Proteomic analysis of exosomes from mutant KRAS colon cancer cells identifies intercellular transfer of mutant KRAS

doi:10.1074/mcp.M112.022806

.2013年2月；12(2):343-55.

doi:10.1074/mcp。M112.022806。 Epub 2012年11月15日。

突变型KRAS结肠癌细胞外泌体的蛋白质组分析确定突变型KRA的细胞间转移

米歇尔·德莫里·贝克勒¹, 詹姆斯·希金波坦, 杰弗里·富兰克林, Amy-Joan火腿, 帕特里克·J·哈维, 图像E图像, 科尔宾·惠特威尔, 李明（音）, 丹尼尔·利伯勒, 罗伯特·J·科菲

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内政部： 10.1074/mcp。2006年12月12日

突变型KRAS结肠癌细胞外泌体的蛋白质组分析确定突变型KRA的细胞间转移

米歇尔·德莫里·贝克勒等。分子细胞蛋白质组学. 2013年2月.

.2013年2月；12(2):343-55.

doi:10.1074/mcp。M112.022806。 Epub 2012年11月15日。

作者

米歇尔·德莫里·贝克勒¹, 詹姆斯·希金波坦, 杰弗里·富兰克林, Amy-Joan火腿, 帕特里克·J·哈维, Imade E Imasuen公司, 科尔宾·惠特威尔, 李明（音）, 丹尼尔·利伯勒, 罗伯特·J·科菲

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¹美国田纳西州纳什维尔范德比尔特大学医学中心医学部，邮编37232。

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摘要

30%至40%的结直肠癌发生KRAS激活突变。突变型KRAS如何改变癌细胞行为已被深入研究，但对突变型KRA的非细胞自主效应知之甚少。我们最近报道，与从野生型KRAS表达细胞纯化的外泌体相比，从表达突变KRAS的结肠癌细胞中分离的外泌物体增强了受体细胞的侵袭性，这使我们推测突变KRAS可能通过调节外泌物体的组成和行为来影响邻近和远处的细胞。在此，我们展示了对含有野生型和G13D突变KRAS等位基因和等基因匹配衍生细胞系、DKO-1（仅突变KRAS等位基因）和DKs-8（仅野生型KRAS等位基因）的亲本DLD-1细胞外显子的综合蛋白质组学分析结果。突变KRAS状态显著影响外体蛋白质组的组成。突变KRAS细胞的外显子包含许多促肿瘤蛋白，包括KRAS、EGFR、SRC家族激酶和整合素。DKs-8细胞内化DKO-1外泌体，值得注意的是，DKO-1外泌体将突变的KRAS转移到DKs-8肿瘤细胞，从而促进这些表达野生型KRAS的非转化细胞的三维生长。这些结果对突变KRAS的非细胞自主效应，如场效应和肿瘤进展具有重要意义。

PubMed免责声明

数字

**图1。**
**从DKs-8、DLD-1、，** **DKO-1细胞具有外体特征。** A类，通过本文所述的差速离心法从DKs-8、DLD-1和DKO-1细胞的条件培养基中纯化外显子。100微克的全细胞裂解物（WCL）蛋白和10微克的外显子（EXO）蛋白通过SDS-PAGE溶解，并用所示抗体进行蛋白质印迹。实验至少进行了三次。B类，DKs-8和DKO-1细胞的两个独立外显体制剂被负染并通过TEM观察。具有代表性的场图像显示具有外泌体特征的光滑碟状形态的囊泡（左图）。根据TEM图像计算200个囊泡的平均直径，并绘制每个10 nm大小组的外显子频率（右侧面板）。DKs-8的平均直径为59.2 nm±14.2 nm，DKO-1的平均直径是56.3 nm±17.9 nm。比例尺表示100 nm。

