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分子细胞蛋白质组学。2013年2月；12(2): 343–355.
2012年11月15日在线发布。 数字对象标识：10.1074/mcp。M112.022806型
预防性维修识别码：项目经理3567858
PMID：23161513

突变型KRAS结肠癌细胞外显子的蛋白质组分析鉴定突变型KRA的细胞间转移* 保存图片、插图等的外部文件。对象名称为sbox.jpg

米歇尔·德莫里·贝克勒,‡§ 詹姆斯·希金波坦,‡ 杰弗里·富兰克林,‖ Amy-Joan火腿,**‡‡ 帕特里克·哈维,**‡‡ 伊玛德·E·伊玛苏恩,‡ 科尔宾·惠特威尔,** 李明（音）,§§ 丹尼尔·利伯勒,**‡‡和罗伯特·J·科菲‡‖¶¶
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

摘要

激活突变KRAS公司发生在30%至40%的结直肠癌中。突变型KRAS如何改变癌细胞行为已被深入研究，但对突变型KRA的非细胞自主效应知之甚少。我们最近报道，与从野生型表达KRAS的细胞中纯化的外泌体相比，从表达KRAS的突变结肠癌细胞中分离的外泌体增强了受体细胞的侵袭性，这使我们假设突变KRAS可能通过调节外泌体的组成和行为来影响邻近和远处的细胞。在此，我们展示了来自含有野生型和G13D突变体的亲代DLD-1细胞的外泌体的全面蛋白质组学分析结果KRAS公司等位基因和等基因匹配的衍生细胞系DKO-1（突变体KRAS公司仅等位基因）和DKs-8（野生型KRAS公司仅等位基因）。突变KRAS状态显著影响外体蛋白质组的组成。突变KRAS细胞的外显子包含许多促肿瘤蛋白，包括KRAS、EGFR、SRC家族激酶和整合素。DKs-8细胞内化DKO-1外泌体，值得注意的是，DKO-1外泌体将突变KRAS转移到DKs-8肿瘤细胞，从而增强了这些表达野生型KRAS的非转化细胞的三维生长。这些结果对突变KRAS的非细胞自主效应，如场效应和肿瘤进展具有重要意义。

K-RAS（KRAS）是一种小的单体GTPase，其生物活性由其核苷酸结合状态决定。多种证据强调了KRAS在结直肠癌（CRC）中的重要性。1例如，激活错义突变KRAS公司在30%至40%的CRC中发生，并与不良预后密切相关(1,2). 此外，突变体KRAS公司负向预测抗EGF受体（EGFR）治疗的反应性(三).

早期试图破译突变KRAS的肿瘤后果依赖于过度表达研究。这些研究的一个缺点是未能模拟人类肿瘤中的遗传条件，因为肿瘤中通常存在一种野生型（WT）和一种突变型KRAS公司等位基因(1). 最近，KRAS突变CRC细胞系被设计成选择性地含有野生型或突变型KRAS公司等位基因(4)和一个突变体喀斯特基因工程小鼠肠道中的等位基因被激活(5). 使用这些互补方法进行的详细研究表明，突变KRAS具有广泛的促肿瘤作用（参考文献。6). 关于突变型KRAS的许多已知信息都与它以细胞自主方式改变转化细胞行为的能力有关。除了通过肿瘤衍生VEGF表达增加肿瘤血管外(7,8)突变体KRAS的非细胞自主效应研究较少。

外泌体是一种30到100纳米的分泌小泡，是一种新的细胞间通讯方式(9). 我们最近报道，从突变型KRAS CRC细胞条件培养液中纯化的外泌体含有较高水平的EGFR配体两性调节蛋白（AREG），与等基因匹配的野生型KRAS细胞外泌物相比，受体癌细胞的侵袭性增强(10). 这些结果促使我们对从这些细胞中纯化的外泌体进行全面分析。在此，我们证明突变KRAS会引起外体蛋白组成的许多变化。值得注意的是，我们发现（i）KRAS包含在外显体中，（ii）外显体可以将突变的KRAS转移到只表达野生型KRAS的细胞，以及（iii）含有突变KRAS外显体的外显体能够促进野生型KRA细胞在胶原基质和软琼脂中的生长。这些结果为CRC肿瘤的进展提供了一种机制，通过这种机制，肿瘤微环境可能受到表达突变KRAS的肿瘤细胞释放的非细胞自主信号的影响。

实验程序

细胞培养、试剂和抗体

DKs-8、DLD-1、DKO-1(4)和RIE-1细胞培养如别处所述(10,11). 细胞保存在含有血清的DMEM中（Mediatech，Manassas，VA）。牛生长血清购自HyClone（Logan，UT），所有其他细胞培养试剂购自Mediatech，除非另有说明。三羧基乙基膦购自皮尔斯（伊利诺伊州罗克福德），测序级胰蛋白酶购自普罗米加（威斯康星州麦迪逊），三氟乙醇和二硫苏糖醇购自Acros（比利时吉尔）。三氟乙酸、碳酸氢铵和尿素购自费希尔科学公司（宾夕法尼亚州匹兹堡）。所有其他试剂均购自西格玛（密苏里州圣路易斯）。有关其他试剂的列表，请参阅补充“实验程序”部分.

