FGF依赖性调节小鼠VEGF受体2的表达

FGF诱导的Erk1/2激活介导VEGFR2表达。

为了进一步分析FGF介导的VEGFR2表达调控机制，我们研究了FGFR激活后的下游信号传导。与FGFR结合后，FGF触发3条主要信号通路的激活：Ras-MAPK、PI3K-Akt和PLCγ-PKC(6)。而U0126对MEK1和MEK2的药理抑制以剂量和时间依赖性的方式显著减弱VEGFR2的表达（图​（图1，1LY294002对PI3K的抑制没有效果（补充图3C）。为了研究Erk1/2在VEGFR2表达调控中的作用，我们使用编码Erk2的Ad载体与其上游调节物Mek1的低活性形式融合。尽管Mek1-Erk2（ME）杂交蛋白由于存在核输出序列而保留在细胞质中，但输出序列中的4个亮氨酸突变为丙氨酸（Mek1-Erk2–LA[ME-LA]）显著增加了其催化活性，伴随着核移位(11,12)。将Ad–ME-LA而非Ad-GFP或Ad-ME转导到表达FGFR1DN的BAEC中恢复素食者2信使核糖核酸和蛋白质的表达达到对照水平（图​（图1，1，F和G），这表明FGF对VEGFR2表达的调节是通过Erk1/2依赖的信号机制介导的。

FGF诱导VEGFR2表达的转录调控。

VEGFR2表达的转录控制是复杂的，通过多种机制实现(13,14)。由于已知Erk1/2通过增加几个转录因子的磷酸化来激活它们(15)，我们测量了包含素食者2BAEC中表达的最小启动子和增强子序列。与没有Ad或通过ME-LA的表达拯救的空Ad（Ad-Null）对照相比，Ad-FGFR1DN的引入导致增强子活性显著降低（图​（图2A）。2A） ●●●●。由于Erk1/2被认为通过磷酸化Ets转录因子发挥作用，我们接下来试图鉴定顺式-中的作用元件素食者2启动子/增强子受FGF-依赖性Erk1/2激活的影响。为此，我们突变了GGAA核心序列中3个Ets结合位点的GG串联素食主义者2增强子（Pea3结合基序G56T_G57T；Ets1基序G303T_G304T；以及FOX:ETS复合基序C378A_C379A）。增强子活性分析表明，只有FOX:ETS基序中的突变将活性减弱到与FGF抑制所达到的水平类似的水平（图​（图2B）。2B） 。此外，在存在突变FOX:ETS基序的情况下观察到的增强子活性降低并没有通过添加组成活性形式的Erk来恢复（图​（图2C），2C） 这强烈表明FOX:ETS位点的激活直接位于Erk1/2的下游，对VEGFR2的表达至关重要。

在单独的窗口中打开

图2

FGF信号控制VEGFR2增强子活性和其他内皮基因的表达。

(A类)BAEC首先用Ad-Null或Ad-FGFR1DN转染，然后用Ad-ME-LA转染，并用含有素食者2第一内含子增强子和最小启动子。(B类)使用转染Ad-Null或Ad-FGFR1DN并转染WT的BAEC进行荧光素酶报告试验素食者2携带Ets结合位点突变的增强子或最小启动子结构（Pea3，G56T_G57T；Ets1，G303T_G304T；FOX:Ets，C378A_C379A）。(C类)FOX突变导致增强子活性降低：ETS位点未被组成活性Erk2挽救。(D类)对BAEC中与VEGFR2增强子结合的Ets1和Etv2进行ChIP分析（未转染或转染Myc-tagged-Etv2）。输入DNA，样本代表总输入染色质（1%）。(E类——H（H）)定量RT-PCR分析从用Ad-Null或Ad-FGFR1DN转导的BAEC中分离的总RNA。值表示相对于Ad-Null（赋值为1）的丰度。(我——L（左）)定量RT-PCR分析从用Ad-ME或Ad-ME-LA转导的BAEC中分离的总RNA*P（P）<0.05与各自的对照或括号所示，学生的t吨测试。

为了评估Ets家族转录因子与内源性VEGFR2增强子结合的能力，我们进行了ChIP分析。我们证实了Ets1和Etv2与BAEC中VEGFR2增强子序列的FOX:ETS位点的结合（图​（图2D）2D） 和MS1细胞（补充图4A）。Ets1 Thr38是一个被认为参与Ets激活的Erk1/2磷酸化位点(16)。在缺乏FGF信号的BAEC中，该位点的磷酸化降低（补充图4B）。U0126治疗也降低了Thr38磷酸化（补充图4C），表明与Erk1/2信号传导有关。因此，Ets转录因子能够通过VEGFR2增强子的FOX:Ets基序控制VEGFR2转录，而FGF-Erk1/2通路是该调控所必需的。

FOX:ETS可能参与FGF-依赖性调控VEGFR2表达，这表明通过相同位点控制其表达的其他内皮基因也可能受到影响。为了测试这一点，我们检查了第2级,缺口4、和加拿大存托凭证5用Ad-FGFR1DN转导的初级内皮细胞（编码VE-cadherin）。这两项指标均显著下降第2级和槽口4表达式，而加拿大存托凭证5表达式未更改（图​（图2，2，E–H）。后一发现与我们之前的研究一致，即在缺乏FGF信号的情况下，VE-cadherin的分布受到严重干扰，但其表达水平不变(7).

