细胞密切监测生长因子、营养素和能量的可用性,并通过差异调节分解代谢和合成代谢作出相应反应。mTORC1信号通路感知并整合细胞生长信号,并可能充当这些信号与特定能量和营养物质消耗过程控制之间的管道(1). mTORC1通过影响mRNA翻译和核糖体生物生成刺激蛋白质合成(1,2). mTORC1信号也促进从头开始通过激活甾醇反应元件结合蛋白(SREBP)转录因子来合成脂质和甾醇,这些转录因子刺激驱动生物合成过程的酶的表达(三,4). 通过对大分子合成的这种影响,mTORC1是合成代谢细胞生长和增殖的主要驱动因素,在真核生物中保持不变。
为了揭示mTORC1通路对细胞代谢控制的额外输入,我们对缺乏结节性硬化复合物2(TSC2)肿瘤抑制因子的细胞进行了无偏见的代谢组学分析,TSC2是mTORC2的关键负调控因子(5). TSC2-缺陷细胞表现出生长因子依赖性激活mTORC1信号。在液相色谱(LC)串联质谱(MS/MS)鉴定的224种小代谢产物中,20种代谢产物的稳态水平在Tsc2型-/-小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)与其母鼠来源的野生型成纤维细胞相比(和表S1). 这个Tsc2型-/-用mTORC1抑制剂雷帕霉素处理细胞(15小时),以确定依赖于mTORC的变化。我们发现5种代谢物的丰度显著降低(p<0.01),以应对雷帕霉素(). 在这些国家中Tsc2型-/-细胞和对雷帕霉素敏感的细胞是戊糖磷酸途径的代谢产物。mTORC1信号传导诱导磷酸戊糖途径基因的全局转录,从而增加通过该途径的代谢流量(4). 为了确定受mTORC1信号变化影响更为严重的代谢物,我们还对治疗后1小时的代谢产物进行了分析Tsc2型-/-含有雷帕霉素的细胞。在短期雷帕霉素后丰度显著下降(p<0.01)的5种代谢物中(),只有N-氨甲酰天冬氨酸在Tsc2型-/-与野生型相关的细胞()对长期雷帕霉素敏感()表明mTORC1信号转导对该代谢物的丰度有积极影响。这些变化并不是由于细胞增殖或细胞周期进展的差异造成的,这些差异与Tsc2型+/+和Tsc2型-/-细胞和雷帕霉素处理1小时后的变化(图S1A、B). N-氨甲酰天冬氨酸在从头开始嘧啶生物合成,一种结合谷氨酰胺、碳酸氢盐(HCO)中氮和碳的途径三-)和天冬氨酸与核糖,从戊糖磷酸途径衍生,形成嘧啶核苷酸(). 为了确认该代谢物对短期雷帕霉素的敏感性Tsc2型-/-MEF公司(),我们将其在其他遗传环境中的丰度与用载体或雷帕霉素治疗后激活的mTORC1信号进行了比较。在正常人乳腺上皮细胞系MCF10A中稳定表达K-RasG12伏或PI3KH1047R型,激活mTORC1信号的癌基因(6),N-氨甲酰天冬氨酸水平在雷帕霉素治疗1小时后也降低(). 在一个PTEN公司表达多西环素诱导PTEN(U87MG-iPTEN)的人胶质母细胞瘤细胞株(7),PTEN再表达或雷帕霉素处理,这两种方法都能抑制这些细胞中的mTORC1信号传导,从而大大降低N-氨基甲酰基天冬氨酸的丰度(). 因此,mTORC1信号在多细胞环境中影响代谢物的丰度。
mTORC1对N-氨甲酰天冬氨酸丰度的影响(A-C公司)来自Tsc2型+/+和Tsc2型-/-MEF在无血清条件下生长15小时,并用载体(DMSO)或雷帕霉素(20 nM)处理。每个条件下三个独立样本的细胞内代谢物通过LC/MS/MS进行分析Tsc2型-/-相对于Tsc2型+/+单元格(A类)或在中减少Tsc2型-/-15小时内(B类)或1小时(C类)雷帕霉素治疗显示为根据p值排列的行正常化热图。请参阅表S1获取这些样品的完整代谢产物谱。
(D类)示意图从头开始嘧啶合成途径和碳氮源并入嘧啶环(见下文)。
(E、 F类)通过LC/MS/MS测定mTORC1抑制剂对N-氨甲酰天冬氨酸稳态水平的影响Tsc2型-/-稳定表达K-Ras的MEFs(E)或MCF10A细胞G12伏或PI3KCAH1047R型(F) 在血清饥饿15小时和雷帕霉素(20 nM)或二甲基亚砜治疗1小时后。
(G公司)如上所述,在血清饥饿15 h并用强力霉素(1μg/mL)或雷帕霉素(20 nM)治疗最后8 h后,在稳定表达强力霉素诱导PTEN的U87MG细胞中测量N-氨甲酰天冬氨酸水平。
(E-G公司)数据显示为三份样品的平均值±SEM,免疫印迹如下。MetaboAnalyst和GENE-E软件用于协助代谢物数据分析。全部P(P)-两两比较的值使用双尾Student’st吨测试(N个=3).
