的表达式第16页^INK4a公司预防癌症并促进淋巴细胞衰老

流式细胞术、细胞分选、Western blots、体外活化分析和硝基苯乙酰免疫

用相应的磁性微球（Miltenyi Biotec）标记后，Thy 1.2⁺T细胞或B220⁺使用AutoMACS pro分离器（Miltenyi Biotec）从单细胞脾悬浮液中纯化B细胞。在CD3和B220染色后，通过流式细胞术评估细胞的纯度和活力（补充图1，可在血液网站；请参阅在线文章顶部的补充材料链接）。所有细胞均浓缩至90%以上纯度。在CyAn ADP流式细胞仪上进行多色流式细胞术（Dako细胞术）。仔细解剖胸腺周围淋巴结，使其远离胸腺，并没有使用胸腺酶消化来最大限度地提高胸腺细胞计数的准确性。用ACK缓冲液去除红细胞后，制备脾、胸腺和骨髓的单细胞悬浮液。然后使用Neubauer血细胞仪通过对台盼蓝染色细胞的显微镜观察来确定总细胞数。抗体信息、体外淋巴细胞活化试验、硝基苯乙酰基（NP）免疫、生发中心形成和体内5-溴-2-脱氧尿苷（BrdU）掺入试验在补充文本中进行了描述。

缺失后年轻小鼠淋巴细胞的正常发育第16页^INK4a公司在淋巴系中

接下来我们确定了血统特异性消融第16页^INK4a公司对幼年小鼠淋巴细胞的发育和分化有影响。在本研究中，T细胞特异性缺失第16页^INK4a公司不影响幼年小鼠（6-8周龄，图1C） ，DN1-DN4胸腺细胞数量（右）和单个阳性胸腺细胞数（左）在Lck-Cre第16页^+/+和Lck Cre第16页^升/升老鼠。外周血单个阳性T细胞(图1D左），以及幼稚和记忆T细胞(图1D中部和右侧）在幼鼠中没有显著改变。同样，B细胞的发育和分化不受第16页^INK4a公司B谱系中的缺失，如骨髓中正常的前B原、前B原细胞、前B细胞、未成熟B细胞和成熟再循环B细胞所示(图1E） ●●●●。同样，B血统没有影响第16页^INK4a公司在幼年小鼠的外周B细胞亚群中观察到缺失，包括成熟B细胞、过渡T1细胞、T2细胞和脾脏边缘区B细胞(图1F） ●●●●。与缺乏p16一致^INK4a公司这些数据表明第16页^INK4a公司不影响年轻成年小鼠的T和B淋巴细胞发育。

的作用第16页^INK4a公司胸腺退化与胸腺细胞发育

胸腺退化是人类和小鼠常见的年龄相关表型，胸腺T细胞输出减少被认为是人类衰老时免疫力受损的主要原因。探讨T血统特异性p16的作用^INK4a公司在胸腺退化中表达，我们检测了胸腺大小Lck-Cre第16页^升/升和Lck-Cre第16页^+/+老鼠。Lck-Cre公司小鼠一生在T细胞祖细胞中表达Cre重组酶。尽管该菌株的胸腺退化没有增加，但该酶在其他组织中产生了低水平的DNA损伤，因此其表达可能影响T细胞老化。T系胸腺退化速度显著减慢第16页^INK4a公司切除，证明随着年龄增长胸腺大小和胸腺细胞数量的下降得到了部分缓解，尤其是在40周龄和60周龄的动物中(图2A-B）。相反，在Lck-Cre第16页^升/升老鼠。