为了进一步探讨FGF驱动的Erk1/2激活在这些环境中的作用，我们分析了Ad–ME-LA转导后相同基因的表达。与FGFR1DN抑制数据一致，第2级和槽口4ERK诱导表达，而加拿大存托凭证5表达式保持不变（图​（图2，2，I–L）。Ad-FGFR1DN转导后使用小规模血管生成基因阵列对血管生成基因表达进行的全球分析确定了许多受FGF信号抑制影响的基因，包括分泌的血管生成因子、基质降解酶和整合素（补充图5，A-C）。

血管生成需要FGF驱动的VEGFR2表达。

为了确定素食者2通过FGF-Erk1/2信号在体内血管生成过程中发挥作用，我们使用sFGFR1-IIIc检测了FGF信号缺陷小鼠中VEGFR2的表达，我们之前证明sFGFR1-IIIc实际上可以关闭FGF信号(7)。静脉注射Ad–sFGFR1-IIIc后7天，素食者2与注射Ad-Null的小鼠相比，内收肌中的mRNA水平显著降低（图​（图3A），三A） ，这表明持续的FGF信号传导对于体内VEGFR2的基础表达是必要的。这种效应是VEGFR2特有的，因为素食者1mRNA水平没有改变（图​（图3B）。三B） ●●●●。

在单独的窗口中打开

图3

FGF信号控制VEGF诱导的血管生成。

(A类和B类)定量实时PCR分析素食者2(A类)和素食主义者1(B类)内收肌mRNA表达。从注射Ad-Null或Ad-sFGFR1-IIIc（5×10）的C57BL/6小鼠肌肉组织中分离出总RNA¹⁰病毒颗粒）注射Ad 7天后收获(n个=每组3人）。(C类)插塞植入前7天，将Matrigel塞与FGF2或VEGF-A混合放置在注射Ad-Null或Ad-sFGFR1-IIIc的C57BL/6小鼠皮下。(D类)基质胶塞测定的定量分析。对Matrigel塞切片进行CD31染色，并计算血管数量(n个=每组3人）。(E类)在小鼠体内注射之前，将Ad–Flag-VEGFR2与Matrigel混合，并使用抗Flag抗体对Matrige1的切片进行外源性VEGFR2表达的免疫组织化学评估。比例尺：20μm。(F类)体内Matrigel塞试验的定量分析(n个=每组3人）。(G公司)体内Matrigel塞试验的定量分析(n个=每组3人）。接受补充了VEGF-A和Ad–ME-LA的Matrigel的小鼠显示，在缺乏FGF信号的情况下，血管形成增加*P（P）<0.05与相应对照或括号中所示。

为了评估VEGFR2表达减少的生理意义，在7天前将含有FGF2或VEGF-A的Matrigel塞子植入注射Ad–sFGFR1-IIIc或Ad-Null的小鼠皮下。阻断FGF信号不仅可以减弱FGF2诱导的血管生成反应，还可以抑制VEGF-A诱导的心血管生成反应（图​（图3，三，C和D），正如预期的那样，在这些设置中VEGFR2表达减少。为了进一步证实这一点，使用Ad-VEGFR2进行了救援实验。在没有FGF信号的情况下，使用非FGF依赖的组成型启动子在Matrigel塞中表达VEGFR2恢复了VEGF诱导的血管生成反应（图​（图3，三、E和F）。此外，在这些环境中，VEGF-A诱导的血管生成反应也可以通过ME-LA结构的表达而不是对照ME结构的表达来挽救（图​（图3G），三G） 进一步证明Erk1/2激活在FGF诱导的VEGFR2表达调控中起重要作用。

细胞培养和Ad转导。

BAEC和人脐动脉EC（Lonza）以及MAEC和小鼠肺微血管EC（如前所述分离；参考。48)在37°C、5%CO中培养₂在EGM-2 MV培养基（Lonza）中，在涂有纤维连接蛋白（10μg/ml）的平板上。以MOI 10–100 pfu/cell转导Ad-FGFR1DN的Ad载体，或以100–500病毒颗粒/细胞转导Ad-ME和Ad-ME-LA。4–6小时后用正常生长培养基替换感染培养基。使用cGMP EIA试剂盒（Cayman Chemical）测量cGMP。

