩尔/升；Molecular Probes，Grand Island，NY）在改良的Hanks平衡盐溶液（HBSS）中室温下放置30–60分钟，该溶液含有（mmol/L）：123 NaCl，5.4 KCl，1.6 CaCl2，0.5氯化镁2，0.4 MgSO4，4.2氯化钠三，0.3 NaH2人事军官4，0.4千赫2人事军官45.5葡萄糖和20 HEPES（pH 7.4，NaOH）。使用图像系统捕获和分析荧光图像，该图像系统包括带20×荧光物镜的倒置荧光显微镜（尼康TE200，纽约州梅尔维尔）、高速波长切换器（加利福尼亚州诺瓦托Sutter Instrument Company的Lambda DG‐4）、PC控制的数字CCD相机（新泽西州布里奇沃特市哈马松C4742‐95）、，和Metafluor软件（Molecular Devices，Sunnyvale，CA）。在510 nm的发射波长下，每隔3秒连续记录20–30分钟的荧光，在340和380 nm处交替激发。结果显示为340 nm与380 nm激发时的荧光强度之比（F340/F类380). 为了检测Ang II对内皮TRPV4功能的影响，用Ang II（500 nmol/L的全生长培养基）预处理HCAECs 1或24 h，然后测量Ca2+对TRPV4激动剂4α‐PDD的反应（3μ摩尔/升）。内皮细胞[Ca2+]我还使用我们之前描述的改进方法在新鲜分离的肠系膜动脉中进行了原位测量（Zhang等人。2009; Mendoza等人。2010). 沿着其纵轴切开动脉段，并将其固定在Sylgard涂层盘上，管腔侧朝上。用fura‐2 AM（10μmol/L）在室温下搅拌60分钟，然后加入Ca2+如上所述，在Krebs‐PSS中进行分析。除非另有说明，否则实验在37°C下进行。

材料和解决方案

U46619来自开曼化学公司（密歇根州安阿伯）。GSK1016790A由葛兰素史克制药公司提供。所有其他化学品均购自Sigma‐Aldrich。除U46619（乙醇）、GSK1016790A（二甲基亚砜[DMSO]）、4α‐PDD（DMSO）和吲哚美辛（0.2 mol/L Na）外，储备溶液在蒸馏水中制备2一氧化碳三).

统计分析

所有数据均以平均值±SEM表示n个表示动物、血管或实验重复的数量。对于放松研究，pEC50进行了计算。pEC公司50表示最大松弛度的一半的松弛剂浓度的负对数（−logEC50); 这些值直接由单个对数浓度-响应曲线确定。使用双向重复测量方差分析（ANOVA）对隔离血管的放射遥测结果和浓度-反应曲线进行比较，然后在显示显著性时进行Holm–Sidak事后检验。对于其他实验，平均值之间的显著差异通过配对或不配对进行评估t吨测试，或单向方差分析，然后进行Holm–Sidak多重比较测试（如适用）。所有程序均使用第12版SigmaPlot中提供的统计分析程序执行。P（P）数值<0.05被认为具有统计学意义。

结果

l‐NAME诱导的WT和TRPV4高血压−/−

TRPV4的基线MAP（白天12小时）略低−/−（WT对照组为94±2 vs.99±2 mmHg；n个=分别为15和13；P（P）=0.047），但TRPV4的基线心率相似−/−和WT小鼠（分别为525±12和526±8 bpm）。这些结果与我们之前的研究一致，研究显示TRPV4有降低血压的趋势−/−使用尾袖血压测量的小鼠和使用颈动脉导管的麻醉小鼠（Mizuno等人。2003; Zhang等人。2009).