为了确定mTORC1信号对N-氨甲酰天冬氨酸稳态丰度的影响是否反映了通过从头开始嘧啶合成途径,我们用稳定同位素标记的15分钟脉冲测量相对通量15N-谷氨酰胺,标记在并入嘧啶环的酰胺氮上Tsc2型-/-MEF,短期雷帕霉素治疗可抑制MEF(). 尽管Tsc2型-/-细胞对谷氨酰胺的摄取增加,这种摄取在一小时内对雷帕霉素不敏感(图S2A)表明mTORC1调节的流量不是谷氨酰胺可用性增加的结果。在野生型MEF中,胰岛素刺激嘧啶合成通量(和图S2B)或HeLa细胞(图S2C)并被雷帕霉素抑制mTORC1阻断,或被氨基酸饥饿阻断(图S2D,E). 因此,mTORC1信号通过对遗传和生理刺激的反应诱导这种代谢途径。15分钟脉冲标记13C-天冬氨酸,在途径的第二步标记(),进一步证实了mTORC1调节通量(). 因为戊糖磷酸途径通过核糖-5-磷酸和5-磷酸核糖基-1-焦磷酸(PRPP;),可能影响嘧啶合成的上游步骤(8),mTORC1信号传导通过转录效应促进通过该途径的氧化分支的流量(4),我们分析了从头开始细胞接触[1,2脉冲后磷酸戊糖途径产物的合成-13C] -葡萄糖。Tsc2型-/-细胞通过氧化戊糖磷酸途径的流量增加,导致5-磷酸核糖和PRPP的合成增加,这对15小时的反应非常敏感(4),但不是1小时,用雷帕霉素治疗(). 因此,mTORC1信号对嘧啶合成的急性影响并不是通过对磷酸戊糖途径的平行作用实现的。
mTORC1基因或胰岛素刺激激活对代谢流量的影响从头开始嘧啶合成途径(A类)标准化峰面积15N-标记代谢物,通过LC/MS/MS测量,提取自Tsc2型+/+和Tsc2型-/-MEF在无血清条件下生长15小时,在过去1小时内使用载体(DMSO)或雷帕霉素(20 nM)治疗,并在15分钟内脉冲标记15N-谷氨酰胺。
(B类)标准化峰面积15来自野生型MEF的N标记代谢物如上所述处理,但在需要时用胰岛素(100 nM)刺激1小时。
(C类)标准化峰面积13C标记的代谢物来自按(A)处理的细胞,但15分钟脉冲标记为[4-13C] -代谢物提取前的天冬氨酸。
(D类)单峰归一化峰面积13C标记代谢物来自按(A)处理但经雷帕霉素处理1小时或15小时的细胞,并用[1,2脉冲标记15分钟-13C] -提取代谢物之前的葡萄糖。
(A-D公司)所有数据均以每种条件下三个独立样本的平均值±SEM表示*P(P)使用双尾学生的成对比较<0.05t吨测试(N个=3),所有P(P)-中提供的值表S3.
