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美国国家科学院程序。2012年5月29日；109(22): 8658–8663.
2012年5月14日在线发布。 数字对象标识：10.1073/pnas.1201629109
预防性维修识别码：项目经理3365156
PMID：22586098

Yno1p/Aim14p是一种NADPH氧化酶同源物，控制酵母线粒体外活性氧的生成、凋亡和肌动蛋白电缆的形成

马克·林纳塔勒,一 萨布丽娜·贝特纳,b条 彼得·朗,一 吉诺·海伦,c（c） 托马斯·费尔德,c（c） 哈拉尔德·克林格,一 马丁·温伯格,d日 克劳斯·斯托尔泽,e（电子） 托马斯·格劳斯,（f） 吉里·哈塞克,（f） 奥尔德里奇·贝纳达,（f） 伊万娜·弗莱德洛娃,（f） 安德烈亚·克洛克,一 比吉特·西蒙·诺布,一 贝蒂娜·扬斯科,一 汉内洛尔·布雷滕巴赫-科勒,一 托比亚斯·艾森伯格,b条 坎贝尔·W·古雷,克 研究者马代奥,b条 威廉·C·伯汉斯,日期：，1和迈克尔·布雷滕巴赫a、，1
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关联数据

补充资料

摘要

NADPH氧化酶（NOX酶）的大蛋白超家族存在于所有真核生物界的成员中：动物、植物、真菌和原生生物。这些氮氧化物酶的生理功能从防御到专门的氧化生物合成和信号传导。在丝状真菌中，NOX酶参与信号细胞分化，尤其是子实体的形成。根据生物信息学分析，到目前为止，人们认为单细胞真菌的基因组像酿酒酵母和葡萄裂殖酵母没有编码NOX酶的基因。然而酿酒酵母包含九个ORF，显示出与哺乳动物NOX酶催化亚单位的序列相似性，其中只有一些在功能上被指定为参与铁离子运输的铁还原酶。这里我们显示，九个ORF中的一个（YGL160W，AIM14）编码一个真正的NADPH氧化酶，该氧化酶位于内质网（ER）中，并以NADPH依赖的方式产生超氧物。我们重命名了这个ORFYNO1公司（酵母NADPH氧化酶1）。的过度表达YNO1公司导致YCA1依赖性凋亡，而基因的缺失使细胞对凋亡刺激不太敏感。一些独立的证据表明，Yno1p产生的活性氧物种（ROS）对肌动蛋白细胞骨架的调节。

关键词：细胞周期，整体膜还原酶，wiskostatin，latrunculin

活性氧（ROS）在生理学和病理生理学中具有多重作用，特别是在衰老和程序性细胞死亡诱导过程中。除了长期研究的线粒体生成的活性氧外，这还包括非线粒体来源。这些发现可以被视为对经典“衰老自由基理论”的重要补充(1)以及后来发展起来的理论(2,三).

在高等生物中，除线粒体外，至少有两种主要的超氧物来源是已知的。一方面，黄嘌呤氧化酶是嘌呤分解代谢中的一种酶，它催化次黄嘌呤s氧化为黄嘌呤斯和尿酸，产生超氧物(4). 另一方面，NADPH氧化酶（NOX）催化氧和NADPH产生超氧物(5).

高级细胞膜定位酶的NADPH氧化酶超家族已有十年的历史（参考文献。5). 虽然人类NOX2很早就被发现，但其他NOX（Nox1/3/4/5）和双氧化酶（DUOX）（Duox1/2）酶（显示两个域：NADPH氧化酶域和过氧化物酶域）最近才在人类细胞中发现。人类NOX2被发现是中性粒细胞和巨噬细胞的一种防御酶，可以产生大量的超氧物（O2·−)作为抵御微生物入侵的第一道防线。虽然X射线或核磁共振结构测定不可用，但我们从间接证据和生物信息学中得知，巨噬细胞酶的催化亚单位包含六个跨膜螺旋，位于质膜中，并以向量方式向吞噬体腔产生超氧物，它在细胞的细胞质空间之外。事实上，所有已知的NOX酶都是膜结合的，以向量方式传递超氧物。然而，并非所有NOX酶都位于质膜中。例如，在几个相互矛盾的报告中，人类NOX4被报道定位于内质网（ER）、细胞核或线粒体(6，供审查，参考。7). NADPH氧化酶需要三种不同的氧化还原辅因子，即两种紧密结合的b型血红素，FADH2和NADPH，它们被脱氢酶结构域结合(5,6). NOX催化亚基的一般结构和机制特征在不同的NOX酶之间似乎相对保守；然而，它们以不同的方式进行调节，要么通过调节亚单位，要么通过钙离子。钙依赖性调节被假设为，在某些情况下，实验证实是通过EF手基序发生的，EF手基序存在于NOX5和DUOX酶中(8).

