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自然。作者手稿；PMC 2011年9月10日发布。
以最终编辑形式发布为：
自然。2011年3月10日；471(7337): 177–182.
数字对象标识：10.1038/性质09802
预防性维修识别码：项目经理3095821
尼姆斯：美国国家卫生研究院263529
PMID：21390124

网络解剖和体内视皮层神经元的生理学

戴维·博克,1,2 魏昌艾伦·李,1,2 亚伦·M·克林,1 马克·安德曼,1 格雷格·胡德,三 阿瑟·韦策尔,三 谢尔盖·尤根森,1 爱德华·苏西,2 Hyon Suk Kim先生,1,2和R.克莱·里德1,2
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关联数据

补充资料

摘要

在大脑皮层中，局部电路由成千上万个神经元组成，每个神经元都会形成数千个突触连接。也许理解这些网络的最大障碍是我们没有它们相互连接的接线图。然而，即使我们有一个部分或完整的接线图，理解网络也需要了解每个神经元的功能信息。在这里，我们表明，结构和功能之间的关系可以通过结合体内生理学和网络解剖学。我们使用双光子钙成像来表征功能特性，即小鼠初级视觉皮层中一组神经元的首选刺激方向。然后，我们使用连续薄片的大规模电子显微镜（EM）来追踪这些神经元的局部网络。与最近生理实验的预测一致，抑制性中间神经元从具有广泛偏好方向的附近兴奋神经元接收聚合的解剖输入，尽管微弱的偏见不能被拒绝。

过去对皮层突触连接的研究一次只关注几个细胞，所以今天我们对高度互联的皮层网络的结构只有部分信息。直到最近，解剖学家还依赖于单个神经元的稀疏标记来追踪皮层神经元的广泛轴突和树突树突。突触连接最初是根据轴突和树突树突的重叠推断出来的1这是一种今天仍然富有成效的方法2,三.皮层切片的生理和解剖学联合研究在体外将这一分析扩展到包括不同细胞类型和皮层之间成对连接的规则4–6有人认为大脑皮层网络可能是随机的，超出了这些简单的统计规则7但最近的研究表明，皮层网络中可能存在高阶连接模式，例如相互连接的三联细胞8，以及在一个组内高度连接但在组之间不连接的神经元的子网络9,10虽然这些假设模式基于在体外生理学数据，它们从未在解剖学上得到证实，也从未与从神经反应特性测量的信息处理相关体内.

电子显微镜（EM）是表征皮层网络高度互联结构的理想工具。通过观察突触小泡的量子释放11生成模型生物的完整接线图12它为研究神经系统结构和功能之间的关系提供了明确的数据。电生理学与光学显微镜和连续切片EM相结合，可以检查神经回路中单个细胞的结构-功能关系，如海马体13，视网膜14,15、丘脑16和皮层17–20与光学显微镜的一个关键区别是，连续切片EM可以用来追踪神经元膜的三维轮廓，因此任何给定的轴突或树突都可以在数百微米的范围内进行追踪，而不会对单个神经元进行选择性的稀疏染色。连续切片EM的这一特征已被用于检查小体积的皮层组织，通常以数千立方微米为单位，其中多个树突和轴突的部分被重建以检查它们之间的突触关系21,22，参见。23.

在这里，我们利用计算机速度和存储容量的最新改进来执行包含数百万立方微米体积的连续截面EM，足以容纳1000多个细胞的大部分树突和轴突树突。有了这个数据集，我们可以尝试对功能成像细胞的子集进行采样，这些细胞是皮层网络中发现的密集互连24–27，参见。28,29：小鼠初级视觉皮层中的抑制性中间神经元接收来自附近兴奋性（锥体）神经元的密集、收敛的输入，这些神经元具有广泛不同的优先刺激方向(图1a).