接下来，我们研究了在NO介导的扩张减少的条件下，TRPV4是否有助于血压调节。给WT和TRPV4注射NOS抑制剂l‐NAME−/−小鼠(n个=6个/组），饮用水（0.5 g/L）连续7天。l‐NAME在TRPV4中的消耗量相似−/−和WT小鼠（2.2±0.1 vs.2.3±0.2 mg/天）。l‐NAME给药后第2天，12小时日间MAP达到最高点，然后逐渐降低至最大增加值的35–50%，直至洗脱期（图。​（图1A）。1A） ●●●●。l‐NAME后各组的MAP值相似（第7天，TRPV4的110±2 mmHg−/−WT为108±2 mmHg）。然而，TRPV4中MAP的增加百分比略高−/−（图。​（图1B；1B；第7天，WT组为13±4%vs.6±2%，P（P）<0.05). l‐NAME治疗后，两组的HR均降低，但TRPV4的降低幅度明显较小−/−鼠标（图。​（图1C）。1C） ●●●●。TRPV4的HR降低百分比也较小−/−小鼠，但这并没有达到统计显著性（图。​（图1D）。1D） ●●●●。l‐NAME退出后1天，MAP和HR均恢复到近似基线值。

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野生型（WT）和TRPV4的平均动脉压（MAP）和心率（HR）−/−一氧化氮合酶抑制剂治疗小鼠N个G公司硝基精氨酸甲酯（l‐NAME）。l‐NAME（0.5 g/l）在饮用水中服用7天。通过无线遥测记录动态MAP和HR。结果显示为MAP（A）和HR（C）的12小时日间平均值，以及MAP（B）与HR（D）相对于基线值的百分比变化。n个每组6只动物*P（P）与WT小鼠相比<0.05。BL或B，基线；l、 l‐名称；W、 冲刷。

血管紧张素II诱导的WT和TRPV4高血压−/−

为了进一步测试当NO功能降低时TRPV4在血压调节中的作用，我们长期注射WT和TRPV4−/−小鼠(n个=6个/组），使用皮下渗透微型泵（600 ng/kg/min，持续14天）。先前的研究表明，Ang II增加了血管ROS的生成，从而降低了NO的生物利用度和内皮依赖性舒张（Rajagopalan等人。1996; 图伊兹和希夫林2000; Jung等人。2003; 加里多和格林德林2009). 注入Ang II后，两组12小时日间MAP逐渐增加（图。​（图2A）。2A） ●●●●。血管紧张素II诱导的MAP增加与TRPV4相似−/−（第14天140±5毫米汞柱）和WT（130±8毫米汞柱）小鼠。在TRPV4中，MAP的增加百分比趋向于更高（但没有统计显著性）−/−（图。​（图2B；2B类；第14天，53±6%），与WT小鼠（37±11%）相比。TRPV4对Ang II输注的HR反应相似−/−鼠标和WT控件（图。​（图2C2C和D）。与基线值相比，第14天接受生理盐水作为假手术对照的小鼠的MAP和HR没有变化（数据未显示）。

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野生型（WT）和TRPV4的平均动脉压（MAP）和心率（HR）−/−用血管紧张素II治疗的小鼠。通过皮下渗透微型泵向动物慢性注射血管紧张素II（600 ng/kg/min），持续14天。通过无线遥测记录动态MAP和HR。结果显示为MAP（A）和HR（C）的12小时日间平均值，以及MAP（B）与HR（D）相对于基线值的百分比变化。n个每组6只动物。BL或B，基线。