NOX（和DUOX）酶的直接产物（假定或直接测量）是超氧自由基阴离子，但它被代谢为其他ROS分子（过氧亚硝酸盐、H2O（运行）2、次氯酸盐和羟基自由基），在NOX2的情况下与防御相关(9). 其他氮氧化物酶具有更特殊的代谢功能。来自NOX酶的ROS（超氧物和过氧化氢）的信号功能在文献中越来越多地被讨论(5).

NOXA、-B和-C亚家族的真菌NOX酶及其生理作用是最近才发现的(10，供审查，参考。11). 丝状真菌柄孢霉,粗糙脉孢菌(12)和社会阿米巴盘状白屈菜(13)可以证明表达NADPH氧化酶，这些酶能产生超氧物(14). 删除PaNOX1对生长没有影响，但完全阻止子实体的形成(14). 真菌NOX酶主要产生ROS作为多细胞通讯协调的第二信使(14). 然而，到目前为止，在半丝酵母菌中还没有基因或酶被指定为产生超氧化物的NADPH氧化酶(10,15).

在这项工作中，我们提供了酵母酿酒酵母产生由ORF编码的NADPH氧化酶，YGL160W(AIM14型). 我们证明这种酶具有真菌NADPH氧化酶的所有生化特性，因此将其重命名YNO1公司（酵母NADPH氧化酶1）。过度表达导致ROS的产生，导致Yca1p依赖性细胞凋亡。该基因的缺失导致对凋亡刺激的抵抗以及对wiskostatin和latrunculin B的超敏反应，表明Yno1p在调节肌动蛋白细胞骨架中的作用。

结果和讨论

假定NADPH氧化酶同源物的酵母基因组编码：Yno1p。

NOX/整体膜还原酶（IMR）超家族的常见结构特征包括N末端六或七个跨膜螺旋，其中两个包含两个严格保守的组氨酸残基，负责协调两个光谱上不相同的b型血红素基团。C端细胞质球状结构域包含FADH的结合位点2和NADPH(图1A类). 利用人NOX2对酵母基因组的催化亚基序列进行的位置特异性迭代（PSI）-BLAST分析表明，酵母铁还原酶中可以发现NOX酶的所有特征，这些酶与NADPH氧化酶一样，是经证实的黄细胞色素b558(16). 我们的结论是，在大型NOX蛋白超家族中，功能多样性得到了发展，并且出现了一种新的功能（铁还原酶或更广泛地说，IMR）(11). 在酵母中法国铁路公司与人类NOX酶最接近的亚家族是酵母ORF YGL160W，与NOX5（氮氧化物）NADPH烟酰胺部分的结合位点YNO1公司与DUOX酶的相应序列相同(图1B类).

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Yno1p（YGL160W）的生物信息学预测。(A类)使用Phillius跨膜预测算法预测Yno1p的二级结构，如SI材料和方法跨膜螺旋以黄色突出显示；管腔区域，可能位于ER的管腔中，以绿色突出显示；细胞质区域以蓝色突出显示。负责协调两个血红素基团的四个保守组氨酸残基用红色字母标记。NADPH结合位点用黄色字母标记，FAD结合位点用紫色字母突出显示。(B类)各种生物体双氧化酶（DUOX）烟酰胺结合位点的序列比对。序列“FSCGP”对DUOX酶和Yno1p具有特异性。

在NOX/IMR超家族的系统发育树中，FRE1–FRE7聚集在一起，而FRE8公司和YNO1公司与FRE基因距离稍远，与动物NOX5序列关系更密切(图S1). 铁还原酶的功能已被证明FRE1公司–FRE4公司(17)，并且发现铁（或铜）依赖的转录控制FRE1公司–FRE7公司(18,19).FRE8公司和YNO1公司聚集在一起，既不受铁的转录控制，也不依赖于铁的增加来促进生长(18).