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解剖重建前神经元的功能特征

a、，抑制性中间神经元不同输入的示意图。具有不同偏好方向（不同颜色）的兴奋性锥体细胞（三角形）向抑制性中间神经元（白色圆圈）提供输入（彩色箭头）。b、，基于细胞的小鼠视觉皮层视觉定向偏好图体内双光子钙成像。视觉反应细胞根据其估计的首选方向着色，宽调谐细胞（OSI≤0.2）着色为白色。暗对角线带：用于采集EM截面的区域，与图像平面正交。c、， 体内分离的三维解剖体（红色：血管或星形胶质细胞，绿色：OGB或YFP）的双光子荧光图像，以暴露功能成像平面。比例尺，100μm。

功能成像和大规模EM

我们使用体内双光子钙成像测定小鼠初级视皮层2/3层细胞对刺激方向的偏好30用荧光钙指示剂俄勒冈州绿BAPTA-1 AM（OGB）加载细胞后31，我们记录了脑表面下186μm单个细胞平面的细胞内钙增加所反映的神经元活动。将不同方向和方向的黑白条呈现给麻醉动物，并利用细胞反应生成方向偏好图(图1b和补充图1; 参见方法）。我们得出结论体内通过从钙成像平面周围的体积中收集图像堆栈进行实验(图1c; 红色：血管，绿色：神经元）。然后，我们立即灌注动物，并制备相应体积的视皮层，用于连续切片透射电子显微镜（TEM）（见方法）。

在找到大脑皮层的钙成像区域（见方法）后，我们切下了一系列1215个薄片（40–45 nm），这些薄片呈放射状，与功能成像平面成直角(图1). 每个部分都足够宽（450μm）以覆盖成像平面，并且足够高（350μm），以包括皮质层1、2/3和上部4(图2a-b,补充电影1). 虽然皮质轴突可以移动毫米，但锥体细胞的近端轴突侧支则更局部地游走7，使得它们的局部连接性的一部分可以在EM体积的跨度内被采样。与之前的工作一致，我们发现为了可靠地追踪最精细的神经过程并识别化学突触(图2f,补充电影2)，我们需要<50nm的截面厚度和<5nm的横向分辨率32.

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大型电子显微镜

a、，整个120000 x 80000像素薄片的电子显微照片，显示软脑膜表面（顶部）和皮质层1至上部4（底部）。c、 传真：缩放视图（c）两个具有功能特征的细胞（红色轮廓一)、和（f）它们之间的神经膜（蓝色轮廓a、 c、，和d日)显示了细胞体之间轴突和树突的密度。日期：，EM体积的立方体c（c）作为一张脸。b、 电子邮箱：EM体积的3-D渲染（b），补充电影3)通过整个系列和（e）穿过50个立方体截面d日（中的红色轮廓b条,补充电影4). 粉红色表示电子透明区域（例如血管），黄色表示电子密集区域（例如核仁、少突胶质细胞核和髓鞘），而水绿色表示像素值介于两者之间的区域（例如细胞核、细胞体和树突）。比例尺，a–b:100μm，c–e:10μm，f:1μm。

我们构建了一个定制的TEM相机阵列（TEMCA），它使用四个高速CCD相机高效地获取所需尺寸和分辨率的EM图像(补充图2，参见方法）。与大多数商用TEM成像系统相比，TEMCA的吞吐量提高了一个数量级。该系统使我们能够在大约20分钟内收集到镶嵌每个序列部分所需的数千张图像(图2a)，这样我们可以在几个月内对整个系列进行想象。

在将相邻图像自动拼接成切片后，通过全局配准和对齐EM体积，将我们数据集中的320万张相机图像转换为无缝三维图像体积（见方法）。原始图像数据约为36 TB，最终缝合和注册的EM数据集约为1000万像素（10 TB），跨度约为450 x 350 x 52μm，包含约1500个细胞体(图2b).

