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.2012年5月29日；109(22):8658-63.
doi:10.1073/pnas.1201629109。 Epub 2012年5月14日。

Yno1p/Aim14p是一种NADPH氧化酶同源物，控制酵母线粒体外活性氧的生成、凋亡和肌动蛋白电缆的形成

马克·林纳塔勒 1, 萨布丽娜·贝特纳, 彼得·劳恩, 吉诺·海伦, 托马斯·费尔德, 哈拉尔德·克林格, 马丁·温伯格, 克劳斯·斯托尔泽, 托马斯·格劳斯, 吉里·哈塞克, 奥尔德里奇·贝纳达, 伊万娜·弗莱德洛娃, 安德烈亚·克洛克, 比吉特·西蒙·诺布, 贝蒂娜·扬斯科, Hannelore Breitenbach Koller公司, 托比亚斯·艾森伯格, 坎贝尔·W·古雷, 研究者马代奥, 威廉·C·伯汉斯, 迈克尔·布雷滕巴赫
附属公司

Yno1p/Aim14p是一种NADPH氧化酶同源物，控制酵母线粒体外活性氧的生成、凋亡和肌动蛋白电缆的形成

马克·林纳塔勒等。 美国国家科学院程序. .

摘要

NADPH氧化酶（NOX酶）的大蛋白超家族存在于所有真核生物王国的成员中：动物、植物、真菌和原生生物。这些NOX酶的生理功能从防御到专门的氧化生物合成和信号传递。在丝状真菌中，NOX酶参与信号细胞分化，尤其是子实体的形成。在生物信息学分析的基础上，迄今为止，人们认为，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和葡萄裂殖酵母（Schizosaccharomyce pombe）等单细胞真菌的基因组中没有编码NOX酶的基因。然而，酿酒酵母的基因组包含九个ORF，显示出与哺乳动物NOX酶催化亚基的序列相似性，其中只有一些被指定为参与铁离子运输的铁还原酶。这里我们显示，九个ORF中的一个（YGL160W，AIM14）编码一个真正的NADPH氧化酶，该氧化酶位于内质网（ER）中，并以NADPH依赖的方式产生超氧物。我们将其命名为ORF YNO1（酵母NADPH氧化酶1）。YNO1的过度表达导致YCA1依赖性凋亡，而基因的缺失使细胞对凋亡刺激不太敏感。一些独立的证据表明，Yno1p产生的活性氧物种（ROS）对肌动蛋白细胞骨架的调节。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1。
图1。
Yno1p（YGL160W）的生物信息学预测。(A类)使用Phillius跨膜预测算法预测Yno1p的二级结构，如SI材料和方法跨膜螺旋以黄色突出显示；内质网管腔中可能存在的管腔区域以绿色突出显示；细胞质区域以蓝色突出显示。负责协调两个血红素基团的四个保守组氨酸残基用红色字母标记。NADPH结合位点用黄色字母标记，FAD结合位点用紫色字母突出显示。(B类)各种生物体双氧化酶（DUOX）烟酰胺结合位点的序列比对。序列“FSCGP”对DUOX酶和Yno1p具有特异性。
图2。
图2。
(A类)半乳糖诱导后过表达假定NADPH氧化酶的活酵母菌株和对照中荧光的定量测定。通过测量用pYES2载体pYES2转化的BY4741细胞中氧化的DHE来测定ROS的产生-FRE1公司，第2页-FRE3公司，第2页-YNO1公司，第2页-FRE8公司和pYES2-PaNOX1。请参阅表S1用于确定统计显著性。(B类)使用自旋阱DEPMPO的体内ESR测量结果（22）。标有箭头的线是针对超氧化物加合物的。上部谱对应于用空矢量变换的BY4741。下部在半乳糖诱导pYES2后获得光谱-YNO1公司用三个生物复制品分别记录这两种光谱。比较超氧化物特异性条带的信号强度表明，它们与双尾P（P）值0.0057。