WT和TRPV4中的内皮依赖性舒张−/−用Ang II治疗

为了确定TRPV4在血管紧张素II诱导的内皮功能障碍中的潜在作用，从WT和TRPV4中分离出肠系膜小动脉−/−将Ang II（600 ng/kg/min）慢性注入小鼠14天，并检测其对ACh（一种内皮依赖性血管扩张剂）的血管扩张反应。在未经治疗的WT小鼠的动脉中，ACh以浓度依赖的方式诱导了有效的扩张（最大扩张为10−5摩尔/升，92±2%，n个=9；图。​图3A）。三A） ●●●●。慢性Ang II治疗导致浓度-反应曲线下移（在10−5摩尔/升，71±5%，n个=7,P（P）<0.05与未处理）。pEC50对照组和Ang II治疗的WT动物的值没有显著差异（分别为6.4±0.3和6.2±0.2）。被动式直径无显著差异（179±8μ未治疗组为m，187±4μ或U46619诱导的收缩（收缩百分比，未治疗组为41±2%，Ang II治疗组为45±2%）。正如我们之前报告的那样，使用了相同的敲除鼠系（Zhang等人。2009)，ACh诱导的扩张在TRPV4中向下移动−/−鼠标（图。​（图3B）三B） 与WT控制相比（图。​（图3A），三A） ，最大膨胀为10−569±9%的摩尔/升(n个=5,P（P）<0.05（与WT控制相比）。令人惊讶的是，Ang II的慢性治疗并不影响TRPV4中ACh的扩张−/−小鼠（10时扩张−5摩尔/升，72±4%，n个=5). pEC50对照组和Ang II治疗的TRPV4的值相似−/−动物（分别为6.2±0.2和6.3±0.1）。被动式直径无显著差异（189±8μ未治疗组为m，187±4μ或U46619诱导的收缩（收缩百分比，未治疗组为40±3%，Ang II治疗组为42±2%）。GSK1016790A是一种有效的TRPV4激动剂和内皮依赖性血管扩张剂（Willette等人。2008; Mendoza等人。2010)在Ang II治疗的WT小鼠中也显著降低（在10−8mol/L，未治疗组为14±5%vs.77±7%，n个=7,P（P）<0.05; 图。​图3C）。三C） ●●●●。GSK1016790A没有扩张TRPV4的肠系膜动脉−/−鼠标（图。​（图3D），三D） ，证实该化合物对TRPV4通道的特异性。总之，这些结果表明TRPV4参与了血管紧张素Ⅱ诱导的内皮依赖性血管舒张功能受损。

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血管紧张素II对乙酰胆碱和TRPV4激动剂诱导的野生型（WT）及TRPV4肠系膜小动脉扩张的影响−/−老鼠。动物被长期注射血管紧张素II（每分钟600纳克/千克）14天。对未经治疗（对照组）和经血管紧张素II（Ang II）治疗的WT（A）和TRPV4分离的U‐46619预狭窄动脉进行血管舒张剂对乙酰胆碱（一种内皮依赖性血管舒张剂）的反应−/−（B） 老鼠。在同一未经治疗和Ang II治疗的WT（C）和TRPV4的平行动脉中检测血管舒张因子对选择性TRPV4激动剂GSK1016790A的反应−/−（D） 老鼠。n个=每组5-9只动物*P（P）与对照组相比<0.05。

接下来，我们确定了受Ang II输注影响的主要血管舒张因子（NO vs.EDHFs）。在未经治疗的WT小鼠的U46619预狭窄肠系膜动脉中，l‐NAME显著抑制了ACh诱导的扩张，这种作用在ACh浓度较低（可能更生理）时更为明显（Kawada等人。1985; Shinoe等人。2005)（膨胀为10−7mol/L，对照组为11±4%vs.41±6%，n个=5,P（P）< 0.05; 图。​图4A），4A） ，证实了先前的结果，即NO是该隔离血管制剂中的主要血管扩张因子（Chataigneau等人。1999; Zhang等人。2009). 本研究未检测l-NAME和环氧合酶抑制剂吲哚美辛的作用，因为我们之前的研究发现，l-NAME与吲哚美欣联合使用不会进一步减少ACh诱导的扩张（Zhang等人。2009). l‐NAME和高K的联合作用消除了ACh诱导的扩张，表明EDHF介导了剩余的扩张（图。​（图4A）。4A） ●●●●。与未经处理的WT小鼠相比（图。​（图4A），4A） 慢性Ang II输注后，血管舒张的l‐NAME敏感成分显著降低，尤其是在低浓度ACh（舒张10−7mol/L，存在时为4±2%，不存在L‐NAME时为15±2%，n个=5; 图。​图4B），4B） ，表明NO的减少主要是导致ACh的扩张受损的原因。NO供体SNP引起的内皮非依赖性舒张反应（10−10–10−5mol/L）在未治疗组和Ang II治疗组中相似（图。​（图4C4C和D），表明Ang II不影响NO敏感性。