**图2。**
**外泌体的蛋白质组分析。** A类，维恩图表示通过LC-MS/MS在所示外显体中识别的蛋白质组的存在、缺失或重叠。B类，热图表示DKs-8中显著上调和下调的蛋白质与DKO-1成对分析（见正文）。数据根据组间差异大于3倍且FDR<0.05的相对水平和鉴定的蛋白质进行分类。这些蛋白质包括DLD-1外体蛋白水平的差异。红色代表上调的蛋白质，绿色代表下调的蛋白质。C类,D类、蛋白质分类鉴定。蛋白质(C类)相对于DKs-8外显体，DKO-1外显体上调或(D类)根据Uniprot鉴定的功能，对DKs-8外显体相对于DKO-1外显体的上调进行分类。使用的统计标准是FDR<0.05，比率>3。结果绘制为饼图。含有总蛋白质不到2%的分类被归类为杂类。

**图3。**
**LC-MS/MS结果确认。** A类,B类通过SDS-PAGE解析等浓度的WCL和从DKs-8、DLD-1和DKO-1细胞纯化的等浓度EXO，并用所示抗体进行Western印迹（有关蛋白质浓度，请参阅“实验程序”）。C类蛋白质蛋白质印迹的趋势分析B类使用Jonckheere–Terpstra趋势测试进行趋势分析，并绘制所示蛋白质的结果。这个年-轴表示归一化计数，其等于观察到的计数除以置信标识的总数。结果符合中所示的趋势B类用于ITGA6（IPI00010697）、ITGB4（IPI00220845）、EPHA2（IPI001267）和EPS8（IPI00337）。D类，KRAS存在于WCL和EXO中。来自DKs-8和DKO-1 WCL和EXO的蛋白质（见补充实验程序）通过SDS-PAGE进行解析，并对WT（LVVVGAGGVGK）和突变（LVVWGDVGK）（G13D）KRAS肽进行靶向LC-MRM分析。WT和突变KRAS肽的浓度标准化为蛋白质输入，并报告为fmol/μg蛋白质。所有实验均至少进行了三次。E类，通过SDS-PAGE解析等蛋白浓度的外泌体，然后用Sypro Ruby凝胶染色（见补充实验程序）。下面，对DKs-8、DLD-1和DKO-1外泌体的三个生物复制品进行了密度测定。确定了整个车道的综合密度，并计算了平均值（ID）和S.D。未发现有统计学意义的差异。结果表明，这三种制剂中的外体蛋白水平相当。

**图4。**
**含有KRAS的外泌体迅速内化。** A类从DKs-8和DKO-1细胞中纯化DiD染色的外泌体，并与受体DKs-8或DKO-1培养指定时间。如文中所述进行流式细胞术分析。统计了一万个事件，并进行了三次实验。B类，与外显体孵育后受体细胞中的外显体标记物增加。将受体细胞与指定的外泌体孵育1 h，并对细胞提取物进行靶向LC-MRM分析。将每个靶肽跃迁的色谱峰面积求和，归一化为β-肌动蛋白内标物的总峰面积，并绘制为归一化MRM强度±S.D.（*表示第页值<0.05）。C类，对DKs-8或DKO-1细胞进行模拟处理或与指示的DiD染色的外泌体孵育30分钟。将细胞固定、透化、用Alexa Fluor 488鬼笔肽染色、安装并通过共聚焦显微镜观察。

**图5。**
**DKO-1外显子将突变KRAS转移到DKs-8细胞并增强** 三维 **非转化细胞的生长。** A类,B类与DKO-1外显体孵育后，DKs-8细胞中存在突变型（G13D）KRAS，而WT-HRAS和NRAS水平不变。将KRAS、HRAS和NRAS肽的浓度归一化为蛋白质输入，并报告为fmol/μg蛋白质。数据绘制为平均值±标准偏差。实验一式三份。与模拟处理的DKs-8对照细胞相比，经DKO-1外显子处理的DKs-8细胞中G13D突变KRAS肽的水平代表0.00009的p值。C类如文中所述，DKs-8和DKO-1细胞被镀在胶原基质中。将细胞在无血清培养基或补充有所示外泌体的无血清培养基中培养14天，并每周更换两次相应的培养基。三个独立实验一式三份。对菌落数进行量化并绘制图表。数据表示平均值±S.E.（*表示第页< 0.05).D类将RIE-1细胞接种于模拟处理的软琼脂、DKO-1外显体或DKs-8外显体中，培养7天。菌落计数并绘制为平均值±S.E.（*表示第页< 0.01). 三个独立实验一式三份。

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