图3。
图3。
(A类)WT中的ROS产量（灰色条）和yno1Δ（开条）单元格。如图所示，使用了四种不同的生长培养基。在这四个实验中的每一个实验中，在yno1Δ与WT细胞相比。(B类)yno1Δ电池表现出明显的5mM H电阻2O（运行）2，完全抑制WT细胞的生长。连续稀释WT和yno1Δ细胞在SC−葡萄糖和SC−糖+5 mM H上被发现2O（运行）2媒体报道，2天后得分。
图4。
图4。
富培养基上生长中期的两个活细胞及其大子体的荧光显微照片。(A类)Yno1–eGFP融合蛋白的定位。(B类)细胞核和线粒体DNA用DAPI染色。(C类)通过相差显微镜观察到相同的细胞。(D类)的覆盖A类–C类融合蛋白的核周位置清晰可见。
图5。
图5。
用DHE荧光法测量纯化微粒体中的ROS。（灰条）仅含有载体的菌株的微粒体（载体控制）。（开杆）半乳糖对照下表达Yno1p的菌株。(A类)在NADPH存在下微粒体部分检测NADPH氧化酶活性；NADH的活性较弱。(B类)添加DPI可抑制NADPH依赖性活性。在没有添加NADPH的情况下，残留DHE氧化也被DPI抑制。
图6。
图6。
过表达的稳定期细胞的存活率、凋亡表型和芽指数YNO1公司细胞在SC棉子糖中预培养；的表达式炔诺1用3%（wt/vol）半乳糖诱导pYES2质粒，并测定存活率、凋亡表型和静止期芽指数。(A类)废培养基中7-d培养的时间老化（固定相存活）及其通过灭活YCA1公司. (B类)在固定相中测量同一电池随时间的ROS生成A类.截至第2天，ROS生产在yca1Δ,YNO1公司尽管凋亡表型较低，但过表达株较高(A类,C类、和D类)。稍后在静止阶段yca1Δ菌株表现出较低的活性氧水平。(C类)在固定相的第2天，在相同的四个菌株中进行TUNEL测量。隧道+在过度表达的菌株中，表明DNA链断裂的细胞数量更多YNO1公司，但当YCA1公司已删除。(D类)AnnexinV和碘化丙啶（PI）在相同的四株菌株中的固定相染色测量（第2天）。的过度表达YNO1公司导致AnnexinV和PI的高水平染色，这表明存在凋亡和坏死细胞。如果YCA1公司已删除。(E类)固定相中芽指数（成芽细胞百分比）的测定。的过度表达YNO1公司通过从含有2%（wt/vol）棉子糖的培养基转移到含有2%（wt/vol，棉子糖+3%（wt/vol，半乳糖）的培养基，将细胞生长到固定相，并将其保存在废培养基中7天，诱导细胞生长。将转化为空载体的细胞作为对照。3天后，稳定培养物中约8%的细胞过度表达YNO1公司与对照组中检测到的～3%的出芽细胞相比，仍保持出芽。
图7。
图7。
(A类)删除雷诺1引起了对wiskostatin的超敏反应，而wiskosstatin被H的外部暴露所抑制2O（运行）2WT稀释和yno1Δ将菌株点在SC−葡萄糖、SC−葡萄糖+维他丁和SC−葡萄糖+维他丁+H上2O（运行）2.添加低无毒量的H2O（运行）2培养基使缺失株的超敏细胞在wiskostatin的抑制浓度下生长。(B类)用Abp140-GFP观察F-Actin；删除雷诺1在20μM的浓度下对latrunculin B（F-actin电缆伸长抑制剂）引起超敏反应，这不会抑制WT.H中F-actin的电缆伸长2O（运行）2latrunculin B对肌动蛋白电缆的反向抑制。因此，Yno1p产生的活性氧是F-actin调节所必需的。
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