Yno1p不起铁还原酶的作用。

为了测试Yno1p可能具有铁还原酶活性以帮助铁吸收从而产生超氧物的可能性，我们测定了过表达的菌株中的总铁和可溶性铁YNO1公司并将结果与携带空向量的控件进行了比较(图S2). 显然，过度表达YNO1公司没有导致细胞中铁的大量积累。从过度表达菌株分离的微粒体YNO1公司，表明NADPH氧化酶活性水平较高（见下文），在检测铁还原酶活性时，无论是否存在Yno1p，其活性都很弱(20) (图S3). 综上所述，铁还原酶活性测量、铁摄取数据、系统发育树构建和上述转录调控数据均不支持Yno1p的铁还原蛋白酶功能。

Yno1p产生超氧阴离子。

为了阐明由YNO1公司或者八种酵母中的任何一种法国铁路公司基因具有产生超氧化物（O2·−)正如真正的NADPH氧化酶一样，所有9个基因都被克隆到表达载体pCM297中，受严格调控但相对较弱的强力霉素诱导启动子控制(19,21). 将所有这些构建体转化到酵母菌株BY4741中，该菌株生长到中期暴露期。此后，加入100mg/L的多西林以诱导待测基因的表达。分别在6小时和16小时后，用二氢乙硫酸氢钠（DHE）测定超氧化物水平。与用空载体pCM297转化的野生型菌株BY4741相比，YNO1公司是唯一一个被测试的酵母基因，它发出一个微小但显著的阳性信号，表明DHE氧化增加50%(图S4).

为了进一步的实验，酵母YNO1公司以及PaNOX1基因（阳性对照）和FRE1公司,FRE3公司、和FRE8公司将基因亚克隆到表达载体pYES2中，携带强大的GAL1启动子以诱导所选基因的高表达。这些结构的表达证实了通过在pCM297中表达获得的结果。过度表达YNO1公司导致ROS水平增加约五到九倍。控制应变PaNOX1荧光信号强度增加了两倍FRE8公司ORF公司。FRE1公司和FRE3公司显示ROS水平与表达空载体的野生型菌株相当(图2A类).

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(A类)半乳糖诱导后过表达假定NADPH氧化酶的活酵母菌株和对照中荧光的定量测定。通过测量用pYES2载体pYES1转化的BY4741细胞中氧化DHE来测定活性氧的产生-FRE1公司，第2页-FRE3公司，第2页-YNO1公司，第2页-FRE8公司，和pYES2-PaNOX1。请参阅表S1用于确定统计显著性。(B类)使用自旋阱DEPMPO的体内ESR测量结果(22). 标有箭头的线是针对超氧化物加合物的。上部谱对应于用空矢量变换的BY4741。下部在半乳糖诱导pYES2后获得光谱-YNO1公司用三个生物复制品分别记录这两种光谱。比较超氧化物特异性条带的信号强度表明，它们与双尾P（P）值0.0057。

DHE分析对超氧化物非常敏感，但并非绝对特异(21). 因此，我们还使用自旋阱5-（二乙氧基磷酰基）-5-甲基-1-吡咯烷N-氧化物（DEPMPO）进行了ESR测量，以更直接地检测超氧化物，DEPMPO形成稳定的自由基加合物，其共振光谱对超氧化物具有特异性(22). 室温下在体内记录ESR光谱。过表达空载体的野生型细胞只产生背景水平的DEMPPO信号。然而，菌株的细胞过度表达YNO1公司产生超氧自由基阴离子的强信号特征(图2B类和表S1).