为了确定mTORC1信号通路刺激嘧啶合成的机制,我们将重点放在包含该途径的酶上。我们发现,在检测到依赖于mTORC1的嘧啶合成流量增加的情况下,CAD和二氢鸟酸脱氢酶(DHODH)的转录水平和蛋白质水平都没有改变,这两种酶是该途径的前两种酶(图S3A-F). 雷帕霉素和DHODH抑制剂(A771726(9))对两个稳态都有相反的影响(图S3G)和从头开始合成的(图S3H)N-氨甲酰天冬氨酸和DHODH抑制剂的用量大大增加了该代谢物在Tsc2型-/-细胞,表明mTORC1信号传导不影响DHODH活性,而是向上游转移。因为CAD催化了路径的前三个步骤(),我们对从有或无雷帕霉素的胰岛素刺激细胞中纯化的CAD免疫纯化物进行了MS/MS分析,以确定潜在的mTORC1调节的磷酸化位点。尽管蛋白质的覆盖率为85%,但我们在该分析中仅鉴定出两个化学计量比较高的磷酸化位点,即S1859和S1900(图S4A). 虽然含有S1900的磷酸化肽的比率在胰岛素和雷帕霉素处理后保持不变,但S1859上磷酸化的肽仅在胰岛素刺激细胞的样品中检测到,在同样使用雷帕霉素的样品中没有检测到(). S1859位于二氢orotase(DHO;E3)和天冬氨酸转氨酰酶(ATC;E2)结构域之间的保守连接子区域,磷酸化位点在脊椎动物CAD同源基因中保守(图S4B). 这个位点可以被磷酸化在体外由PKA提供(10)在最近的两个磷酸-蛋白质组学筛选中发现了mTORC1调节的磷酸化位点(11,12). 然而,S1859磷酸化对CAD的细胞调节和功能尚未描述。为了表征S1859磷酸化的机制,我们利用了其序列上下文,该序列上下文被可用的磷酸化序列基序抗体识别。磷酸化-Ser基序抗体可识别胰岛素刺激的细胞中的CAD,而该抗体未检测到影响S1859的CAD磷酸化位点突变,从而建立了磷酸化-S1859抗体对CAD的特异性(). 该位点上胰岛素刺激的CAD磷酸化对雷帕霉素敏感,证实了对mTORC1激活的依赖性(). 因为S1859基序类似于Akt和S6K等嗜碱性激酶识别的基序(13,14)而不是mTOR报告的基序(11),我们确定该位点是否被mTORC1下游的S6K1或S6K2磷酸化。与雷帕霉素一样,S6K1特异性抑制剂(PF-4708671(15))阻断CAD-S1859的胰岛素刺激磷酸化,以及Rictor上已建立的S6K1靶点的磷酸化() (16). 同样,siRNA介导的S6K1的敲除,而不是S6K2的敲除,减弱了S1859上的CAD磷酸化(). CAD和内源性S6K1协同免疫沉淀(图S4C)和S6K1,但不是催化活性的S6K1直接磷酸化S1859上的CAD在体外(). 一种针对CAD-S1859的磷酸特异性抗体(图S4D)证实在多个细胞系中,内源性CAD在该残基上磷酸化,以mTORC1-和S6K1-依赖的方式对胰岛素或EGF作出反应,但与ERK和RSK无关(和图S4E、F). S6K1不影响T456上CAD的磷酸化,T456被ERK磷酸化以响应EGF()(17).
CAD作为S6K1的直接基板(A类)胰岛素和雷帕霉素对CAD磷酸化位点的影响。在用胰岛素刺激(3 h,50 nM)之前,用二甲基亚砜或雷帕霉素(20 nM)处理1h,从缺血清(16 h)的HEK-293E细胞中免疫纯化FLAG-HA-CAD。绘制了不同条件下CAD上指示位点的磷酸化与总肽水平的比值,通过LC/MS/MS测量为总离子电流(TIC)。ND=未检测到磷酸肽。
(B类)将表达空载体(EV)或野生型(WT)、S1859A或S1900A版本的FLAG-HA-CAD的HEK-293E细胞血清饥饿(16小时)并用胰岛素刺激(1小时,100nM)。用磷酸-14-3-3结合基序抗体(P-Ser基序)对FLAG免疫沉淀物进行免疫印迹。
(C类)细胞按(B)处理,但在胰岛素刺激前用雷帕霉素(20 nM)或S6K1抑制剂PF-4708671(10μM,S6K1i)预处理1 h。
(D类)细胞按(C)处理,但也转染靶向S6K1、S6K2或两者的siRNA,或非靶向对照(siCtl)。
(电子)体外用血清饥饿、雷帕霉素处理的HEK-293E细胞免疫沉淀的FLAG-HA-CAD底物(WT或S1859A)和胰岛素刺激的HEK-29.3E细胞的HA-S6K1(WT or kinase dead,KD)免疫沉淀进行激酶分析。
(F类)在用胰岛素(100 nM)或EGF(20 ng/mL)刺激1小时之前,对Hela细胞进行血清饥饿(16小时),并用雷帕霉素、S6K1i或MEK抑制剂U0126(10μM)预处理1小时。