外显子分离

如前所述，从DKs-8、DLD-1和DKO-1细胞的条件培养液中分离出外显子，但有轻微的修饰(10). 简单地说，细胞在补充有10%牛生长血清的DMEM中培养，直到80%融合。然后用PBS清洗细胞三次，并在无血清培养基中培养48小时。去除无血清条件培养基并在300×克去除细胞碎片，然后通过0.22μm聚醚砜过滤器（Nalgene，Rochester，NY）过滤产生的上清液，以减少微粒污染。使用100000分子量截止离心浓缩器（Millipore）将滤液浓缩至300倍。然后以150000×克将产生的富含外泌体的颗粒重新悬浮在含有25 m的PBS中2 h米HEPES（pH 7.2），并在150000×克持续3小时。清洗步骤至少重复三次，直到检测不到任何酚红。将产生的颗粒重新悬浮在含有25m的PBS中米HEPES（pH 7.2）如前所述(10)用MicroBCA试剂盒（Pierce）测定外显子制剂的蛋白质浓度。根据制造商的建议，通过纳米粒子跟踪分析（英国威尔特郡NanoSight）确定每微克蛋白质的外显子数量。对三种独立的外泌体制剂进行了分析。

肽的消化和等电聚焦

纯化了三种不同的外泌体制剂，并对每个样品的相同蛋白质浓度进行了分析。样品用胰蛋白酶消化，使用其他地方所述的三氟乙醇（TFE）消化程序，并进行微小修改(12)，等电聚焦改编自卡吉尔等。(13). 有关TFE消化和胰蛋白酶肽等电聚焦的详细方法，请参见补充的“实验程序”部分.

反相LC-MS/MS分析

LC-MS/MS分析在LTQ Orbitrap混合质谱仪（Thermo Electron，San Jose，CA）上进行，该质谱仪配备了Eksigent纳米LC和自动采样器（Dublin，CA）。肽在100μm×11 cm熔融石英毛细管柱（Polymicro Technologies，LLC，Phoenix，AZ）上用5μm，300ÅJupiter C18（Phenomenex，Torrance，CA）填充，使用与前述相同C18树脂填充的内联100 mm×4 cm固相萃取柱进行拆分(14). 在室温下以0.6μl min的流速进行液相色谱分析−1使用水中0.1%（v/v）甲酸（溶剂a）和乙腈（溶剂B）中0.1%（v/v）甲酸的梯度混合物。有关其他详细信息，请参阅补充的“实验程序”部分.

光谱计数的数据库检索与统计分析

“ScanSifter”算法从Thermo RAW文件中读取存储为中心峰列表的串联质谱，并将其转换为mzML文件(15). 有关详细分析，请参阅补充的“实验程序”部分将确定的蛋白质组提交给Webgestalt进行GOSlim分析和Ingenuity Pathways分析包。为了对蛋白质组进行分类，根据相对水平对数据进行分类，并识别出组间差异大于3倍且错误发现率（FDR）小于0.05的蛋白质。根据DAVID对具有显著不同水平的蛋白质进行分类(http://david.abcc.ncifcrf.gov/)和Uniprot数据库。

为了识别任何可能区分细胞突变KRAS状态的潜在蛋白质，我们使用我们之前发表的方法进行了统计评估，并进行了一些修改(16). 为了计算速率比，使用模型生成速率和提供的偏移量反向计算报告的频谱计数。比率是各组比率的比率，表示为比率的基数2对数(16). 这个比率代表了比较组之间的数量差异。广义线性混合效应模型(17)适合处理以计数数据表示的外显子数值，并对每个细胞系样本进行重复测量；第页根据似然比检验获得每次比较的值。通过比较两种突变状态的预期值来确定比率。当同时测试数千个蛋白质时，应用FDR控制程序处理多重比较。为了测试DKs-8、DLD-1和DKO-1细胞的外泌体水平是否存在单调增加的趋势，应用了Jonckheere–Terpstra趋势测试(18). 请参阅补充的“实验程序”部分用于其他统计考虑。

基于LC-多重反应监测的多肽检测

DKs-8和DKO-1细胞生长到80%的融合处，并隔夜饥饿血清。100μg所示外显体孵育100万个细胞，或在37°C恒定旋转下模拟处理1小时。然后用冰镇PBS将细胞制粒并洗涤三次，并按照补充的“实验程序”部分.

LC-多反应监测

在TSQ Vantage三重四极杆质谱仪（Thermo-Fisher，San Jose，CA）上对肽样品进行三次分析（注射量为2-μl），该质谱仪配备了Eksigent纳米LC溶剂输送系统（Eksigen，Dublin，CA）、自动进样器和纳米喷雾源。有关详细信息，请参阅补充的“实验程序”部分(19). KRAS肽的浓度标准化为蛋白质输入，并报告为fmol/μg蛋白质。

对于外体标记蛋白的相对定量，使用标记的参考肽方法(20). 如其他地方所述，在进行LC-多重反应监测（LC-MRM）分析之前，对细胞样品进行了分析和消化(21). β-肌动蛋白肽GYSFTTAER的稳定同位素标记版本用作内标（25 fmol/μl）。从Skyline获得每个目标肽过渡的集成色谱峰面积(22)如我们在别处所述，求和并归一化为β-肌动蛋白内标的总峰面积(20).

生化分析

对于Western blotting，裂解DKs-8、DLD-1和DKO-1细胞，并通过SDS-PAGE和Western blotting解析蛋白质，如补充的“实验程序”部分对CTNND1、ITGAV、ITGB1、RAP1和SRC使用100μg全细胞裂解物（WCL）和10μg胞外体蛋白（EXO）进行Western blotting；CTNNA、ITGA2、LYN和KRAS使用100μg WCL和30μg EXO；CTTN和EPHA2使用200μg WCL和30μg EXO；ITGA6使用50μg WCL和20μg EXO；TUBA使用50μg WCL。

电子显微镜

从DKs-8或DKO-1细胞的条件培养液中纯化外显子，并按照其他地方的描述进行成像(10). 使用ImageJ软件测定两种独立外显子制剂中每种制剂的100个外显子的直径（共200个）。

流式细胞术内化分析

为了确定外泌体是否被内化，从DKO-1或DKs-8细胞中分离的外泌体用100μg 1，1′-二十八烷基-3，3′，3′-四甲基吲哚二花青（DiD）/mg EXO标记，并洗涤以去除未合并的DiD。将DKO-1或DKs-8受体细胞生长至50%汇合，并在无血清培养基中培养过夜。如前所述，受体细胞进行DiD标记的外体内化(10). 简单地说，从培养皿中取出细胞，清洗，并与DiD染色的外泌体在恒定旋转下培养指定时间。立即将细胞稀释成100 vol冰镇PBS，补充10%BSA，然后清洗。通过流式细胞仪对细胞进行分析，以确定总荧光（表面相关外显体+内化外显体）和标记细胞的百分比。然后将细胞暴露于200 m米添加0.5%二甲基亚砜和5%牛血清的PBS中的苏丹黑在4°C下保持5分钟，以熄灭受体细胞表面的DiD荧光。重复流式细胞术以测定内化外泌体的荧光。