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血管紧张素II对野生型小鼠肠系膜小动脉内皮和平滑肌介导的扩张的影响。动物被长期注射血管紧张素II（每分钟600纳克/千克）14天。在没有或存在l‐NAME（100）的情况下，乙酰胆碱诱导的扩张μ在未经治疗（A）和血管紧张素II（Ang II）治疗（B）小鼠的离体动脉中检测mol/L）或L‐NAME加高K（60 mmol/L）。在没有或存在l-NAME和吲哚美辛（Indo，10）的情况下，对平滑肌松弛剂硝普钠（SNP）的血管舒张作用μmol/L），在相同的未治疗（C）和Ang II治疗（D）小鼠的平行动脉中进行检测。n个每组5只动物*P（P）与对照组相比<0.05。#P（P）<0.05与l‐NAME。

血管紧张素II诱导的内皮功能障碍中TRPV4的表达和活性

为了确定Ang II是否通过降低TRPV4的表达而损害内皮依赖性舒张，我们检测了未经治疗和Ang II治疗的动物新鲜分离的肠系膜动脉中TRPV4蛋白的表达。Ang II对TRPV4的总细胞蛋白表达水平没有显著影响（图。​（图5A），5A） 也没有改变eNOS的蛋白表达（图。​（图5B）。5B） ●●●●。鉴于Ang II对TRPV4通道的蛋白表达几乎没有影响，我们接下来测试Ang II诱导的内皮功能障碍是否与TRPV4通路活性降低有关。TRPV4介导的钙2+在有或无Ang II输注的WT小鼠新鲜分离的肠系膜动脉原位内皮细胞中检测反应。如所示图6TRPV4激动剂GSK1016790A（10和30 nmol/L）诱导快速浓度依赖性[Ca2+]我未经治疗的动物内皮细胞增加，F的δ变化340/F类380分别为0.13±0.02和0.28±0.01。与TRPV4蛋白表达类似，GSK1016790A诱导Ca2+Ang II治疗没有改变反应（ΔF340/F类380对10和30 nmol/L的响应分别为0.13±0.06和0.32±0.09；n个=4–5).

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野生型（WT）和TRPV4肠系膜小动脉中TRPV4和内皮一氧化氮合酶（eNOS）的蛋白表达−/−用血管紧张素II（Ang II）治疗的小鼠。动物被长期注射血管紧张素II（每分钟600纳克/千克）14天。分离肠系膜动脉并通过Western blotting检测TRPV4（A）和eNOS（B）蛋白的表达。左侧为代表性斑点；右侧，汇总数据（标准化为β肌动蛋白加载控制）。n个=每个治疗组6-9只动物。

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TRPV4介导的钙2+用或不用血管紧张素II治疗的野生型小鼠肠系膜动脉内皮细胞原位反应。动物被长期注射血管紧张素II（每分钟600纳克/千克）14天。新鲜分离肠系膜动脉，内皮细胞负载呋喃‐2 AM以获取细胞内钙2+成像。（A） 内皮细胞钙的代表性图像2+未经治疗和Ang II治疗的小鼠对TRPV4特异性激动剂GSK1016790A（10和30 nmol/L）的反应。（B） 内皮细胞钙的代表性痕迹2+未经治疗和Ang II治疗小鼠对GSK1016790A的反应。黑线表示340 nm与380 nm激发时荧光强度的平均比值（F340/F380），灰色区域表示一个标准偏差。（C） 内皮细胞[Ca的汇总数据2+]我增加。数据表示每组4-5只动物的平均±SEM，每个血管分析20-30个内皮细胞。