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图2

T血统特异性缺失第16页^INK4a公司减缓胸腺退化并减少与年龄相关的DN1至DN3阻断。（A） 胸腺退化伴衰老的部分挽救Lck-Cre第16页^升/升小鼠与Lck-Cre第16页^+/+小鼠（每组5只）。显示了来自指定年龄和基因型小鼠的胸腺和脾脏的代表性图像。（B） T细胞特异性缺失第16页^INK4a公司与年龄相关性胸腺细胞总数下降的部分但显著缓解相关（每组5个）。显示了指定年龄小鼠的胸腺细胞和脾细胞总数。（C） DN胸腺细胞阶段的年龄相关阻滞被T系特异性缺失第16页^INK4a公司（D）林的量化⁻CD4细胞⁻CD8（CD8）⁻（DN）显示年龄段的胸腺细胞分数，如面板C所示；n=每组5只小鼠。（E） T血统特异性缺失第16页^INK4a公司减弱年龄相关的DN1-DN3阻滞。林代表性流量分析⁻CD4细胞⁻CD8（CD8）⁻DN1（CD44⁺CD25型⁻)和DN3（CD44⁻CD25型⁺)显示了指定年龄和基因型小鼠的组分。（F） 面板E中确定的DN1与DN3电池（DN1/DN3）的绝对数量之比显示在指定的年龄段。另请参见补充图2；n=每组5只小鼠。误差条表示SEM*P（P）< .05, **P（P）< .01, ***P（P）< .001.

根据以往的研究，³⁵我们注意到，随着年龄的增长，血统阴性的DN胸腺细胞会积累(图2C-D）提示胸腺老化导致部分DN阻滞。这种与年龄相关的胸腺生成障碍被以下因素显著挽救：第16页^INK4a公司删除(图2C-D）。根据CD44和CD25的表达，阴性DN细胞又可分为DN1、DN2、DN3和DN4细胞，我们进一步分析了p16的作用^INK4a公司老化过程中的DN子部分。与他人的工作一致，^35——37我们观察到随着年龄的增长，从DN1到DN3阶段出现了显著的发育阻滞Lck-Cre第16页^+/+老鼠。该区块在年显著减少Lck-Cre第16页^升/升小鼠(图2E-F；补充图2），表明该区块部分反映了第16页^INK4a公司在老化的DN1细胞中。总之，这些数据表明，随着年龄增长，胸腺退化和胸腺细胞输出量减少是由于p16的淋巴细胞特异性表达所致^INK4a公司在DN T细胞祖细胞中，至少在持续Cre表达的环境中。

删除第16页^INK4a公司在T血统中

我们接下来决定是否第16页^INK4a公司除了胸腺退化和胸腺细胞输出外，在免疫衰老表型中起着内在作用。根据之前对小鼠和人类的研究，^38——40我们发现衰老与CD4和CD4中原始T细胞的减少有关⁺和CD8⁺隔间（CD4⁺CD25型⁻CD44细胞⁻或CD8⁺CD112型⁻CD44细胞⁻)和增加记忆T细胞（CD4⁺CD25型⁻CD44细胞⁺或CD8⁺CD112型⁻CD44细胞⁺;图3A） 随着年龄的增长，导致记忆/原始T细胞比率增加(图3B） ●●●●。T血统特异性缺失第16页^INK4a公司然而，在CD4细胞和CD4细胞中，与100周龄前幼稚T细胞生成的挽救有关⁺和CD8⁺隔间(图3A） 在老龄小鼠中保持“年轻”记忆/幼稚比率(图3A-B）。

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图3

T细胞特异性缺失降低外周T细胞免疫衰老表型第16页^INK4a公司.（A） CD4的代表性流动分析⁺（顶部）和CD8⁺（底部）显示T细胞特异性影响的脾细胞第16页^INK4a公司年龄相关的记忆变化和原始T细胞分数的缺失。记忆和原始T细胞的识别如图1C.（B）A组数据的量化，显示T细胞特异性的影响第16页^INK4a公司CD4中记忆与原始T细胞比率随年龄增长而缺失⁺和CD8⁺隔间；n=每组5只小鼠。（C） 显示衰老和T细胞特异性影响的代表性流动分析第16页^INK4a公司通过Ki67在非活化的（CD25）中的表达测量的对稳态增殖的缺失⁻)CD4细胞⁺或CD8⁺来自指定年龄和基因型小鼠的T细胞。（D） Ki67表达的量化如面板C所示，每组4只小鼠。误差条表示SEM*P（P）< .05, **P（P）< .01, ***P（P）<.001。