显微内化分析

DKs-8和DKO-1外泌体用亲脂性膜染料DiD（Invitrogen，Grand Island，NY）染色，如其他地方所述(10). 将受体DKs-8、DKO-1或RIE-1细胞接种在24孔组织培养皿中的盖玻片上，密度为5.0×104细胞/孔。细胞在含血清培养基中保存24小时后，清洗细胞并用无血清培养基再培养24小时。然后在37°C的摇床上用100μg DiD染色的外泌体培养贴壁细胞30分钟。随后，用PBS清洗细胞三次，在4%多聚甲醛中固定30分钟，用0.2%Triton-X100渗透，用AlexaFluoro 488-Phalloidin（Invitrogen）培养，并安装在载玻片上。在带有63倍物镜的蔡司LSM 510 Meta共聚焦显微镜上观察内部化。

三维细胞培养

用于三维胶原蛋白凝胶基质的生长(23)在48周的组织培养皿中使用三层胶原蛋白。在将DKs-8和DKO-1细胞包被胶原蛋白之前，将其胰蛋白酶化、注射并重新悬浮在浓度为5×10的无血清DMEM中5细胞/ml。顶层和底层含有150μl/孔PureCol胶原蛋白（加州圣地亚哥Advanced Biomatrix），在无血清DMEM中稀释至2 mg/ml。中间层由无血清DMEM中150μl/孔的2 mg/ml胶原蛋白和5×10组成三细胞。添加无血清培养基或添加50μg DKs-8或DKO-1外泌体的无血清培养液。培养基每周更换两次，持续2周。使用凝胶计数成像仪（英国牛津光电公司）检测菌落。对三个实验中的每一个进行了三次技术复制。每个样本的平均菌落数绘制为±S.E.，统计显著性报告为第页< 0.05. 菌落直径的结果通过其五个汇总统计数据以箱线图的形式报告：样本最小值（最低条）、下四分位数（Q1，下铰链）、中位数（Q2）、上四分位（Q3，上铰链）和样本最大值（最高条）。两个样本t吨试验用于评估样本之间的平均菌落直径差异，统计显著性报告如下第页< 0.001.

软琼脂生长

在用琼脂糖包被之前，RIE-1细胞与所示的外显体（50μg外显体/5.0×10）一起端对端旋转5细胞）或在37°C下模拟处理2小时。然后将细胞以6.25×10的密度分三次置于六孔培养皿中4细胞/孔，0.4%VII型琼脂糖（Sigma）覆盖0.8%琼脂糖硬化层。细胞在37°C和5%CO中培养2连续7天，使用凝胶计数成像仪对菌落进行计数。对三个实验中的每一个进行了三次技术复制。绘制每个样本的平均菌落数±S.E.，统计显著性报告为第页<0.01。

结果

通过LC-MS/MS测定细胞KRAS状态对外泌体蛋白质组成的影响

我们之前的研究表明，表达突变KRAS的CRC细胞释放的外泌体中AREG的水平明显高于其等基因匹配WT-KRAS衍生物的外泌物(10). 我们假设，根据产生细胞的突变KRAS状态，外泌体的蛋白质组成可能会发生全局变化。从亲本DLD-1细胞的无血清条件培养基及其等基因匹配的衍生物DKO-1（突变体KRAS公司和DKs-8（仅WT等位基因）细胞。由于已知牛血清中存在外泌体，采集期间未使用含血清的培养基(24). 为了确保从这些细胞中提取的外体制剂富含外体，且相对缺乏较大的细胞外囊泡，对囊泡进行外体标记和大小分析(图1). 这些小泡含有外显体特异性标记物HSP70(25)、TSG101(26)，和Flotillin-1(10)，但它们不包含电压依赖性阴离子通道（VDAC），即线粒体蛋白(图1A类). 透射电镜（TEM）尺寸分析表明，DKs-8囊泡的平均直径为59.2 nm±14.2 nm，DKO-1囊泡的直径为56.3 nm±17.9 nm(图1B类). 重要的是，没有囊泡大于140 nm。虽然我们不能排除我们的制剂中含有其他类型囊泡的可能性，但这些结果与报告的外泌体大小一致(9)小于报道的微泡尺寸，其直径范围为200 nm至1μm(27). 综合起来，这些结果有力地支持了这些外体制剂的纯度。为了确定每个细胞系产生的外泌体的浓度，进行了纳米颗粒追踪分析。结果表明，DKs-8、DLD-1和DKO-1外体制剂中每微克蛋白质的小泡数量相对相似(补充图S1A类)这表明这三种细胞系在无血清条件下分泌同等水平的外泌体。

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从DKs-8、DLD-1、， DKO-1细胞具有外体特征。 A类，通过本文所述的差速离心法从DKs-8、DLD-1和DKO-1细胞的条件培养基中纯化外显子。100微克的全细胞裂解物（WCL）蛋白和10微克的外显子（EXO）蛋白通过SDS-PAGE溶解，并用所示抗体进行蛋白质印迹。实验至少进行了三次。B类，DKs-8和DKO-1细胞的两个独立外显体制剂被负染并通过TEM观察。典型的现场图像显示，囊泡具有外泌体的光滑、碟状形态特征（左侧面板）。根据TEM图像计算200个囊泡的平均直径，并绘制每个10 nm大小组的外显子频率（右侧面板）。DKs-8的平均直径为59.2 nm±14.2 nm，DKO-1的平均直径是56.3 nm±17.9 nm。比例尺表示100 nm。