接下来，我们在EM体积中重新定位了功能特征为体内钙成像。EM数据集的大范围允许在双光子成像和EM成像之间注册荧光标记的血管和神经元(图3a-c). 我们将血管依次细化，然后是细胞体，以便在EM体积内识别具有已知方向选择性的单个神经元(图3d,补充图3; 参见方法）。EM体积与14个视觉反应神经元的细胞体相交(图1和补充图1). 13个细胞对刺激方向有选择性。第十四个神经元具有视觉反应，但对方向没有选择性。它具有非锥状神经元形态，在细胞体上接受不对称接触，在突触后靶点上形成对称突触(补充图4)表明它是一个抑制性GABA能中间神经元33物理配准的精确性和适当功能特性与神经元形态（定向选择性兴奋细胞和非选择性抑制神经元）的一致性证明我们成功地结合了微米尺度体内功能成像和纳米级EM超微结构。

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之间的通信体内荧光解剖与电子显微镜

a、，最大强度投影体内对应EM体积的荧光解剖。红色：血管，绿色：细胞。箭头之间的颜色对应于成像平面中神经元的方向偏好，如d日.b、，通过37个均匀分布在序列中的EM截面进行投影。c、，EM和荧光投影的合并。日期：，根据中概述的区域进行缩放c（c），显示的覆盖体内以及单个薄片中的EM数据。水平灰线描绘功能成像平面。在功能成像平面内，六个方向偏好已知的神经元的胞体（从左到右：细胞13、12、11、10、9和8，颜色如图1b)与它们的EM超微结构完全一致。在功能成像平面外，EM中的血管和星形胶质细胞用红色SR101染色进行了良好的标记。比例尺，50μm。

EM电路重构及其生成的网络图

为了分析电路的解剖连通性，我们手动追踪每个具有功能特征的神经元的树突和轴突轴突的线框模型，并记录每个突触沿轴突的位置。对于每个突触，我们向心重建突触后树突，直到到达细胞体或EM体积的边界（见方法）。通过这种定向方式，我们能够识别出在EM图像中可以找到的所有突触后靶点，并确定多个轴突何时会聚到一个共同的突触后目标上，而无需对目标细胞的树突进行不必要的追踪(图4和补充图5).

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抑制性中间神经元的汇聚突触输入

a、，突触后神经元轴突接触的三维显示。顶部的大球代表功能成像平面内兴奋细胞的胞体。水平调谐神经元（4号细胞；绿色）和垂直调谐神经元（10号细胞；红色）的轴突下降，在抑制性中间神经元（青色）的树突上形成突触（黄色小球）。导致会聚的轴突和树突节段由另一个人独立追踪，对原始节段视而不见（厚追踪）。细胞体和轴突因取向偏好而着色，如图1b.比例尺，50μm。b–c，电子显微照片显示抑制神经元上的突触（b）单元格4和（c）单元格10上覆盖了相应的颜色。比例尺，1μm。d–e，方向调整曲线源自体内细胞体的钙显像（d）单元格4和（e）单元格10。误差线为+/-SEM。

我们根据形态学将突触后靶点分为兴奋性或抑制性。金字塔细胞树突密集地布满棘，而抑制性中间神经元树突稀疏地有棘，在树突轴上接收到更多的不对称（兴奋性）输入33在来自10个具有功能特征的锥体神经元的245个突触中，125个（51%）位于抑制树突上，120个（49%）位于兴奋树突上。在185个不同的突触后靶点中，71个（38%）被抑制(图5、青色）和114（62%）具有兴奋性(图5，洋红）。目标群体中抑制细胞的比例小于抑制靶点上突触的比例，因为单个轴突经常与抑制靶点形成多个突触。我们将具有功能特征的细胞及其突触后靶点的解剖重建绘制成图表(图5b)检查网络的功能逻辑。

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从解剖学到连通图

a中，在功能成像平面上对14个神经元的树突、轴突和细胞体进行三维渲染（根据其方向偏好进行着色，如图1b)以及在EM体积中追踪到的所有突触后靶点的树突和细胞体（品红色：兴奋性靶点；青色：抑制性靶点，突触后靶标上的棘未显示；补充电影5). 比例尺，100μm。b、，功能特征细胞及其目标的有向网络图，由一突触后兴奋性（洋红色）和抑制性（青色）靶点与包含在EM体积内的细胞体被画成圆圈。其他突触后靶点（树突碎片）绘制为正方形。c、，具有功能特征的神经元的树突和细胞体的三维绘制，以及从多个具有功能特征的神经元接收会聚输入或自身具有功能特征的突触后靶点(补充电影5).日期：，网络图的子集，仅显示中的连接c、，全部独立验证。