我们使用培养的内皮细胞进一步研究了Ang II对细胞表面蛋白表达和TRPV4通道功能的影响。在孤立的肠系膜小动脉和天然内皮细胞中很难检测到细胞表面TRPV4通道，因为它们在质膜上的丰度很低，因此hTRPV4过度表达HCAECs（Zheng等人。2013)用于这些实验。如所示图7A、 Ang II治疗（500 nmol/L持续1或24小时）并没有改变HCAECs中总TRPV4或细胞表面TRPV4的表达。相反，TRPV4激动剂4α‐PDD（3μmol/L）诱导的[Ca2+]我用Ang II（F340/F类380比率，1.0±0.1 vs.1.9±0.2；图7B） ●●●●。Ang II治疗1 h后，4α-PDD诱导的反应轻微减弱（但无统计学意义）。Ang II还抑制GSK1016790A诱导的Ca2+未转染HCAEC中的反应（未显示数据）。

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血管紧张素II（Ang II）对TRPV4蛋白表达和TRPV4介导的Ca的影响2+内皮细胞的反应。（A） 用Ang II（500 nmol/L）孵育1或24 h后，hTRPV4过度表达的人冠状动脉内皮细胞（HCAECs）中TRPV4总蛋白和细胞表面蛋白表达的Western blot分析（i），代表性blot；（ii），汇总数据（标准化为β肌动蛋白代表总蛋白）的3个独立实验。（B） 呋喃‐2钙2+TRPV4介导钙的测定2+对TRPV4激动剂4α‐PDD的反应（3μmol/L）处理1或24小时。数据代表在三个独立实验中分析的≥60个细胞的平均值±SEM*P（P）与对照组相比<0.05。T、 总蛋白；S、 表面蛋白质。

讨论

本研究旨在了解内皮TRPV4通道在高血压挑战下调节血压和内皮功能的作用。本研究的主要发现如下：（1）l‐NAME而非Ang II在TRPV4中诱导了稍大的高血压反应−/−小鼠与WT对照组相比，尽管TRPV4−/−基础条件下小鼠MAP较低；（2） 用Ang II慢性治疗WT小鼠可减少ACh和TRPV4激动剂诱导的肠系膜小动脉扩张，但令人惊讶的是，Ang II治疗并未影响TRPV4的ACh扩张−/−老鼠；（3） 从机制上讲，血管紧张素II并没有显著改变肠系膜动脉中TRPV4总蛋白的表达或TRPV4激动剂诱导的Ca2+肠系膜内皮细胞原位反应。在培养的内皮细胞中，Ang II处理对TRPV4的细胞表面定位没有影响，但减弱了TRPV4介导的Ca2+响应。总之，这些数据表明TRPV4在l‐NAME诱导的高血压中具有轻微的保护作用。相反，TRPV4似乎对血管紧张素II诱导的高血压的血压调节没有贡献，但可能在血管紧张素Ⅱ诱导的内皮功能障碍中起重要作用。