为了确定来自DLD-1、DKs-8或DKO-1细胞的外泌体中的蛋白质组成是否发生改变，我们进行了全面的蛋白质组分析。通过顺序差速离心纯化每个品系的三种外泌体生物制剂。由于蔗糖梯度分馏的产量较低，因此未使用该程序。为了排除可能的微泡污染，外泌体制剂通过0.22μm过滤器过滤。对纯化的外泌体进行消化，使用肽的等电聚焦进行分离，并通过LC-MS/MS分析进行分析（每个样品三次技术MS复制）。

如前所述，对LC-MS/MS数据集进行搜索和过滤（见实验程序）。我们发现总共有185000个确定的光谱，对应于15359个肽和1924个蛋白质组（应用简约的最小蛋白质报告）（数据集1）。这对应于2%的蛋白质水平FDR和0.6%的肽与光谱匹配的FDR。平均值、标准偏差和变异系数证明了我们分析的高再现性(补充表S1). 为了确定与LC-MS/MS分析确定的蛋白质相关的生物过程、分子功能和细胞成分，使用GOSlim分类分析(补充图S1B类、S1C类和S1D类). 在鉴定出的1924个蛋白质组中，1820个被分配给一个基因。当检测是否存在蛋白质时，这些蛋白质组的大多数在DKs-8、DLD-1和DKO-1外泌体中共享(图2A类). 23个蛋白质仅存在于DKs-8外显体中，1个存在于DLD-1外显体，2个存在于DKO-1外显体内(图2A类和数据集1，表2）。蛋白质组代表含有常见胰蛋白酶肽的蛋白质家族成员；以下，除非另有说明，否则它们被称为蛋白质。

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外泌体的蛋白质组分析。 A类，维恩图表示通过LC-MS/MS在所示外显体中识别的蛋白质组的存在、缺失或重叠。B类，热图表示DKs-8中显著上调和下调的蛋白质与DKO-1成对分析（见正文）。数据根据组间差异大于3倍且FDR<0.05的相对水平和鉴定的蛋白质进行分类。这些蛋白质包括DLD-1外体蛋白水平的差异。红色代表上调的蛋白质，绿色代表下调的蛋白质。C类,D类、蛋白质分类鉴定。蛋白质(C类)相对于DKs-8外显体，DKO-1外显体上调或(D类)根据Uniprot鉴定的功能，对DKs-8外显体相对于DKO-1外显体的上调进行分类。使用的统计标准是FDR<0.05，比率>3。结果绘制为饼图。含有总蛋白质不到2%的分类被归类为杂类。

除了确定蛋白质的存在或缺失外，我们还根据供体细胞突变KRAS状态评估了外泌体内蛋白质的相对水平。为此，我们进行了成对分析和趋势分析（数据集2、表1和数据集3）。表一表示使用广义线性混合模型和Jonckheere-Terpstra（JT）趋势分析生成的两两比较。对于两两比较，所有蛋白质的FDR均小于0.05。该表显示了在给定速率比范围大于3、小于3、但大于2、小于2、但大于1.5的情况下，在所示外体比较中其水平增加或减少的蛋白质数量。此外，从DKs-8到DLD-1到DKO-1外泌体的蛋白质数量有增加或减少的趋势，FDR值小于0.05或0.01。

表一

基于光谱分析的KRAS调控外体蛋白的蛋白质组学和统计评价
外显子比较成对比较
JT趋势分析
FDR<0.05比率
从DKs-8到DLD-1再到DKO-1的趋势
>3<3.0时，>2<2, >1.5趋势第页FDR值<0.05趋势第页FDR值<0.01
DKO-1型与。丹麦-8↑126, ↓ 290↑ 42，↓82↑ 23, ↓ 38↑ 102, ↓ 276↑ 50, ↓ 83
数据链路D-1与。丹麦-8↑ 81, ↓ 141↑ 42, ↓ 26↑ 18, ↓1 0
DKO-1型与。数据链路D-1↑ 3，↓9↑ 3, ↓ 3↑ 0, ↓ 3

表中的成对比较表示FDR为<0.05. 左边的列表示基于所示外泌体之间的比率存在定量蛋白质水平差异的蛋白质数量。差异分为大于或等于3、小于3但大于或等于2、小于2但大于1.5。是的，从DKs-8到DLD-1到DKO-1的蛋白质数量呈增加趋势，或者从DKs-8~DLD-1~DKO-1呈下降趋势第页FDR值<0.05或<0.01。

两两比较的广义线性混合效应模型（DKs-8）的结果与DKO-1、DLD-1与DKO-1、DLD1与DKs-8）显示DKs-8和DKO-1外显子之间的外体蛋白水平差异最大（416个总蛋白，表一). 显著性被定义为DKs-8和DKO-1样本之间蛋白质水平的3倍以上差异（比率）和基于成对分析的小于0.05的FDR（数据集2）。绘制了DKs-8和DKO-1外显体蛋白质相对丰度的热图，其水平存在显著差异。然后将DLD-1外体蛋白水平的差异包括在调节蛋白的热图中(图2B类和补充图S2).

DLD-1细胞和DKO-1细胞都含有突变的KRAS。这些细胞系在裸鼠体内和软琼脂中形成数量相似的肿瘤(4). WT损失和突变体复制KRAS公司癌症中存在等位基因(28——31); 有证据表明野生型KRAS可能是一种肿瘤抑制因子，并且突变体和野生型之间的平衡KRAS公司等位基因对KRAS的致癌潜能至关重要。因此，我们询问外体蛋白的进一步功能分类是否与DKO-1、DLD-1和DKs-8外体中的KRAS状态相关。DLD-1外泌体中有81个蛋白质显著高于DKs-8外泌体中的蛋白质(表一和数据集2，表6）；我们发现，具有相当相似功能（内吞、粘附、调节肌动蛋白细胞骨架）的蛋白质在DLD-1和DKO-1外体中的水平高于DKs-8外体(补充图S3). 然而，我们选择对DKO-1外显体与DKs-8外显体进行进一步分析，因为这种比较产生了最大的差异(表一).