抑制性中间神经元的收敛兴奋性输入

在连通性图中(图5b)我们发现多个锥体细胞具有不同的优先刺激方向，为抑制性神经元提供收敛输入。我们将随后的分析限制在一个经过简化和验证的子网络上，该子网络包括收敛连接，以及功能成像神经元之间的连接(图5c–d,补充图6-7; 参见方法）。最引人注目的是，一些抑制性靶点接收来自三个或四个不同细胞的输入，这些细胞具有一系列优先取向(图5d,补充图7a–d).

当我们检查所有收敛到抑制靶点的情况时，大多数来自彼此接近的成对细胞(图5c,​，6a），第6页)，与它们的首选方向之间的差异无关，其范围几乎是正交的(图5d中心，补充图7e–g)到几乎相同(图5d右下方，补充图7m–o). 通过检测两个轴突在太空中有多少突触在附近，发现了两个轴轴突是否会聚在一个共同目标上的最强预测因子(图6b–c，累积突触接近度，p<1.3 x 10-5，参见方法）。

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抑制性中间神经元的聚合突触输入是由邻近性而非功能预测的

a、，对齐和注册的EM图像序列的一部分通过1153个EM截面与功能成像平面平行地重新分割。重叠是收敛到抑制性中间神经元的网络图。视觉反应细胞体根据其偏好的方向（如图1b)，并按中所示编号图4–5向抑制性神经元靶标的会聚由线表示，对应于一个或多个突触，导致实心青色圆圈（在EM体积中追踪到细胞体的靶标）或正方形（树突片段）。细胞14部分包含在EM体积中，未显示。比例尺，10μm。b、，累积突触邻近性（CSP）示意图。线段代表轴突，每个突触中央有3-D高斯分布。通过将来自两个轴突的高斯神经元的所有成对重叠求和（σ=~12μm，见方法），计算每对定向调谐神经元的CSP。c、，突触束距离很近的轴突对更可能会聚到一个共同的目标上。参与会聚的轴突对的CSP（红色）显著大于非会聚的轴突对（蓝色；p＜1.3 x 10-5，双样本Kolmogorov-Smirnov检验，n收敛的对=21，n非收敛的对=24）。日期：，突触前细胞对之间的取向偏好差异并不能预测融合。定向偏好差异的分布与均匀分布没有显著差异（p>0.30，双样本Kolmogorov-Smirnov检验，n汇聚=29）或基于CSP的模型分布（见方法）（p>0.68，双样本Kolmogorov-Smirnov检验，n汇聚= 29).

一对兴奋性细胞的功能特性，特别是它们偏好方向的差异，不能预测它们是否收敛到抑制性靶点上。收敛的对具有与均匀分布无法区分的分布(图6d，红线，p>0.30），并根据考虑了所有可能的突触前对的分布，按其接近程度加权(图6d，蓝线，p>0.68；参见方法）。总之，两个兴奋神经元的轴突几何形状可以很好地预测它们是否会聚到附近的抑制性中间神经元上，而兴奋神经元的视觉生理学则不是。

讨论

结合网络解剖和体内生理学为研究神经元回路如何处理信息创造了新的机会。在这里，我们探讨了皮层神经元的几何形状和功能如何影响它们之间的连接模式。在对局部抑制性中间神经元进行兴奋性输入的情况下，几何形状似乎主导了功能7这一发现可能为最近对小鼠视觉皮层的生理学研究的预测提供了解剖学基础，在这些研究中，抑制性神经元的选择性低于兴奋性神经元24–27，参见。28,29(图1a). 汇集兴奋性输入的抑制性中间神经元可用于设置定向选择性锥体细胞的增益26,34,35; 它们也可能参与大脑状态的调节34或大脑皮层活动的注意力依赖性正常化36.