通过使用佛波醇12-肉豆蔻酸13-醋酸盐+离子霉素对T细胞受体（TCR）发出信号后诱导CD25表达来测量体外培养时，衰老也与激活反应增加有关（补充图3A-B）。这一发现可能反映了老年小鼠的记忆力/幼稚率增加，因为记忆细胞能够比幼稚T细胞更快、更持久地激活TCR信号。⁴¹与老年人记忆力/天真比率降低的发现一致Lck-Cre第16页^升/升动物，我们还观察到T细胞特异性p16对这种年龄相关的过度激活表型的拯救作用^INK4a公司删除（补充图3A-B）。因此，令人惊讶的是，抗增殖蛋白的表达，第16页^INK4a公司似乎通过抑制幼稚T细胞的产生，导致了晚年更活跃的记忆T细胞的年龄相关扩张。总之，这些结果表明，随着老化，p16^INK4a公司这种表达会破坏原始T细胞的产生，从而间接促进记忆T细胞的扩增。

给出p16的表达式^INK4a公司通过抑制增殖性细胞周期素依赖性激酶来限制细胞周期进展，我们接下来确定了第16页^INK4a公司年轻和老年小鼠体内稳态T细胞增殖缺失。增殖标记物（Ki67）在非活化（CD25）中的表达⁻)CD4和CD4中的脾T细胞急剧减少⁺和CD8⁺老化的隔间，在T细胞特异性第16页^INK4a公司删除(图3C-D）。通过测量体内BrdU掺入量，我们进一步研究了记忆和原始T细胞组分随年龄增长的稳态增殖。有趣的是，尽管BrdU在非活化记忆T细胞（CD4）中的掺入⁺CD44细胞⁺CD25型⁻)随着年龄增长，未激活的原始T细胞（CD4）减少⁺CD44细胞⁻CD25型⁻)随着年龄的增长，BrdU的掺入量略有增加(图4A左和图4B） ●●●●。这一观察结果与以前的研究一致^42——44并表明，老年小鼠的原始T细胞可能表现出增加的稳态增殖，以补偿胸腺细胞输出量随年龄增长而显著下降。T血统缺失第16页^INK4a公司几乎完全修复了记忆性T细胞中与年龄相关的稳态增殖缺陷，但对100周龄小鼠原始T细胞中BrdU掺入量的增加没有显著影响(图4A左和​和4B）。4B） ●●●●。这些数据表明第16页^INK4a公司通过减少记忆T细胞的稳态增殖来促进免疫衰老。

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图4

影响第16页^INK4a公司记忆和原始T细胞稳态或抗原特异性增殖中年龄相关变化的缺失。（A） 在指定年龄和基因型的小鼠中，通过BrdU掺入记忆或未经NP免疫（稳态，−）或未经NP免疫（抗原特异性，+）的幼稚T细胞来测量体内增殖的代表性流分析。对于NP（+）结果，记忆或原始T细胞中的BrdU掺入是在与硝基苯乙酰基-胆红素γ-球蛋白重新沟通后确定的，如“通过T系缺失增强老年小鼠的免疫功能第16页^INK4a公司“（B）定量BrdU在记忆中的结合（底部）或幼稚（顶部），如面板A所示，有无NP免疫；n=4-5只/组。p16的T细胞特异性失活^INK4a公司与挽救记忆和原始T细胞中抗原特异性增殖和记忆细胞中稳态增殖的年龄相关性下降有关。记忆和原始T细胞的识别如图1C.（C）100周龄小鼠中显示T系特异性p16影响的典型流分析^INK4a公司通过抗原诱导的B细胞增殖（BrdU掺入）测定T细胞辅助功能的缺失。（D） C组测定的抗原诱导B细胞增殖的量化；n=每组4只小鼠。误差条表示SEM*P（P）< .05, **P（P）< .01, ***P（P）< .001.