使用与上述相同的DHE荧光分析yno1Δ菌株在YPD、SC-葡萄糖、SC-棉子糖和SC-半乳糖上生长后，也在相同条件下进行了测试。重复性和显著性，缺失菌株产生的信号比未转化WT菌株弱约20%(图3A类). 这表明，在指数增长条件下，Yno1p约占总ROS产量的20%，并且还存在其他ROS来源。我们假设缺失菌株能够抵抗外部施加的氧化应激。在含有过氧化氢、二酰胺或叔丁基过氧化氢的SC板上发现缺失菌株和WT菌株在不同稀释液中的十毫升等分样品。事实上，缺失菌株对过氧化氢的抗性高于野生型菌株(图3B类). 缺失菌株在含有二胺或叔丁基过氧化氢的平板上的敏感性没有变化(图S5).

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(A类)WT中的ROS产量（灰色条）和yno1Δ（开条）单元格。如图所示，使用了四种不同的培养基。在这四个实验中的每一个实验中，在yno1Δ与WT细胞相比。(B类)yno1Δ电池表现出明显的5mM H电阻2O（运行）2，完全抑制WT细胞的生长。WT和yno1Δ在SC−葡萄糖和SC−葡萄糖+5mM H上发现细胞2O（运行）2培养基，2 d后评分。

体内Yno1p介导的超氧化物生成依赖于NADPH。

我们想测试YNO1公司过度表达菌株依赖于细胞的NADPH水平。在酿酒酵母,ZWF1型葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的编码，这是一种对戊糖磷酸途径的第一步和速率限制步骤进行催化的酶，戊糖磷酸是一种生成NADPH的反应。缺少细胞ZWF1型NADPH水平降低(23). A类zwf1Δ应变过度表达YNO1公司与携带空载体的野生型或缺失菌株相比，活性氧没有增加，表明Yno1p活性很可能在体内依赖NADPH(图S6).

Yno1p定位于核周ER。

先前对人类细胞中NADPH氧化酶的研究表明，NOX酶定位于各种膜，如质膜、ER或线粒体膜(6,7). 为了确定Yno1p的亚细胞定位，我们构建了一个在组成成分控制下表达的Yno1p和eGFP的C末端融合蛋白MET25型pUG35载体中的启动子。在表达融合蛋白的细胞中，观察到清晰的核周GFP信号(图4; 与参考文献进行比较。24). 同时表达HDEL-RFP(25)在核周ER中显示Yno1-GFP与HDEL-RFP共定位(图S7).

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富培养基上生长中期的两个活细胞及其大子体的荧光显微照片。(A类)Yno1–eGFP融合蛋白的定位。(B类)细胞核和线粒体DNA用DAPI染色。(C类)通过相差显微镜观察到相同的细胞。(D类)的覆盖A类–C类融合蛋白的核周位置清晰可见。

为了在半乳糖控制下对过度表达全长非融合Yno1p的菌株的细胞进行生化定位，用玻璃珠破碎细胞，并通过差速离心获得组分。如上所述，进行DHE荧光分析，以测量微粒体组分（100000×克颗粒）来自用空载体转化的细胞和过度表达的细胞YNO1公司.用电子显微镜对微粒体进行了表征(图S8). 如所示图5，微粒体部分含有Yno1p酶活性，其在体外是NADPH依赖性的，并被二苯碘氯化铵（DPI）抑制(26)，表明是真正的NADPH氧化酶，并证实了Yno1–eGFP融合蛋白的结果。微粒体显示出以NADH作为辅因子的残留活性。注意，一些黄细胞色素b，如人类NOX2酶，也对NADH表现出弱亲和力，而NOX4和NOX5对NADPH是特异性的(27). 微粒体显示出一种不被DPI抑制的微小NADPH依赖性残留活性，这可能是由于存在除Yno1p以外的微粒体氧化还原酶。当我们比较4500×克用纯化微粒体中的活性离心，我们观察到显著的富集(SI结果)表明大多数酶位于微粒体中。除18000×克含有微粒体的上清液显示DHE荧光水平降低(图S9).