我们还使用JT趋势测试（数据集3）对从三个等基因匹配细胞系纯化的外显子中的蛋白质水平进行了趋势分析(18). 有102个蛋白质增加，276个蛋白质减少(第页<0.05）基于从DKs-8到DLD-1到DKO-1外泌体的趋势(表一). 当采用更严格的标准时(第页<0.01），增加50个蛋白质，减少83个蛋白质。

KRAS调节的外体蛋白的分类

通过两两比较进一步分析突变KRAS调节的外体蛋白(图2B类和补充图S2)显示了这些蛋白质如何归入不同的细胞功能类别。每个蛋白质都根据其Uniprot定义的功能进行分类，每个功能组中的蛋白质表示为总调节蛋白质的百分比。结果以饼图的形式绘制，其中一个是DKO-1外泌体中水平显著较高的蛋白质(图2C类和数据集2，表2），另一个用于DKs-8外泌体中水平显著较高的蛋白质(图2D类和数据集2，表3）。显著性定义为FDR<0.05和比率>3。将总蛋白质含量低于2%的单个功能组归类为杂类。与囊泡成分/转运和细胞粘附相关的蛋白质在DKO-1外泌体中占主导地位，而RNA结合是DKs-8外泌体内最常见的组(图2C类和​和22D类). 当使用更严格的<0.01的FDR时，也得到了类似的结果（数据未显示）。这些结果表明，突变的KRAS表达通过用参与细胞粘附、细胞骨架重排和迁移的蛋白质丰富外泌体来改变外泌物含量，这些过程在癌症进展过程中经常发生改变。

LC-MS/MS鉴定的外体蛋白质的确认

为了确认LC-MS/MS结果，对DKs-8、DLD-1、DKO-1 WCL和EXO进行特定候选蛋白的蛋白质印迹分析(图3A类). 与蛋白质组学结果类似（数据集1），KRAS、EGFR、RAP1、SRC（c-SRC）、LYN、β1整合素（ITGB1。相反，α-连环蛋白（CTNNA）在DKs-8外显体中的水平高于DLD-1或DKO-1外显体。Western blotting分析也支持趋势分析，显示α6整合素（ITGA6）、β4整合素(图3B类和​和3三C类). DKO-1中的KRAS、CTTN、EPS8、ITGA6、ITGB4和EPHA2水平显著高于DKs-8外泌体，而CTNNA水平显著低于DKO-1（数据集2和图3A类和​和3三B类). 为了确认等效负载，用Sypro Ruby对外体蛋白凝胶进行染色并成像(图3E类).

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LC-MS/MS结果确认。 A类,B类通过SDS-PAGE解析等浓度的WCL和从DKs-8、DLD-1和DKO-1细胞纯化的等浓度EXO，并用所示抗体进行Western印迹（有关蛋白质浓度，请参阅“实验程序”）。C类蛋白质蛋白质印迹的趋势分析B类使用Jonckheere–Terpstra趋势测试进行趋势分析，并绘制所示蛋白质的结果。这个年-轴表示归一化计数，其等于观察到的计数除以置信标识的总数。结果如下所示B类用于ITGA6（IPI00010697）、ITGB4（IPI00220845）、EPHA2（IPI001267）和EPS8（IPI00337）。D类，KRAS存在于WCL和EXO中。来自DKs-8和DKO-1 WCL和EXO的蛋白质（见补充实验程序）通过SDS-PAGE进行解析，并对WT（LVVVGAGGVGK）和突变（LVVWGDVGK）（G13D）KRAS肽进行靶向LC-MRM分析。WT和突变KRAS肽的浓度标准化为蛋白质输入，并报告为fmol/μg蛋白质。所有实验均至少进行了三次。E类，通过SDS-PAGE解析等蛋白浓度的外泌体，然后用Sypro-Ruby凝胶染色（见补充实验程序）。下面，对DKs-8、DLD-1和DKO-1外泌体的三个生物复制品进行了密度测定。确定了整个车道的综合密度，并计算了平均值（ID）和S.D。没有发现统计学上的显著差异。结果表明，这三种制剂中的外体蛋白水平相当。

外体WT和突变KRAS肽的LC-MRM测定

一项值得注意的发现是，尽管通过LC-MS/MS和Western blot分析确定WCL中的KRAS水平相当，但KRAS蛋白在突变KRAS细胞的外显体中显著富集，而WT KRAS仅在细胞中富集(图3A类，数据集1，数据集2）。这些方法只允许检测KRAS总蛋白，不区分突变蛋白和WT蛋白。因此，为了区分WT和突变型KRAS，我们使用LC-MRM。设计了WT（LVVVGAGGVGK）和突变型（LVV/GAVGK）KRAS的特异性肽（G13D），并测量了DKs-8和DKO-1细胞系及其各自外泌体中突变体和WT KRAS水平(32). 一般来说，KRAS肽在外泌体中比在细胞中更丰富。在DKs-8外泌体中，WT肽的表达量为0.9±0.07 fmol/μg蛋白质，在细胞中，该值为0.56±0.07 fmol/μg蛋白质；而在DKO-1外泌体内，G13D突变肽的表达率为4.1±0.19 fmol/μg蛋白质(图3D类). 结合LC-MS/MS、Western blotting和靶向LC-MRM分析的结果，有力地支持了WT-KRAS的存在和突变KRAS在外泌体中的富集，并使我们推测激活的KRAS可能增强了外泌体内的定位。

外显子被受体细胞内化

由于来自突变型KRAS表达细胞的外泌体含有参与癌症发生和发展的蛋白质，我们假设受体WT KRAS细胞的内化可能会改变细胞行为。为了测试外泌体是否被内化，我们使用亲脂膜扩散染料DiD标记纯化的外泌物，并测量受体细胞对非表面DiD的吸收。具体而言，DiD染色的DKs-8或DKO-1外显子与受体DKs-8和DKO-1细胞孵育1至60分钟。使用流式细胞术测定受体细胞初始平均荧光DiD强度。然后用苏丹红培养细胞，以熄灭细胞表面结合的DiD染色囊泡。重复流式细胞术以量化带有内化DiD染色外显体的细胞百分比(10). 结果表明，培养5分钟后，80%以上的细胞内含有DiD染色的外泌体(图4A类)这表明外泌体被受体细胞迅速内化。