老年小鼠的免疫功能通过T系缺失增强第16页^INK4a公司

抗原特异性T细胞和B细胞免疫反应在老龄小鼠中受到损害，伴随着恶性肿瘤免疫监视和病原体清除的减少。调查是否第16页^INK4a公司在这些免疫衰老表型中起作用的是硝基苯乙酰基-壳聚糖γ球蛋白，它是一种半抗原-蛋白质结合物，用于免疫和检测抗原特异性免疫反应。NP免疫诱导T依赖性体液反应，涉及CD4和CD4⁺T辅助功能和B细胞抗体生成。在第1天免疫小鼠并在第28天再次免疫，然后在第33天通过体内抗原特异性T细胞和B细胞增殖（BrdU掺入）检查主要和记忆抗原特异性反应。

在年轻小鼠中，NP免疫诱导了显著的幼稚和记忆性T细胞增殖，这种增殖反应不受T特异性的显著影响第16页^INK4a公司删除(图4A-B）。然而，100周龄动物的NP免疫在记忆细胞中诱导了非常温和的增殖反应，在原始T细胞中没有观察到明显的反应。这种对NP增殖反应的减少在记忆和幼年小鼠T细胞组分中几乎完全被挽救Lck-Cre第16页^升/升小鼠(图4A-B）。此外，NP再传播后体内B细胞增殖（取决于T细胞辅助功能）在老年人中也显著增加Lck-Cre第16页^升/升小鼠(图4C-D）。这些数据证明p16^INK4a公司表达在抗原特异性T细胞免疫应答与年龄相关的功能下降中起着重要作用。

T谱系-特异性缺失第16页^INK4a公司与肿瘤增加无关

与B细胞特异性失活的研究相反（参见“B细胞特异第16页^INK4a公司失活加速淋巴肿瘤的发生”），失活第16页^INK4a公司在100周龄之前，T细胞与总死亡率或肿瘤相关死亡率的增加无关(图5A-B）。虽然在Lck Cre第16页^升/升小鼠与对照动物的比较(Lck-Cre第16页^+/+和CD19编号^Cre公司/+ 第16页^+/+)，T血统缺失队列中的死亡人数太少，无法评估Lck-Cre第16页^升/升小鼠非淋巴样变性、自身免疫和整体寿命。与B血统形成对比第16页^INK4a公司删除、停用第16页^INK4a公司100周龄以下小鼠T细胞中的CD4、CD8、CD25、CD44和CD112分布与异常淋巴细胞组分的存在无关图2C和​和3A）。三A） ●●●●。同样，T细胞特异性第16页^INK4a公司失活并没有导致T细胞增殖增加，超出在幼年动物中观察到的水平(图3C-D和​和4A-B）。4A-B）。总的来说，这些数据表明Lck-Cre第16页^升/升小鼠，表明p16^INK4a公司在100周龄以下的实验饲养动物中，对T系肿瘤抑制没有贡献。

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图5

p16的Kaplan-Meier生存曲线^INK4a公司B或T淋巴细胞缺失。（A） 总生存率Lck-Cre第16页^+/+和Lck-Cre第16页^升/升老鼠。（B） 无瘤生存期CD19编号^Cre公司/+ 第16页^+/+和CD19编号^Cre公司/+ 第16页^升/升老鼠。

B谱系-特异性缺失第16页^INK4a公司不会影响“中年”小鼠的免疫衰老

我们检测了CD19编号^Cre公司/+ 第16页^+/+与CD19编号^Cre公司/+ 第16页^升/升老鼠。测试了多种B细胞功能测试，包括稳态增殖(图6A-D）、体外B细胞受体依赖性B细胞激活（补充图4A）和抗原特异性B细胞反应，如再传播的增殖反应(图6C-D）和生发中心形成（补充图4B-C）。与T细胞的结果相反Lck Cre第16页^升/升小鼠，删除第16页^INK4a公司在47周前分析的小鼠中，B系细胞中的B细胞表型没有明显挽救任何与年龄相关的B细胞(图6A-D，补充图4）。这些数据表明p16^INK4a公司表达并不是47周龄以下动物B细胞功能障碍的主要原因。我们可能已经观察到了第16页^INK4a公司老年小鼠B细胞老化缺失，但B细胞瘤增加CD19编号^Cre公司/+ 第16页^升/升从一岁开始的动物排除了这种分析。