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用DHE荧光法测量纯化微粒体中的ROS。（灰条）仅含有载体的菌株的微粒体（载体控制）。（开杆）半乳糖对照下表达Yno1p的菌株。(A类)在NADPH存在下微粒体部分检测NADPH氧化酶活性；NADH的活性较弱。(B类)添加DPI可抑制NADPH依赖性活性。在没有添加NADPH的情况下，残留DHE氧化也被DPI抑制。

YNO1公司过度表达依赖酵母半胱天冬酶导致细胞死亡YCA1公司.

为了研究Yno1p对酵母细胞生理学的影响，我们首先测试了细胞生长(图S10). 与WT相比，a雷诺1缺失菌株在标准培养基（合成完全，SC）上表现出正常生长(图S10A类). Yno1p的过度表达导致增长大幅放缓(图S10B类)其原因是诱导细胞凋亡和坏死，如下所示。然而，生长并没有被过度表达的YNO1公司在一个yca1Δ应变，应变(28,29)表明细胞死亡YNO1公司过度表达依赖于功能性Yca1p半胱天冬酶(图S10C类).

接下来，我们在刚才讨论的相同菌株中检测了凋亡和坏死标记物(图6). 结果表明，当Yno1p被表达时，在固定相7-d培养基上的克隆原性显著下降，表明时间老化增加。然而，删除YCA1公司(图6A类)，证实了图S10测量凋亡和坏死标记物表明，细胞通过YCA1型删除(图6C类和D类)，尽管ROS产量在yca1Δ应变过度表达YNO1公司第2天(图6B类). 后一种效应依赖于时间，在存活曲线结束时（第7天）yca1ΔYNO1过度表达的菌株似乎更低。检测的凋亡标记的显微图像如所示图S11。综合来看，结果如所示图6和图S10和第11节确定Yca1p作用于Yno1p产生的活性氧的下游。

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过表达的稳定期细胞的存活率、凋亡表型和芽指数YNO1公司细胞在SC棉子糖中预培养；的表达式YNO1公司用3%（wt/vol）半乳糖诱导pYES2质粒，测定其存活率、凋亡表型和稳定期芽指数。(A类)废培养基中7-d培养的时间老化（固定相存活）及其通过灭活YCA1公司. (B类)在固定相中测量同一电池随时间的ROS生成A类.截至第2天，ROS生产在yca1Δ,YNO1公司尽管凋亡表型较低，但过表达株较高(A类,C类、和D类). 稍后在静止阶段yca1Δ菌株表现出较低的活性氧水平。(C类)在固定相的第2天，在相同的四个菌株中进行TUNEL测量。隧道+在过度表达的菌株中，表明DNA链断裂的细胞数量更多YNO1公司，但当YCA1型已删除。(D类)在静止期（第2天）用膜联蛋白V和碘化丙啶（PI）在相同的四个菌株中染色的测量。的过度表达炔诺1导致AnnexinV和PI的高水平染色，这表明存在凋亡和坏死细胞。如果YCA1公司已删除。(E类)固定相中芽指数（成芽细胞百分比）的测定。的过度表达YNO1公司通过从含有2%（wt/vol）棉子糖的培养基转移到含有2%（wt/vol，棉子糖+3%（wt/vol，半乳糖）的培养基，将细胞生长到固定相，并将其保存在废培养基中7天，诱导细胞生长。将转化为空载体的细胞作为对照。3天后，稳定培养物中约8%的细胞过度表达YNO1公司与对照组中检测到的～3%的出芽细胞相比，仍保持出芽。

接下来，我们在有或无Yno1p过度表达的静止WT细胞中测试了出芽指数。如所示图6E类3天后，WT中出现少量的出芽细胞，但在YNO1公司过度表达的菌株，细胞开始新的细胞周期，尽管缺乏营养。这与YNO1公司过度表达，表明Yno1p产生的ROS产生了启动新细胞周期的信号。

Yno1p产生的ROS独立于线粒体呼吸链，不会导致内质网应激。

我们想确定ROS产量的显著增加是否YNO1公司过度表达的菌株需要一个功能性呼吸链。删除AFO1公司(30)线粒体核糖体蛋白导致细胞完全缺乏线粒体DNA（ρ0)与标准ρ相比，其ROS水平也很低0用溴化乙锭处理后分离出的菌株。因此，该应变非常适合于此测量。结果表明，功能性呼吸链（在ρ中缺失0Yno1p生产ROS不需要菌株(图S12A类).