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含有KRAS的外泌体迅速内化。 A类从DKs-8和DKO-1细胞中纯化DiD染色的外泌体，并与受体DKs-8或DKO-1培养指定时间。如文中所述进行流式细胞术分析。统计了一万个事件，并进行了三次实验。B类，与外显体孵育后受体细胞中的外显体标记物增加。将受体细胞与指定的外泌体孵育1 h，并对细胞提取物进行靶向LC-MRM分析。将每个靶肽跃迁的色谱峰面积求和，归一化为β-肌动蛋白内标物的总峰面积，并绘制为归一化MRM强度±S.D.（*表示第页值<0.05）。C类、DKs-8或DKO-1细胞经模拟处理或与指示的DiD染色外泌体孵育30分钟。细胞固定、渗透、Alexa Fluor 488-柱状体染色、贴装并通过共焦显微镜观察。

随后，我们询问在暴露于外泌体1小时后，受体细胞中的外泌体标记物是否增加。外泌体标志物PDCD6IP水平升高(26)、TSG101(10,26,33)和CD9(10)通过靶向LC-MRM在受体细胞中检测到(图4B类). 值得注意的是，ESCRT复合物蛋白PDCD6IP和TSG101在外体内容物的LC-MS/MS分析中得到了鉴定（数据集1）。综合起来，这些数据支持DKs-8和DKO-1受体细胞的胞外体内化和蛋白质结合。基于以前的报告(34,35)我们假设外泌体可能与质膜融合和/或通过内吞作用被受体细胞内吞。未来的研究将检验这些可能性。

为了进一步检查外泌体内化，我们询问通过显微镜是否可以看到DKs-8和DKO-1外泌体内化。DiD染色的DKs-8或DKO-1外显体与受体DKs-8细胞、DKO-1细胞或表达未转化WT-KRAS的大鼠肠上皮细胞系RIE-1孵育30分钟。用阴茎倍体染色法观察受体细胞肌动蛋白细胞骨架。结果表明，培养30分钟后，所有受试细胞都能内化外泌体(图4C类和补充图S4A类). 虽然我们不能排除外泌体群体粘附在质膜外部的可能性，但这三项数据为外泌物的受体细胞内化提供了有力支持。

DKO-1外显子培养后DKs-8细胞中存在突变KRAS

外显体可能通过蛋白质的水平转移在细胞-细胞通信中发挥作用。已证明DKO-1外显体中存在突变KRAS(图3A类和​和3三D类)以及外泌体被受体细胞内化(图4)我们询问外显体是否将突变KRAS转移到只表达WT KRAS的受体细胞。DKs-8和DKO-1细胞被模拟处理或与DKs-8或DKO-1外显体孵育1小时，并使用LC-MRM检测WCL中的G13D和WT肽。为了解释NRAS和HRAS对WT肽信号的相对贡献（LVVVGAGGVGGGK对KRAS、NRAS和HRAS通用），还监测了NRAS/HRAS特异性肽QGVEDAFYTLVR；在不同的实验条件下没有发现变化(图5A类). 与DKO-1细胞来源的外泌体（0.3±0.15 fmol/μg蛋白）孵育后，在DKs-8细胞中检测到G13D突变肽，表明外泌物递送的突变KRAS蛋白掺入。未观察到DKO-1细胞与DKs-8衍生外体孵育后WT肽相应增加(图5B类). 对这一观察结果的一个可能解释是，DKs-8外显子中存在的WT-KRAS肽少于KRASG13D（G13D）DKO-1外泌体中的肽(图3A类和​和3三D类，数据集2）。未观察到WT或G13D肽的其他显著变化(图5A类). 这些结果表明突变KRAS通过外泌体从DKO-1细胞选择性转移到DKs-8细胞。

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DKO-1外显子将突变KRAS转移到DKs-8细胞并增强 三维 非转化细胞的生长。 A类,B类与DKO-1外显体孵育后，DKs-8细胞中存在突变型（G13D）KRAS，而WT-HRAS和NRAS水平不变。将KRAS、HRAS和NRAS肽的浓度归一化为蛋白质输入，并报告为fmol/μg蛋白质。数据绘制为平均值±标准偏差。实验一式三份。与模拟处理的DKs-8对照细胞相比，用DKO-1外泌体处理的DKs-8细胞中G13D突变KRAS肽的水平表示0.00009的p值。C类，如文中所述，将DKs-8和DKO-1细胞接种在胶原基质中。将细胞培养在无血清培养基或补充有所示外泌体的无血清培养液中14天，每周更换相应的培养基两次。三个独立实验一式三份。对菌落数进行量化并绘制图表。数据表示平均值±S.E.（*表示第页< 0.05).D类将RIE-1细胞接种于模拟处理的软琼脂、DKO-1外显体或DKs-8外显体中，培养7天。菌落计数并绘制为平均值±S.E.（*表示第页< 0.01). 三个独立实验一式三份。

DKO-1外泌体增强非转化细胞的三维生长

癌细胞在细胞外基质中分离时相互粘附、存活和增殖的能力对肿瘤进展的早期阶段至关重要(36,37). 我们假设从DKO-1细胞纯化的外泌体表达多种细胞粘附、迁移、细胞骨架蛋白(补充图S1和图2)和突变型KRAS(图3A类和​和3三D类)如果添加到DKs-8细胞中，可以增强其三维生长能力。为了测试这种可能性，DKs-8或DKO-1受体细胞在胶原蛋白凝胶中与无血清培养基或无血清培养液中培养14天，补充DKs-8和DKO-1外体。结果表明，与无血清对照组或DKs-8外显体相比，DKO-1外显体显著增加了DKs-8菌落的数量和大小(图5C类和补充图S4B类). 然而，DKO-1外泌体对DKO-1受体细胞的影响较小，可能是因为产生了相同的蛋白质补体。