一些研究发现，小鼠的某些抑制神经元亚型具有选择性28,29。我们没有对抑制性神经元的不同亚型进行分类，因此不能排除某些神经元可能接受更选择性输入的可能性。此外，尽管我们的样本量足够大，可以排除收敛细胞对的首选方向调谐中的强烈偏差，但需要更大的样本来排除较弱的偏差（参见方法）。

直到可以完全重建大的EM体积22,37,38，对网络连接的分析将限于对底层解剖结构的部分采样。在这里，我们专注于重建具有功能特征的锥体细胞及其突触后靶点的轴突。在我们的样本中，我们发现51%的突触位于抑制目标上，尽管皮层中兴奋性神经元占优势39–41据报道，锥体细胞制造的10–20%的突触位于猫的抑制性靶点上17和猕猴42.我们观察到的较高百分比是否是由于物种差异43，参见。44或者说，由于我们从锥体细胞轴突中枢的近端部分采集了突触样本，这使得我们能够采集到大量聚集到抑制性靶点的样本(图5d).

虽然我们使用电子显微镜成像的体积相对较大，但事实证明，它接近进行大脑皮层功能与网络解剖相关分析所需的最小值。我们收集了一系列宽视野（350×450μm）的高分辨率EM图像，以涵盖具有功能特征的神经元的轴突中枢及其靶细胞的树突。尽管如此，我们的体积受到最短尺寸（52μm）的限制，这是由薄片的数量决定的，因此我们只能在数千个具有功能特征的神经元形成的突触中找到245个突触。

我们预计，由于自动化技术使成像吞吐量和序列长度增加，序列EM卷的大小在不久的将来将大幅增加45,46。虽然半自动化技术的吞吐量比纯手工方法增加了10倍，但追踪神经元之间连接所需的时间可能仍然是一个限制因素22。对于大规模重建，数据质量至关重要。要追踪未标记的、精细的轴突，最小截面厚度、最小截面损失和最佳组织质量至关重要47,48.

在当前的研究中，我们发现抑制性神经元有大量收敛性输入，主要是因为它们被我们重建的兴奋性轴突密集支配。探索更稀疏互联（可能存在弱偏差）的网络剖析49)兴奋性神经元50然而，需要更大的样本。在这里，我们试图限制红外激光对组织的损伤，因此双光子钙成像仅限于一个平面，即小于体积中细胞的1%(补充图8a). 钙显像的最新进展47,48然而，现在应该可以在保持组织质量的同时，从更多的细胞中收集生理信息。

幸运的是，EM图像体积的尺寸和其中生理特征细胞的数量增加，导致网络基序数量的组合增加8可以在单个实验中进行分析(补充图8b–d). 特别是，如果对神经元群体进行稀疏采样，则它们之间的互连数量会随着采样密度的平方而增加。随着功能成像细胞数量或EM重建所包含体积的适度增加，对皮层网络功能逻辑的理解应以加速的速度增加。

方法总结

如前所述，我们在小鼠视觉皮层进行了双光子成像27,30通过记录钙对视觉刺激的反应，视觉刺激由16个方向的漂移光栅组成。然后我们获得了体内尾静脉注射SR101（100 mM）标记血管后的荧光解剖体积。动物经心灌注（2%多聚甲醛/2.5%戊二醛），大脑进行连续切片TEM。连续的薄片（<50 nm）被切割，在涂有吡咯福林的缝隙网格上拾取，然后用乙酸铀酰和柠檬酸铅进行后染色。在JEOL 1200 EX上，在120 kV电压下拍摄了1215个连续截面，在定制真空室扩展端的光学质量含铅真空玻璃上安装了定制闪烁器。使用2x2阵列CCD摄像机（Imperx IPX-11M5）和蔡司镜头，由定制软件控制的自动x–y舞台运动和图像采集。以5–8 MPix/s的净速率获取适合电路重建的图像。通过配准相邻的相机图像和去图像处理，然后进行直方图均衡和拼接，将相机图像在2–D中对齐。然后记录相邻截面，并在对齐EM体积时均衡三维变形。使用TrakEM2手动重建具有功能特征的神经元的轴突和树突轴突，并使用经典标准对物体进行分类33神经或树突状碎片从多个具有功能特征的细胞接收突触，包括在收敛分析中。对于每个参与聚合的突触，第二个个体（对最初的重建一无所知）从突触开始追踪突触前和突触后的过程。进一步分析中排除了两个示踪剂之间存在分歧的分割。对轴突的累积突触接近度（CSP）是通过在每个突触突触束处以三维高斯密度函数为中心，并取所有对突触的点积之和来计算的。