衣霉素诱导内质网应激和WT酵母高活性氧(31)这可能导致细胞凋亡。如所示图S12B类，该效应与Yno1p无关。因此，Yno1p对内质网应激没有显著影响。这一发现也与以下观察结果一致：yno1Δ菌株对还原剂二硫苏糖醇（DTT）既没有耐药性，也没有敏感性，这会导致内质网中未折叠蛋白的积累，并导致内质网应激(图S13). 我们得出结论，Yno1p产生的ROS与线粒体呼吸和线粒体ROS的产生无关。我们还得出结论，在这种情况下，Yno1p对线粒体的直接影响很弱或不存在，反之亦然，这与NOX酶和线粒体之间存在串扰的高等细胞形成了鲜明对比(32). 此外，由于内质网应激和未折叠蛋白在内质网中的积累，这种内质网膜定位酶产生的ROS独立于ROS的产生。

荧光肌动蛋白电缆生物合成中Yno1p产生的活性氧与成核和伸长步骤的相互作用。

以前的全基因组筛查(33)确定了yno1Δ菌株对wiskostatin过敏，表现出合成致死性yno1Δ杂合性缺失行为1，酵母单倍体基因组上唯一的肌动蛋白编码基因(34). Wiskostatin是一种与Wiskott-Aldrich综合征蛋白（WASP）相互作用的药物，从而阻止F-actin电缆的成核。我们证实了这一高通量结果，并确定了无毒浓度的H2O（运行）2部分逆转wiskostatin的毒性作用(图7A类). 注意H2O（运行）2在所用条件下不会氧化wiskostatin。

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(A类)删除雷诺1引起了对wiskostatin的超敏反应，而wiskosstatin被H的外部暴露所抑制2O（运行）2WT稀释和yno1Δ在SC−葡萄糖、SC−糖+wiskostatin和SC−葡糖+wiskostatin+H上发现菌株2O（运行）2.添加低无毒量的H2O（运行）2培养基使缺失株的超敏细胞在wiskostatin的抑制浓度下生长。(B类)用Abp140-GFP观察F-Actin；删除雷诺1在20μM的浓度下对latrunculin B（F-actin电缆伸长抑制剂）引起超敏反应，这不会抑制WT.H中F-actin的电缆伸长2O（运行）2latrunculin B对肌动蛋白电缆的反向抑制。因此，Yno1p产生的活性氧是F-actin调节所必需的。

已经确定了肌动蛋白细胞骨架的其他抑制剂(33)包括latrunculin B，一种F-actin电缆伸长抑制剂(35). 用20μM latrunculin B培养10分钟后yno1Δ突变体完全失去了F-actin电缆，但没有F-actin补丁（在细胞周期的这个阶段的子细胞中）。在相同条件下，WT细胞外观保持完全正常。通过添加低浓度的H可以有效地逆转latrunculin B对突变体的影响2O（运行）2，不会抑制细胞生长(图7B类). 我们得出结论，Yno1p通过产生ROS与F-actin在功能上相互作用炔诺1在这种相互作用中很可能是供应H2O（运行）2通过其初级产物超氧物生成。事实证明，在哺乳动物系统中，NOX产生的活性氧能够调节肌动蛋白细胞骨架，这一事实进一步证实了这一结论(36).