此外，我们比较了DKO-1和DKs-8外泌体对未转化WT-Kras表达的大鼠肠上皮细胞系RIE-1的转化作用。细胞在软琼脂中形成凤尾鱼非依赖性菌落的能力是转化表型的标志。RIE-1细胞用模拟处理的软琼脂、DKs-8外显体或DKO-1外显体进行培养。7天后，测量菌落形成；结果表明，细胞与DKO-1外泌体共同孵育时，菌落数量比与DKs-8外泌体内孵育的菌落数量多，具有统计学意义(图5D类)，进一步支持了含有突变KRAS的外泌体增强非转化WT KRAS表达细胞的转化这一观点。综上所述，这些结果强烈表明，改变细胞内的KRAS状态会显著改变其胞外体蛋白质组以及这些胞外体对受体细胞的功能后果。

讨论

外显子参与细胞间信号传导和肿瘤进展的调节；然而，外泌体的含量在正常细胞和癌细胞之间的差异程度以及外泌物传递的信号可能如何变化尚不清楚。为了检测KRAS状态是否影响外显体的组成和行为，我们从DLD-1（突变型和WT KRAS）细胞及其KRAS变异体等基因细胞系DKs-8（仅WT KRA）和DKO-1（仅突变型KRA）中纯化外显体。进行了全面的蛋白质组分析，结果表明KRAS状态显著影响外体组成（数据集1）。从表达突变型KRAS的细胞中纯化的外泌体比从仅表达WT-KRAS细胞中纯化出的外泌物含有更高水平的癌相关蛋白(图2,​,3三A类、和​和3三B类；补充图S1). 这些蛋白质中包括KRAS本身(图3A类). 我们已经证明突变体KRAS在外显子中相对于WT KRAS富集(图3D类). 此外，我们已经证明，从DKO-1细胞纯化的含有突变体KRAS的外泌体将突变体KRA转移到仅表达WT-KRA的受体DKs-8细胞(图5B类). 外显体被DKs-8受体细胞迅速内化(图4A类——4C类)，和DKs-8细胞对含有突变KRAS的外泌体的反应显著增强了三维生长(图5C类和​和55D类；补充图S4B类). 综合起来，我们的结果表明，KRAS的突变可以改变细胞通过外泌体释放的信号，从而为附近含有WT KRAS的细胞带来生长优势。

我们的研究首次在外泌体中特异性检测KRAS(图3A类和​和3三D类，数据集1和2）。Ras家族成员在多种囊泡中被检测到。KRAS与早期内体、晚期内体和溶酶体以及再循环内体相关(38); KRAS和HRAS与Arf6相关的氯氰菊酯非依赖性内体结合(38). 据报道，HRAS和NRAS（而非KRAS）定位于～100nm非浆膜源性细胞质小泡，称为rasosomes(39,40).

从转化细胞纯化的外泌体中发现了HRAS和NRAS(41,42)和尿液(43). 之前通过LC-MS/MS在外显子中检测到HRAS、NRAS和KRAS；然而，该研究没有描述所鉴定的肽，也没有提供进一步的验证(44). 因此，我们不仅通过LC-MS/MS蛋白质组学，而且通过靶向LC-MRM和Western blot分析，首次记录了KRAS在外显体中的存在(图3A类,​,3三D类; 数据集1和2）。此外，我们还发现，当突变型KRAS在供体细胞中表达时，外泌体中的KRAS水平增加(图3A类,​,3三D类; 数据集1和2），表明突变型KRAS定位于外显子的程度比WT KRAS更大，这可能是由激活的突变型KRA自身直接或间接调节的过程。

虽然我们不知道KRAS转运到外泌体的机制，也不知道为什么突变型KRAS优先被靶向外泌体内，但我们提出了几种可能性：质膜聚集的活性KRAS可能诱导转运到外逸体；定位可能通过KRAS的蛋白质修饰而增强，例如KRAS高变区的蛋白激酶C磷酸化，导致其在内膜上积聚(45); KRAS可能与靶向外显体的结合伙伴“背驮”，特别是那些与GTP结合的KRAS相互作用的结合伙伴；最后，在我们喜欢的模型中，KRAS的泛素修饰调节其向外显体的贩运。

最近的一份报告显示KRAS是泛素化的(46). 因为泛素化与外体分选有关(47)根据蛋白质组学在我们的外泌体中检测到的光谱数量，泛素是最丰富的肽之一（数据集1），泛素修饰的活化KRAS可能是针对这些囊泡的特异性靶点。我们的外泌体中确定的蛋白质组与HCT116细胞泛素修饰蛋白质组中发现的蛋白质组的一致性支持了这一假设(48). 这相当于外体鉴定的蛋白质（数据集1）与鉴定的泛素修饰蛋白质有58%的重叠(第页值<0.001）（数据集4）。如果我们估计每个细胞蛋白质数量的下限为～10000(补充实验程序)然后，我们的分析排除了exosome蛋白与泛素修饰蛋白的随机关联。这种重叠的重要性表明这是一种非随机关联(49). 未来的研究将检查KRAS是如何被转运到外泌体的，以及泛素修饰是否调节KRAS和其他蛋白质向外泌体内的转运。

外体蛋白质组分析显示KRAS诱导的其他差异可能具有非细胞自主功能后果。整合素是一类可能促进外源体诱导的细胞粘附效应的蛋白质(50)，迁移(51)，或入侵(10). 许多已鉴定的整合素亚基（ITGB1、ITGA2、ITGAV、ITGA6和ITGB4）（数据集1）以前被报道为外体成分(52)，但我们已经表明，它们的外体组成受突变KRAS的调节。早期的报告显示KRAS对整合素表达或活性的调节支持了这一观察结果。在癌症组织中检测到ITGB1的表达降低(53)G12V突变型KRAS在HD6–4结肠癌细胞中的表达可抑制ITGB1糖基化和细胞-细胞粘附丧失(54). ITGAV亚单位的诱导表达增加黑色素瘤细胞的转移潜能(55)，并且其水平在SW480细胞中反义敲低突变体KRAS后降低(56)，支持KRAS调节其表达的观点。同样，ITGA6–ITGB4复合物的表达在许多癌症中上调，其诱导与浸润性癌的进展相关(55). 缺乏ITGA6–ITGB4复合物的角质形成细胞对Ras转化有抵抗力，表明这些蛋白在癌症进展中起协同作用(57). 综上所述，这些报告支持整合素亚单位和复合物受Ras调控并与Ras合作促进肿瘤侵袭性的观点。未来的研究将确定外显子中整合素亚基或复合物的存在是否也在这一现象中起作用。