方法

动物准备和体内钙显像

我们拍摄了一只成年老鼠（雄性）的视觉皮层您的1-YFP-H公司51)，如前所述27,30，使用定制的双光子显微镜，20倍物镜（奥林巴斯，0.95 NA），帧速率为2 Hz。随机漂移光栅（100%对比度，2 Hz）显示4秒，然后在LCD显示器上显示4秒均匀平均亮度，距离对侧眼睛18厘米，跨越约80°（方位角）×60°（仰角）的视觉空间。为了确定方向调谐，在16个运动方向上展示了方波光栅（0.05周/度）。用钙指示剂俄勒冈州绿BAPTA-1AM（OGB；Invitrogen）测量细胞反应。接下来，我们将尾静脉注射SR101（100 mM；Invitrogen），以荧光标记血管系统，并获得一个体内钙成像平面周围区域（600×600×250μm）的荧光解剖体积(图1c).

电磁材料制备

以下体内双光子成像：动物经心灌注（2%多聚甲醛/2.5%戊二醛），大脑进行连续切片TEM。切割7个300μm厚的冠状振动切片。振动切片后固定，用1%四氧化锇/1.5%亚铁氰化钾染色，然后用1%乙酸铀酰染色，用梯度乙醇系列脱水，并嵌入树脂（TAAB 812 Epon，Canemco）中。通过匹配血管系统定位钙成像区域后体内用35度金刚石刀（EMS-Diatome）在超微切片机（徕卡UC6）上切下荧光和连续厚（1μm）的甲苯胺蓝（EMS）切片，并在涂有淡金吡洛芬（Ted Pella）的1x2 mm点切口网格（Synaptek）上拾取4150个连续薄（<50 nm）切片支撑膜、碳涂层和辉光放电。取材后，用醋酸铀酰和柠檬酸铅对网格进行后染色。在4150个连续节段中，我们针对1215个连续节进行成像，其中包含了最大的方向选择性多样性和最少的丢失节段。在这个范围内，共丢失了28个切片：采集期间2个，染色后16个，成像前2个，成像期间8个。

透射电镜相机阵列

120 kV TEM（JEOL 1200 EX）被放置在脚手架顶部，在显微镜的最终投影仪透镜下方有一个定制的1.2 m真空室延伸部分，最终形成一个直径226 mm的闪烁体（Grant Scientific），位于光学质量的铅真空玻璃（Computer Optics）上方(补充图2). 定制软件（LabView）从2×2阵列控制x–y舞台运动和图像采集52CCD摄像机（Imperx IPX-11M5）与镜头（蔡司Makro-planar T*50毫米F/2.0 ZF）耦合。每个采集的摄像机帧都由摄像机的专用采集计算机进行相互关联、转换和求和，该计算机通过局域网将数据写入存储服务器（InterPRO Microsystems）。放大倍数为2000倍，加速电位为120 kV，通过钨丝的束流为~90微安。以5-8 MPix/s的净速率采集适合电路重建的图像。