我们试图确定S6K1活性是否通过嘧啶合成途径影响流量。而长期服用雷帕霉素可以减少葡萄糖摄取及其通过氧化戊糖磷酸途径的流量(4),S6K1特异性抑制剂不影响Tsc2型-/-单元格(图S5A)siRNA-介导的S6K1缺失不会影响胰岛素刺激细胞内磷酸戊糖途径的流量(图S5B). 相反,S6K1抑制剂,如雷帕霉素,显著降低胰岛素刺激的流量15N-谷氨酰胺进入嘧啶合成途径的代谢物(和图S5C)siRNA-介导的S6K1耗竭,但S6K2没有(和图S5D). S6K1缺失对嘧啶通量的类似影响在Tsc2型-/-具有构成性mTORC1信号的细胞(图S5E). 因此,需要S6K1来诱导从头开始mTORC1下游的嘧啶合成。
S6K1和S1859对mTORC1依赖性刺激的CAD要求从头开始嘧啶合成途径(A类)标准化峰面积15在DMSO、雷帕霉素(20 nM)或PF-4708671(10μM,S6Ki)存在下,从缺乏血清(15 h)和胰岛素刺激(1 h,100 nM)的WT-MEFs中提取的N标记代谢物,通过LC/MS/MS测定,15分钟脉冲标记为15N-谷氨酰胺。
(B类)标准化峰面积15转染靶向S6K1、S6K2或两者的siRNAs或非靶向对照(siCtl)的WT MEF的N标记代谢物在转染后48小时进行处理,如(A)所示。
(C类)放射性标签的相对合并14C-天冬氨酸,三H-尿苷或三如(B)所示,将H-胸腺嘧啶核苷转染到转染siRNAs的WT MEF的RNA和DNA中,血清饥饿(15 H),胰岛素刺激(6 H,100 nM),在此期间对细胞进行放射标记。
(D类)放射性标签的相对合并14C-天冬氨酸或三H-尿苷从WT MEF转化为rRNA,如(C)所述。纯化的rRNA也在琼脂糖凝胶上进行评估(右)。
(电子)标准化峰面积15表达CAD WT或S1859A突变体的G9C细胞中的N标记代谢物,如(a)所述。ND=未检测到代谢物。
(A-E公司)所有数据均以每种条件下三个独立样本的平均值±SEM表示*P(P)使用双尾学生的成对比较<0.05t吨测试(N个=3),所有P(P)-中提供的值表S4.
确定mTORC1信号是否通过刺激从头开始嘧啶合成,我们测量了14C-天冬氨酸转化为RNA和DNA。为了控制对RNA和DNA合成的全局影响,我们还用以下两种标记细胞三用于RNA或三DNA的H-胸腺嘧啶,绕过从头开始合成途径。DHODH抑制剂阻断胰岛素诱导的14C、 但不是三H、 进入RNA和DNA,验证了该检测方法对从头开始嘧啶合成(图S6A). 胰岛素刺激的两者结合14C-天冬氨酸和三雷帕霉素抑制H-尿苷进入RNA(图S6A、B),表明mTORC1信号影响从头开始胰岛素下游的嘧啶合成和总RNA合成。由于大多数细胞RNA是核糖体,这一发现与mTORC1信号传递到rRNA合成的多重输入相一致(2). 然而,雷帕霉素对嘧啶并入DNA的作用是合成的嘧啶所特有的从头开始(图S6A、B). SiRNA-介导的S6K1缺失也阻断了胰岛素诱导的14C-天冬氨酸同时进入RNA和DNA,但与雷帕霉素不同,它不影响外源嘧啶的掺入(). 从耗尽S6K1的标记细胞中纯化核糖体表明,胰岛素需要S6K1来刺激从头开始合成嘧啶,但不是外源嘧啶,转化为rRNA(). S6K1通过嘧啶合成RNA和DNA在mTORC1刺激通量中的作用在Tsc2型-/-S6K1耗尽的细胞(图S6C).
为了确定S6K1是否通过其对CAD-S1859的直接磷酸化通过嘧啶合成途径调节流量,我们使用了中国仓鼠卵巢(CHO-K1)衍生的G9C细胞系,该细胞系因CAD缺乏而对尿苷营养不良(18). 与其他细胞环境一样,胰岛素强烈刺激表达野生型CAD的G9C细胞嘧啶合成中间产物标记的增加,这被S6K1抑制剂阻断(和图S7A、B). 虽然在CAD-S1859A突变体表达的G9C细胞中,N-氨甲酰天冬氨酸的合成随着胰岛素的反应而增加,但CAD下游嘧啶中间体的标记并未受到胰岛素的刺激,这些代谢物的检测量与使用S6K1抑制剂处理的野生型细胞中的检测量相似(). 这些数据表明S6K1介导的S1859磷酸化增强了体内CAD的二氢orotase(E3)活性,胰岛素和S6K1的额外调节点可能会影响通路的上游步骤(图S7C). 表达CAD-S1859A的细胞对胰岛素不再敏感,因为刺激了胰岛素的掺入从头开始将嘧啶合成RNA和DNA(图S7D).
这项研究表明,mTORC1在生长信号和嘧啶合成的急性控制之间起着分子连接作用。值得强调的是,mTORC1和S6K1对于从头开始嘧啶合成本身,但需要增加通过该途径的流量,以响应胰岛素和营养素等促生长信号。S6K1对CAD的直接调节是增加伴随细胞生长的RNA和DNA合成可用核苷酸库的机制。除蛋白质和脂质合成外,嘧啶合成是另一个主要的合成代谢过程,通过mTORC1信号对细胞生长条件的变化作出反应。