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图6

B血统特异性的影响第16页^墨水4免疫老化缺失。（A） 静止B细胞（CD40）中Ki-67表达测定的B细胞稳态增殖的代表性流式分析⁻)来自具有指定年龄和基因型的小鼠脾脏。（B） 如面板A.ns所示，K-i67表达的量化表明不显著**P（P）< .01. （C） 显示B谱系影响的代表性流分析第16页^INK4a公司抗原特异性B细胞增殖缺失。用硝基苯乙酰基免疫小鼠并重新接种（见“NP免疫”），并在指定年龄和基因型的小鼠中测量脾脏B细胞中BrdU的掺入。（D） 如面板C所示，BrdU掺入量的量化；n=每组4只小鼠，P（P）值如所示。

第16页^INK4a公司和T细胞老化

我们认为对我们的数据最简约的解释是p16^INK4a公司随着年龄增长，表达会导致2个或更多不同的T细胞亚群中的增殖性妥协。我们在老龄小鼠的DN1-3期观察到胸腺生成明显受阻，该受阻主要通过删除第16页^INK4a公司(图2)，提示p16的重要作用^INK4a公司在胸腺细胞发育过程中调节早期DN细胞的细胞周期穿越。胸腺生成缺陷可能反过来导致了与年龄相关的原始T细胞数量显著下降，而这种下降几乎完全被第16页^INK4a公司缺失，即使在2岁的动物中(图3A-B）。重要的是，在检查的最老（100周）小鼠中第16页^INK4a公司只产生了胸腺退化的临界减少(图2B） 和DN1-3堵塞(图2E-F）。这一观察结果表明，DN1-3阻断可能不是导致胸腺退化的唯一T前体因子。其他因素，如HSC的髓样细胞扭曲和胸腺的普通淋巴祖细胞输入减少，可能表现出更显著的影响，尤其是在这些年龄较大的小鼠中。因为Lck-Cre公司等位基因不切除第16页^INK4a公司在HSC或普通淋巴祖细胞中，我们的实验方法尚不清楚随着年龄增长对胸腺退化的其他影响是否依赖于p16^INK4a公司表达式。

我们还注意到外周T细胞中年龄相关表型的挽救，特别是原始T细胞中抗原诱导增殖的增殖下降的挽救，以及记忆细胞的稳态和抗原诱导增殖(图4A-B）。这种T血统特异性失活第16页^INK4a公司在老年小鼠的功能测试中，包括抗原诱导的增殖，与维持更“年轻”的表型有关(图4A-B），T-helper函数(图4C-D）和体外激活对TCR参与的反应（补充图3）。因此，我们的数据表明，生理学p16^INK4a公司随着年龄的增长，表达是观察到的免疫功能下降的主要原因。

从我们的数据中还不清楚p16是否^INK4a公司通过在多个T谱系亚群中独立引起永久性生长停滞（如“细胞衰老”），或通过促进T谱系细胞的一般“低增殖”状态，促进这些不同T细胞组分的衰老，这种状态可以在T细胞发育过程中从祖细胞传给子代。我们认为这是一个尚未解决的重要问题，因为它对p16的可逆性有影响^INK4a公司-诱导淋巴组织老化。

虽然目前的研究只关注小鼠T细胞老化，但我们相信现有数据也支持p16表达的可能性^INK4a公司导致人类T细胞老化。与年龄相关的指数增长第16页^INK4a公司人类循环T细胞的表达与啮齿类动物随着年龄增长而增加的表达一样大或更多，^17,23人类T细胞似乎依赖于p16抑制的相同增殖周期依赖性激酶（CDK4和CDK6）进行细胞复制^INK4a公司在这两个物种中。根据这些先前的发现，目前的小鼠数据表明p16^INK4a公司可能在人类T细胞衰老中发挥重要作用，尽管需要对人类T细胞进行具体的功能研究来验证这一假设。