VEGFR2增强子分析和VEGFR2增强突变体。

用Ad-Null或Ad-FGFR1DN转染BAEC，然后第二天用Lipofectamine 2000（Invitrogen）转染质粒。转导和转染均一式三份进行，每个实验至少重复两次。48–72小时后，收集细胞并使用双荧光素酶报告分析系统（Promega）进行分析。Firefly和Renilla荧光素酶的吸收比归一化为Ad-Null对照。pGL2载体中的小鼠VEGFR2增强子/部分启动子构建（C.Patterson馈赠，北卡罗来纳大学，北卡罗莱纳州教堂山，美国；参考。49)用于荧光素酶测定。在诱变研究中，一致Ets结合核心序列GGAA/T（正义）和A/TTCC（反义）分别突变为TTAA/T和A/TTAA。在Pea3位点（ACCAAA）引入突变GG公司AAG、G56T_G57T）、Ets1现场（GCAGG公司AAAAC、G303T_G304T）和FOX:ETS站点（TTCTT科科斯群岛TGTTATG，C378A_C379A）和QuickChange定点突变试剂盒（Stratagene）。VEGFR2增强子序列基于Genbank登录号。{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“AF061804”，“term_id”：“5757676”}}AF061804型(35).

免疫染色。

缺血小腿的肌肉嵌入OCT化合物（Sakura Finetek）中，并在-80°C下冷冻。用抗CD31、-HA、-SDF-1α和-α-平滑肌肌动蛋白抗体对冷冻器组织切片（5-10μm）进行染色。IgG用于显示抗体特异性。

Hindlimb缺血模型和激光多普勒灌注成像。

如前所述诱导小鼠后肢缺血(18)。数据以缺血（右）和非缺血（左）肢体血流的比率报告(18).

血管造影和显微CT成像。

如前所述进行血管造影和显微CT分析(18)。数据以血管段数表示，表示250个特定直径的血管总数z（z）3D显微CT图像中小腿的切片。

渗透性分析。

将0.5%Evans Blue（200μl）注入逆行间隙，并让其循环30分钟。然后处死小鼠，排空血液，切除内收肌组肌肉并在55°C下干燥。用甲酰胺在55°C下提取组织中的Evans Blue 24小时，并用荧光阅读器（Bio-Tek）测量其607 nm处的荧光(7)。为了观察血管渗漏，在后肢缺血诱导3天后，将500μl FITC加上2 mDa右旋糖酐（Sigma-Aldrich），10 mg/ml的0.1×PBS注入左颈动脉。用荧光立体显微镜监测右旋糖酐外渗。

Ad-sFGFR感染和体内Matrigel塞试验。

C57BL/6小鼠注射5×10¹⁰Ad–sFGFR1 IIIc或Ad Null的病毒颗粒以及10μM触角足肽（耶鲁大学W.Sessa赠送；参考文献。50)。7天后，向小鼠皮下注射0.5 ml含FGF2（200 ng/ml）或VEGF-A（100 ng/ml）的Matrigel和肝素（10 U）。Ad–Flag-mVEGFR2、Ad-ME或Ad-ME-LA（0.85×10¹¹病毒颗粒）如前所述添加到Matrigel中(51)。7天后，对小鼠实施安乐死，并用单克隆CD31抗体、DYKDDDDK Tag抗体（细胞信号传导）和CD45抗体（电子生物科学）对Matrigel塞子进行染色。通过计数CD31对随机采集的帧（368.5μm×368.5微米）进行分析⁺使用NIH ImageJ软件。

小鼠血管生成超阵列。

用Ad-Null或Ad-FGFR1DN（MOI 50；n个=每组3个），持续24小时。然后采集细胞，使用RNeasy Plus Mini Kit（Qiagen）收集总RNA，并使用高容量cDNA逆转录酶试剂盒（Applied Biosystems）将其转化为cDNA。PCR阵列使用SABiosciences的RTβProfiler PCR阵列进行。阵列结果保存在GEO中(网址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/; 加入编号。{“类型”：“entrez-geo”，“属性”：{“文本”：“GSE28483”，“term_id”：“28483”}}GSE28483标准).

我们感谢Karen Moodie（美国新罕布什尔州汉诺威达特茅斯医学院）、In Kap Ko（美国北卡罗来纳州温斯顿塞勒姆维克森林大学）提供的技术援助，以及Peter Oettgen（美国马萨诸塞州波士顿Beth Israel女执事医疗中心）提供的意见和建议。本研究得到了NIH拨款HL 053793（发给M.Simons）的支持。