动物模型和人类的研究表明，内皮功能障碍（或内皮依赖性扩张减少）与高血压之间存在着密切的联系，尽管内皮功能障碍是高血压的原因还是影响仍不清楚（Dharmashankar和Widlansky2010; 库尤米和帕特尔2010). 通过测量TRPV4激动剂诱导的降压效应和高血压大鼠模型中TRPV4蛋白表达的变化，Gao等人(2009)高和王(2010)提供了血管TRPV4蛋白表达和功能改变可能与盐诱导高血压相关的证据。Earley及其同事使用基因敲除模型和尾袖法测量血压，发现NOS被抑制后血压稍高N个ωTRPV4中的硝基精氨酸−/−将小鼠与WT对照组进行比较（Earley等人。2009)因此，提示内皮TRPV4通道可能是NOS抑制剂诱导高血压的后备保护机制。在本研究中，我们测量了另一条TRPV4线的24小时血压反应−/−小鼠接受了两种不同的高血压挑战。与之前的结果一致（Earley等人。2009)在TRPV4中，口服l‐NAME（另一种NOS抑制剂）后MAP增加的百分比更大−/−动物。然而，在TRPV4中，对Ang II输注的MAP反应不明显−/−小鼠与WT对照组相比，这可能部分是由于Ang II治疗的WT对照中TRPV4功能受损(图3). TRPV4功能的丧失是否发生于和/或导致人类某些类型的高血压，尚待确定。除了内皮介导的舒张作用外，TRPV4参与体内血压调节的其他潜在机制尚待阐明。例如，在TRPV4中，l‐NAME诱导的HR降低较少−/−提示TRPV4通道可能参与压力反射反应的调节。

NO和/或EDHF介导的内皮细胞介导的舒张功能受损经常在各种病理生理条件下或在冠心病、糖尿病和高血压（Félétou和Vanhoutte）等疾病中观察到2004; Vanhoutte等人。2009). 作为血管疾病的一个重要决定因素，血管紧张素II增加了血管活性氧的生成并减少了NO介导的血管舒张（Rajagopalan等人。1996; Jung等人。2003). Ang II改变细胞内信号成分导致内皮功能障碍的确切分子机制目前尚不清楚。在这项研究中，ACh诱导的血管舒张作用在Ang II治疗的WT小鼠肠系膜动脉中显著降低，这与其他人先前的研究结果一致（Virdis等人。2004; De Ciuceis等人。2005; Gongora等人。2006). ACh舒张功能受损，尤其是低浓度ACh时，主要是由于内皮NO减少，而非平滑肌细胞NO敏感性的改变。有趣的是，Ang II还显著降低了WT肠系膜动脉中TRPV4激动剂GSK1016790A的舒张作用，其舒张作用也涉及基础条件下的内皮NO（Mendoza等人。2010). 这些结果表明，与对受体激动剂ACh的作用类似，Ang II治疗会导致TRPV4介导的肠系膜动脉扩张功能受损。考虑到TRPV4依赖的Ca2+这种进入与ACh诱导的血管床扩张有关（Earley等人。2009; Zhang等人。2009; Adapala等人。2011; Sonkusare等人。2012)这些结果表明，TRPV4介导的舒张功能降低可能代表一种以前未被认识的内皮成分，导致血管紧张素II诱导的内皮功能障碍。Ang II不影响ACh诱导的TRPV4扩张−/−这是一个很大程度上出乎意料的发现，进一步暗示了TRPV4在血管生成素II的血管效应中的潜在作用（更多讨论见下文）。

这项研究还为TRPV4通道在血管紧张素II诱导的内皮依赖性血管舒张损伤中的作用提供了一些机制见解。与未经治疗的动物动脉相比，TRPV4蛋白表达和TRPV4介导的内皮Ca2+Ang II治疗小鼠新鲜分离的肠系膜动脉的反应类似。此外，慢性Ang II输注不会影响WT或TRPV4中eNOS蛋白的表达−/−老鼠。这些结果表明，Ang II治疗后ACh和GSK1016790A引起的舒张功能受损不太可能是由于TRPV4或eNOS蛋白表达改变，或Ca减少所致2+通过TRPV4进入内皮细胞。相反，Ang II可能影响内皮细胞中TRPV4下游的其他信号事件和eNOS激活，从而导致内皮依赖性舒张功能受损。需要进一步研究来测试这些可能性。使用血管平滑肌细胞和过度表达细胞系统，Shukla等人(2010)最近有报道称β通过Ang II受体激活激活的arrestin 1减少TRPV4通道和TRPV4介导的Ca的细胞表面蛋白表达2+通过加强渠道内化（不退化）作出反应。在培养的内皮细胞（HCAECs）中，Ang II以先前研究中使用的类似浓度处理1和24小时（Shukla等人。2010)不影响总表面或细胞表面TRPV4的表达。然而，Ang II治疗24小时显著降低了TRPV4激动剂诱导的[Ca2+]我HCAECs增加，表明细胞内信号受损导致TRPV4激活。这些差异的原因尚不清楚，但可能是由于所使用的组织/细胞类型或实验条件（体内与体外）的不同。此外，不能排除Ang II对TRPV4表达和功能的浓度相关差异效应。此前有报道称，Ang II以浓度依赖的方式诱导I型Ang II受体信号传导、脱敏或内化（Tang等人。1995).