第16页^INK4a公司以及内在衰老与外在衰老

尽管p16^INK4a公司表达通常被认为是可遗传的内在细胞事件的结果，我们相信我们的数据也与衰老的外在因素一致。多种细胞外事件可以快速调节p16^INK4a公司体外和体内表达，包括暴露于DNA损伤剂、氧化应激、次优培养条件、WNT信号激活剂和各种有丝分裂原⁴)。此外，p16的激活^INK4a公司据报道，在老年小鼠的肌肉干细胞中调节“生态位”老化信号。⁴⁵在淋巴老化的情况下，大量数据表明胸腺微环境中的年龄相关缺陷在胸腺随年龄增长的输出中起着关键作用。^46,47因此，T血统特异性对该表型的显著拯救第16页^INK4a公司切除手术可能出乎意料(图2A-B），尽管这些观察结果与之前的报告一致。⁴⁸然而，值得注意的是，尽管目前的数据证实了p16的表达^INK4a公司在T细胞祖细胞中，随着年龄的增长，胸腺退化，我们的结果并不表明年龄的什么特征导致p16^INK4a公司此上下文中的表达式。p16的表达^INK4a公司早期胸腺祖细胞可能反映了对与年龄相关的应激的反应，这种应激是细胞内的（如DNA损伤）或细胞外的（如胸腺环境的退化）。我们相信在这方面一个有趣的未来问题是，旧胸腺是否可以促进过继转移p16的衰老^INK4a公司-来自幼年小鼠的缺乏T细胞祖细胞。

第16页^INK4a公司和淋巴癌

鉴于p16的高流行率^INK4a公司人类T细胞祖细胞肿瘤（如T细胞ALL）的缺失，不含p16的小鼠肿瘤发生率增加^INK4a公司在T细胞谱系中是出乎意料的。停用第16页^INK4a公司在T-ALL中，几乎总是发生在体细胞缺失的情况下，并且这种损伤总是针对第15页^墨水4b和农业研究基金也。因此，p16可能^INK4a公司在祖细胞T细胞肿瘤抑制中几乎没有作用。然而，缺乏T细胞恶性肿瘤Lck-Cre第16页^升/升小鼠也可以反映实验条件。例如，慢性免疫挑战和病毒感染与淋巴瘤形成和p16缺失有关^INK4a公司在实验室条件下通常不会遇到的这种T细胞免疫挑战中，这种表达可能致癌。同样，尽管在Lck-Cre第16页^升/升衰老小鼠数量和增殖能力的增加Lck-Cre第16页^升/升正如在第18页^{INK4c（墨水4c）}没有动物。⁴⁹鉴于在Lck-Cre第16页^升/升这似乎是一个很好的模型来测试增强的T细胞功能对肿瘤发生、自身免疫和寿命的影响，这些都是正在进行的研究。

虽然T细胞没有p16^INK4a公司在这个模型中，似乎不容易发生肿瘤，而缺乏p16的B细胞则相反^INK4a公司这些结果与Signer等人的数据一致，他们证明了p16的显著和年龄相关的作用^INK4a公司B细胞祖细胞肿瘤。²⁹从我们的研究中还不清楚p16是否^INK4a公司表达在B细胞衰老中起作用。p16缺乏作用^INK4a公司47周龄“中年”小鼠B细胞衰老失活可能是因为p16的低表达^INK4a公司外周血B细胞与T细胞的比较(图1B和Liu等人¹⁷)或者因为47周的老化不足以观察到该小鼠模型中的功能性B细胞缺陷(图6; 补充图4）。

我们感谢Ken Dorshkind、Alex Seibold和Christin Burd对手稿的批判性阅读；试剂：Yi Zhang；以及北卡罗来纳大学莱恩伯格综合癌症中心老鼠一期单位的科学家，协助处理动物。我们感谢UNC-CH生物医学研究成像中心小动物成像设施在PET和MRI方面提供的帮助，感谢UNC-CH胃肠组织学核心设施在免疫组织化学方面提供的协助，以及UNC-CH流式细胞术核心设施。

这项工作得到了Burroughs Wellcome基金会、美国老龄研究联合会和美国国立卫生研究院的资助（CA016086、CA009156、AG024379、F30AG034806和T32GM008719）。