在肿瘤邻近组织中发现了大量DKO-1外显子水平较高的蛋白质，包括突变型KRAS、EGFR和SRC(58)这表明，这些蛋白质的异常表达会使组织易于癌症生长，而引入外泌体中包含的其他蛋白质也可能提供生长优势。其中，EPHA2和EPS8水平与癌组织和细胞中突变KRAS的表达呈正相关(59,60)当KRAS转染到肠上皮细胞时，观察到CTNND1磷酸化增强(61). 这些蛋白质可能在赋予外泌体诱导的受体细胞作用中发挥重要作用。此外，在CRC中检测到几个最显著的突变基因(62)在DKO-1外显体中发现了（KRAS、NF1、ARID1A、MSH2、CTTNB1和PIK3R1），使这些蛋白的突变形式的外体传递到邻近组织成为肿瘤可能促进场效应的潜在机制。

场效应被认为可以解释组织学上的非增生性上皮是如何预先适应癌症生长的(63)这似乎是肿瘤微环境提供的生长优势的结果。因为KRAS在结肠癌细胞和组织中经常发生突变(64)并且因为这失调了多种细胞内信号传递过程(65)确定KRAS对场效应的贡献很重要。含KRAS突变体外泌体诱导的非细胞自主效应(图5)提示外泌体可能在突变型KRAS诱导的场效应和肿瘤生态位的建立中发挥作用。

我们假设含有突变KRAS的外泌体可能促进肿瘤生态位发育的一种机制是肿瘤基质的改变。最近，活性Wnt蛋白被发现定位在外显体中，这些外显体激活受体细胞中外源表达Wnt报告子的转录(66). 佩纳多等。结果表明，与对照小鼠的骨髓相比，暴露于黑色素瘤源性外泌体的小鼠骨髓诱导的原发性肿瘤大小和转移数量更大(67). 此外，有报道称癌源性外泌体可促进成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化(68). 鉴于这些报道，我们未来的一个方向是开始分析含有外显子的突变KRAS是否同样改变了肿瘤微环境。我们不能排除肿瘤生态位周围正常细胞的外泌体也可能对肿瘤生长产生抑制作用的可能性。

除了外显体对局部细胞产生场效应外，外显体还可能在远处转移部位诱导非细胞自主效应。当佩吉特首次提出“种子和土壤”假说时(69)，目前尚不清楚什么因素可能会使远处的区域变得肥沃，从而有利于转移性生长。最近，卡普兰等。发现从Lewis肺癌细胞或B16黑色素瘤细胞纯化的条件培养基刺激VEGFR1的迁移+与含血清培养基相比，骨髓源性骨细胞（BMDC）通过Transwell过滤器的程度更大。此外，本研究表明，腹腔注射癌细胞调节培养基可以引导注射癌细胞转移沉积的形成体内(70). 作者假设癌细胞条件培养基中存在的趋化因子或细胞因子负责BMDC的转移生长；然而，鉴于突变型KRAS的外体转移结果(图5B类)并通过突变的含KRAS的外体刺激WT KRAS细胞的三维生长(图5C类和​和55D类；补充图S4B类)，外泌体可能在结肠癌的类似现象中发挥关键作用。

外泌体在癌症中的研究是一个新兴的研究领域，许多问题仍未得到解答。其中包括蛋白质如何靶向外显体，外显体生物生成和摄取的机制是什么，外显体内如何对受体细胞产生作用，以及癌细胞如何利用外显体内容物转移或信号传递来增强肿瘤微环境。本研究通过提供证据阐明了其中几个问题，即供体细胞突变型KRAS表达改变了外体含量，允许突变型KRA以及其他致癌蛋白的外体定位；这些外体蛋白可以转移到受体细胞；含有KRAS的突变体外泌体刺激非转化WT KRAS表达细胞在三维空间中的生长增强。我们假设这些事件允许表达KRAS的突变肿瘤细胞通过场效应改变邻近细胞，并通过播种转移前生态位土壤促进转移进展。

补充材料

补充信息：

致谢

我们感谢Melissa Chambers提供的技术援助，以及Melanie Ohi和Vanderbilt大学结构生物学中心使用TEM。我们也感谢艾米丽·波林（Emily J.Poulin）的编辑协助。

脚注

*这项工作得到了NCI CA46413和GI卓越研究特别计划P50 95103对R.J.C.的支持，2R25CA092043号医学博士，P30 DK058404至J.L.F.，以及U24CA159988和U01CA152647至D.C.L.。范德比尔特大学流式细胞术共享资源由范德比尔特·英格拉姆癌症中心（P30 CA68485）和范德比特消化病研究中心（P30DK05840）提供支持。此外，我们承认范德比尔特细胞成像、流式细胞术、蛋白质组学和DDRC的新型细胞系开发核心（P30 DK58404）。

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1使用的缩写如下：

CRC公司
结直肠癌
做
1,1′-二十八烷基-3,3,3′，3′-四甲基吲哚二碳菁
表皮生长因子受体
表皮生长因子受体
韩国S.M Entertainment于2012年正式推出的12人男子组合EXO
外体
财务总监
错误发现率
物料需求管理
多元反应监测
WCL公司
全细胞裂解物
重量
野生型。

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文章来自分子和细胞蛋白质组学：MCP由以下人员提供美国生物化学和分子生物学学会