结束语。

我们在这里显示Yno1p酿酒酵母是一种NADPH氧化酶，可产生超氧物和间接H2O（运行）2九个中的两个酿酒酵母NOX/IMR超家族成员Fre8p和Yno1p是本通讯中描述的蛋白质，它们聚集在由两种不同方法构建的系统发育树中不同于其他七种Fre酶的位置（参考文献。11、本文和图S1). Yno1p和Fre8p也与Fre1-7p不同，因为它们不参与铁还原和吸收。Yno1p的另一个显著特征是，这种蛋白质的过度生产，而不是Fre1-Fre7p的过度生产会导致整个基因组筛查中确定的生长缓慢(37)在本研究中(图S10). 这些菌株生长缓慢可以用凋亡和坏死细胞死亡来解释。

鉴别Yno1p是否为真正的NADPH氧化酶的其他标准是，它受到DPI的抑制，对NADPH的依赖性，以及预测七个跨膜螺旋的序列信息，四个可协调两个血红素b基团的保守组氨酸残基，以及一个含有FAD和NADPH结合位点的球状C末端区域(图1).FRE8公司过表达导致微弱但显著的超氧化物生成，而其他七种法国铁路公司过表达后的基因产生的活性氧水平等于WT或未诱导的酵母细胞。

有力的（尽管是间接的）证据表明，Yno1p在调节细胞肌动蛋白细胞骨架方面具有生理功能。这个yno1Δ突变体对抑制F-actin电缆成核的wiskostatin和抑制F-actim电缆伸长的latrunculin B表现出超敏反应。在这两种情况下，通过添加相对较小的无毒浓度的H可以挽救表型2O（运行）2。这表示中缺少函数yno1Δ细胞是ROS的产物，在信号传递中起作用。考虑到细胞中有许多其他活性氧来源，这是怎么可能的？虽然这个有趣的问题的答案必须等待未来的研究，但它可能与细胞周期中不同种类ROS在空间和时间上的划分有关。这种可能性与观察到的过度表达YNO1公司导致固定相中的芽细胞显著增加。

材料和方法

菌株BY4741(材料αhis3Δ1 leu2Δ0 ura3Δ0 met15Δ0)和各自的淘汰赛YNO1公司基因（欧洲酿酒酵母功能分析档案）在SC培养基中生长(20)以2%（wt/vol）葡萄糖为碳源，用于大多数实验。的过度表达炔诺1将其作为PmeI/PmeI片段克隆到半乳糖诱导的pYES2酵母表达质粒（Invitrogen）中，并在3%半乳糖上培养菌株，从而获得其同源物。为了可视化肌动蛋白细胞骨架，菌株SEY中ABP140–eGFP的基因组整合(材料一his3Δ200 leu2-312 ura3-52 trp1-Δ901 lys2-801 suc2Δ9)已使用。将Latrunculin B（Sigma）添加到最终浓度为20μM的培养基中。使用配备有哈马松Orca/ER数码相机和Cell R检测系统的Olympus IX-71倒置显微镜进行荧光显微镜检查。如前所述，在Anthos Zenyth 3100平板阅读器中使用DHE在体内进行ROS（超氧物）测定(20). 如参考文献所述，测定了凋亡标记物和时间寿命。27有关材料和方法的更详细描述，包括统计分析，请参见SI材料和方法.

补充材料

支持信息：

致谢

我们感谢Dan Kosman在铁还原酶测定方面的帮助，感谢Philippe Silar提供PaNOX1cDNA。这项工作得到了奥地利科学基金（FWF）拨款S9302-B05（发给M.B.）、T414-B09（发给S.B.）、S9304-B05、LIPOTOX、DK-MCD W 1226-B18和P23490-B12（发给F.M.）的支持；P24381-B20（至F.M.和T.E.）；欧盟委员会（布鲁塞尔）线粒体在保守衰老机制（MIMAGE）项目中的作用（合同512020，发给M.B.）和国家癌症研究所对罗斯韦尔公园癌症研究所的支持拨款（P30CA016056）；以及医学研究理事会（联合王国）职业发展研究金78573（致C.W.G）。J.H.和O.B.获得了CSF204/09/1924、MEB 060902、7AMB12ATOO2的支持；LC545（捷克共和国）支持T.G.和I.F。

脚注

作者声明没有利益冲突。

这篇文章是PNAS直接提交的。

本文包含在线支持信息，网址为www.pnas.org/lookup/supl/doi:10.1073/pnas.1201629109/-/DC补充.

工具书类

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文章来自美国国家科学院院刊由以下人员提供美国国家科学院