EM图像配准与通信

EM体积的配准和对准的计算方法的详细描述将在其他地方出现。简单地说，通过对相邻摄像机图像进行配准和去毛刺，然后进行直方图均衡化和拼接，将摄像机图像进行二维对齐。然后记录相邻截面，并均衡三维弯曲应力，以对齐EM体积。图像卷将在全脑目录中公开访问(http://wholebraincatalog.org)和以UCSD单元为中心的数据库53(http://ccdb.ucsd.edu/，登录号8448）。

对齐的卷（第2990-4150节）被导入到TrakEM2的自定义版本中54用于可视化和分割。尽管我们的成像目标是1215个连续切片，但最终缝合和注册的数据集包含1153个切片，因为排除了一些碎片材料，通常是从EM块表面边缘切下的小块。原始未分割EM图像数据的体积渲染(图2b、e)使用假彩色查找表在TrakEM2中生成。查找成像细胞之间的对应关系体内利用EM数据集中的数据，我们先后使用了更精细的血管系统尺度和躯体尺度来重新定位EM成像体积中的钙成像神经元(图3和补充图3). 使用乳胶珠涂层复制光栅（EMS）校准像素大小（4 nm/pix）。使用圆柱直径法估算了约45 nm的截面厚度55.

追踪和独立验证

通过手动将一系列标记点放置在每个过程的中线上，并使用TrakEM2绘制轴突的线框模型，追踪具有功能特征的神经元的轴突和树突轴突54。地方数据质量差或缺失部分很少会导致歧义。在这种情况下，对进程的跟踪被暂停。细轴突通常无法在三个或更多连续缺失的节段上追踪到。根据经典标准识别突触33对于功能性细胞轴突上的每个突触，我们追踪突触后神经元的树突到体积边界或向心回到细胞体。从多个具有功能特征的细胞接收突触的神经元或树突状碎片被视为会聚目标。

另一个人之前没有重建过突触前或突触后过程，并且对之前的追踪工作一无所知，他独立验证了功能特征细胞之间聚合和连接背后的解剖连通性。从每个突触开始验证（黄色小球，图4a和补充图7)突触前和突触后的过程都是向心追踪的（粗追踪，图4a和补充图7). 当初始重建和随后的重建验证出现分歧时，该连接和所有远离分歧点的分割工作都被排除在进一步分析之外。验证过程表明，我们最初的分割工作具有高度的可重复性，与早期关于完整轴突再生性的测试一致(补充图6). 所有突触后树突状突起过程均得到证实。在64个参与会聚的突触前轴突接触中，55个被独立验证。三名经验丰富的团队成员在三个月内完成了大部分跟踪和验证工作。顶端树突和树突棘(图5a、c和补充图3、7)没有参与全部(图5b)或经过独立验证(图5d)连接图是由一小队学生绘制的，没有纳入分析。

突触后靶点分类为抑制性或兴奋性

生理特征细胞轴突突触后的树突被明确地确定为属于抑制性或兴奋性神经元。抑制性树突光滑，密被不对称轴突触覆盖，而兴奋性树突多刺，轴突触较少(补充图4a–b). 133个（54%）突触位于树突棘上，112个（46%）突触位于树突轴上。只有四个（1.6%）轴突触位于兴奋性靶点，12个（4.9%）棘突触位于抑制性靶点。从功能特征神经元随机选择的10个突触开始，沿着树突追踪并计算每个方向上最多10个突触体（包括棘和轴上的突触），计算突触后树突在棘上的突触体百分比。棘突触和轴突触在细胞类型之间的分布不重叠42(补充图4b)与之前的目标分类一致。在所有突触后树突被归类为抑制性的病例中（n=8），可以追溯到细胞体（图5–6)，在接触躯体时发现不对称突触(补充图4c). 细胞2具有视觉反应性，但对刺激方向没有选择性(补充图1)展示了上述所有特征。此外，其轴突与树突和躯体对称接触(补充图4d).