因为Ang II不影响ACh诱导的TRPV4扩张−/−动物，Ang II可能反过来激活内皮细胞中的TRPV4通道，引发随后的信号事件，如ROS生成增加和NO生物利用度降低，而Ang II的低剂量或亚加压剂量可能更为重要。有证据表明，血管紧张素II信号的上调导致内皮功能障碍，而内皮功能障碍与血压反应无关，或在没有血压升高的情况下（Liu等人。2003; Marchesi等人。2013). 因此，在未来的研究中，有兴趣确定低压力剂量的Ang II是否以TRPV4依赖的方式诱导内皮功能障碍。

由于技术困难，我们无法使用生物素化技术直接研究Ang II治疗动物肠系膜动脉内皮细胞中TRPV4通道的细胞表面表达。可以考虑使用针对TRPV4通道细胞外表位的抗体的替代方法，但目前唯一可用的抗体没有检测到小鼠血管中的TRPV4蛋白（数据未显示）。

视角

作为Ca2+TRPV4在包括人类在内的多个物种的多个血管床内皮细胞中表达的进入通道与内皮介导的扩张有关，以响应受体激动剂和剪切应力（Köhler等人。2006; Hartmannsgruber等人。2007; Loot等人。2008; Earley等人。2009; Zhang等人。2009; Mendoza等人。2010; Adapala等人。2011; Bubolz等人。2012; Rath等人。2012; Sonkusare等人。2012; Ma等人。2013; Zheng等人。2013). 使用链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠模型，Ma等人(2013)最近有报道称，TRPV4介导的TRPV4信号传导减少可能是糖尿病EDHF依赖性血管舒张受损的潜在机制。在这项研究中，我们发现l‐NAME在TRPV4中增加了更大程度的血压−/−小鼠与WT对照组相比，但矛盾的是TRPV4−/−保护小鼠免受血管紧张素II诱导的小阻力动脉内皮功能障碍的影响。这些结果表明TRPV4在血管疾病中的潜在分化功能。有趣的是，最近的两项研究表明，TRPV4缺乏小鼠或经TRPV4拮抗剂治疗的WT小鼠也能防止饮食诱导的肥胖、脂肪炎症和胰岛素抵抗（Kusudo等人。2012; Ye等人。2012). 我们实验室的数据表明，在CAD患者的人冠状动脉微循环中，TRPV4介导的Ca2+进入是一个重要的信号事件，导致H的流动诱导释放2哦2（Bubolz等人。2012; Zheng等人。2013)是一种ROS，在缺乏传统内皮舒张因子（即NO和PGI）的情况下，在疾病期间调节持续的延迟反应2)但也具有致动脉粥样硬化特性，可能导致CAD和其他心血管疾病（Miura等人。2003; Liu等人。2011; Zhang等人。2012). 因此，在未来的研究中确定TRPV4在血管疾病中的确切作用，特别是在人类中，是非常有意义的。

致谢

作者感谢Stephanie Gruenloh对手稿的校对。

利益冲突

未申报。

脚注

资金筹措信息

这项工作得到了国立卫生研究院R01 HL096647至D.X.Z.的国家心脏、肺和血液研究所以及美国心脏协会SDG 0830042N至D.X.Z.的支持。

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