数据分析

如前所述，使用Matlab（Mathworks）和ImageJ（NIH）进行钙成像数据分析27,30仅包括估计光子噪声下限<3%ΔF/F的神经元。考虑神经元视觉反应灵敏如果对最佳方向的反应大于6%ΔF/F（形态学上确定的锥体神经元）或大于4%ΔF/F（非锥体神经细胞）。每个神经元的方向调谐曲线由16个方向的平均响应生成，这些响应与两个高斯函数的和相吻合(补充图1)并根据此拟合估计了首选方向。方向选择性计算为向量平均值的大小除以所有响应的总和：（∑R（θ我)sin（2θ我))2+（∑R（θ我)cos（2θ我))2)1/2/∑R（θ我)56,57.

一对轴突的累积突触接近度（CSP）是通过在每个突触触球处将一个剪裁的三维高斯密度函数居中，计算每对突触球（每个轴突一个突触球）的高斯点积，并对所有对进行求和来计算的(图6b). 点积被归一化，因此两个重叠的突触产生的值为1.0。收敛对和非收敛对之间的CSP分布显著不同（双样本Komogorov-Smirnov检验，σ=~12μm）。通过允许每对可能的生理特征细胞对模型贡献与对的CSP成比例的多个收敛，生成了一个收敛的模型种群，其中高CSP对贡献了许多收敛，低CSP对则贡献了很少。模型总体相对偏好方向的分布(图6d，蓝线）与均匀分布或收敛对的总体没有显著差异（双样本Kolmogorov-Smirnov检验）。生成了一组单独的模型种群，其中一个细胞对的收敛概率随着其取向偏好的相似性而增加。从这些模型人群中随机抽取我们的样本量(图5d，个汇聚=29）足以检测出强偏差模型种群中均匀分布的统计显著差异（双样本Kolmogorov-Smirnov检验，α=0.05，幂~0.80），即排除了具有正交优选方向调谐的收敛对的种群。然而，在表现出弱偏差的假设人群中，需要更大的样本量（数据未显示）。

补充材料

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致谢

我们感谢E.Raviola就EM的各个方面进行的讨论和提供的技术建议；J.Stiles为PSC的对齐和缝合工作提供支持和建议；J.Lichtman与K.Blum和J.Sanes进行了宝贵的讨论，并获得了脑科学中心的支持；A.Cardona为TrakeEM2提供帮助，并对其进行了许多有益的修改；与H.Pfister和S.Warfield讨论并帮助解决计算问题。我们还感谢S.Butterfield的编程、L.Benecchi和HMS EM核心设施的技术支持。对于EM及其解释的技术帮助，我们感谢K.Harris、M.Bickford、M.Ellisman、K.Martin和T.Reese。我们感谢J.Assad、R.Born、J.Maunsel、J.Stiles、E.Raviola和里德实验室成员对手稿的批判性阅读。这项工作得到了哈佛大学脑科学中心、微软研究院和NIH的支持，通过NEI到RCR（EY10115和EY18742）以及NRBSC（P41 RR06009）提供的资源，NRBSC是匹兹堡超级计算中心的一部分；哈佛大学神经退行性变与修复中心（Harvard Center of Neurodegen and Repair）向DB和NEI向WCL提供奖学金（EY18532）。

脚注

作者的贡献

DB、ES、SY、RCR设计并建造了TEMCA系统，DB对其进行了编程。AK和MA执行了体内成像和AK分析。DB处理组织，DB和WCL将块与体内成像。WCL对该系列进行了分割，DB、WCL、HK在TEMCA上对其进行了成像。GH和AW将图像缝合并对齐成一个卷。DB、WCL、HK进行了大部分细分。DB、WCL、SY对示踪进行了定量分析。DB、WCL和RCR在其他作者的大力帮助下设计了实验并撰写了论文。

作者信息

图像卷将在全脑目录中公开访问(http://wholebraincatalog.org)和以UCSD单元为中心的数据库(http://ccdb.ucsd.edu; 登录号MP8448）。

重印和权限信息可在www.nature.com/reprints网站.

作者声明没有竞争性的经济利益。

补充信息链接到该论文的在线版本www.nature.com/nature（自然）.

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