RNA测序：进展、挑战和机遇

摘要

在过去的10年里，我们逐渐认识到基因组的动态，包括DNA修饰和RNA的定量和定性变化，这些变化在从简单的模式生物到人类的物种中都有体现。这一进展是通过使用各种基因组测量方法实现的，包括全面的转录组学研究¹我们现在对转录组的复杂性有了新的认识，包括许多以前未知的编码和非编码RNA物种，特别是小RNA（sRNAs），包括microRNAs、启动子相关RNA和新发现的反义3′末端相关RNA等^2，三.

最初的转录组学研究在很大程度上依赖于基于杂交的微阵列技术，并且提供了有限的能力来全面编目和量化基因组在广泛水平上表达的各种RNA分子。高通量下一代DNA测序（NGS）技术的引入⁴通过大规模cDNA测序（RNA-seq）实现RNA分析，彻底革新了转录组学。这一发展消除了微阵列技术带来的几个挑战，包括检测的动态范围有限⁵用于RNA-seq的NGS平台可从四家公司（Illumina、Roche 454、Helicos BioSciences和Life Technologies）商业化获得，其他公司正在开发新技术⁴鉴于测序能力（如吞吐量、读取长度、错误率和执行配对读取的能力）对于RNA-seq和基因组研究的重要性，NGS公司正在不断改进其平台，以最低成本提供最佳测序性能⁴.

RNA-seq研究的新方法已经逐渐提供了两种原核生物转录生物学定量和定性方面的更全面知识⁶和真核生物⁵在这里，我们讨论了这些进展，其中包括开发方法以更全面地了解转录起始位点，对正转录和反义转录进行编目，改进选择性剪接事件的检测以及基因融合转录的检测，这在癌症研究中变得越来越重要，所有数据规模在几年前都是难以想象的。最近开发的方法还允许在RNA-seq之前选择特定的RNA分子，从而使转录组学研究更具针对性。在本综述中，我们对这些方法进行了概述，只简要介绍了它们允许的生物洞察力类型，并重点介绍了技术本身。我们对每个应用程序可用的不同方法进行了比较，并讨论了当前的局限性和未来改进的潜力。最后，我们讨论了RNA-seq技术的两个新进展：直接RNA测序（DRS）⁷以及可靠分析微小RNA数量的方法，这对RNA-seq的翻译研究和临床应用非常重要。

绘制转录起始位点

核苷酸解析时转录起始位点（TSS）的定位对于充分定义RNA产物和识别调控每个转录物表达的相邻启动子区域是必要的。首个高通量TSS定位方法之一是基因表达帽分析（cAGe）方法，该方法最初是为Sanger测序开发的^8，9这涉及对源自具有完整5′端（例如，包含5′帽结构）的RNA的克隆cDNA产物进行测序。尽管这项技术很有用，但它需要大量的输入RNA，并且每个TSS只产生短读（约20个核苷酸）。

这些限制促使cAGe方法适用于NGS平台，这导致发现TSS在基因组和单个启动子周围区域分布的意外复杂性。将RNA-seq与CAGE结合的方法包括深层CAGE¹⁰、泥炭¹¹、nanoCAGE和CAGEscan¹²它共同解决了最初基于Sanger序列的CAGE策略的几个技术挑战(表1). 首先，nanoCAGE¹²现在，通过使用各种扩增策略，可以从10毫微克的总RNA数量绘制TSS图谱。其次，PEAT和CAGEscan与配对测序的兼容性（Illumina等平台支持这一功能，但Helicos等平台缺乏这一功能）允许检查TSS与下游区域的连接，并有助于将已识别的TSS分配给特定转录物。此外，配对测序部分缓解了将单个短读与重复区域对齐的困难，因此允许重复元素子集至少部分由RNA-seq表征。

然而，这些基于NGS的方法存在一些警告。一个是没有试图检查所进行的放大和其他操作步骤是否扭曲了每个TSS使用频率的结果。尖峰实验将有助于解决这个问题。此外，在涉及cDNA合成和扩增的协议开发过程中遇到了许多困难¹²例如，研究人员观察到一些人工制品，如主导测序数据集的引物二聚体，降低了有效覆盖率，促使使用半抑制PCR来降低引物二聚体的频率¹²因此，尽管这些方法可能有助于定性应用，但建立和改进其定量能力可能需要进一步开发。

基于RNA的TSS定位方法的一般局限性包括其对cDNA合成或杂交步骤的依赖性，其效率取决于RNA序列和结构。此外，基于RNA的TSS图谱对短寿命转录物（如初级microRNA）具有挑战性，初级microRNAs通常转录水平较高，但由于其快速降解而很少。当与其他方法（如基于染色质的TSS预测）相结合时，这些局限性可能会部分缓解，该方法依赖于检测组蛋白修饰，而组蛋白修饰是活性转录的指示^13，14鉴于最近有人提出转录后处理导致RNA片段中的5′cap-like结构，这种整合可能也很有用¹⁵因此，仅依赖CAGE数据进行TSS绘图可能会导致难以将转录起始事件与RNA处理事件分开。

链特异性RNA-seq

一系列物种的转录组学研究揭示了反义转录事件的普遍存在¹⁶虽然这些事件曾经被认为反映了生物或技术噪音，但现在很清楚，反义转录物是有功能的，在正常生理状态和疾病状态中都有不同的作用¹⁶因此，人们越来越感兴趣的是在更大的深度剖析转录组，以充分表征正反义转录产物。标准RNA-seq方法通常需要双链cDNA合成，这会擦除RNA链信息。此外，在第一链cDNA合成过程中，由于逆转录酶具有依赖于DNA的DNA聚合酶（DDDP）活性，可能会引入虚假的第二链cDNA人工制品^17-19，这可能混淆有义转录物与反义转录物的测定²⁰放线菌素D被认为是降低逆转录酶DDDP活性的潜在药物¹⁸但它的有效程度，以及是否引入了额外的人工制品，还没有得到充分的检验。为了克服这些困难，已经开发了几种针对转录组的strand-specific分析策略。

为生成特定于股的信息而制定的策略通常依赖于三种方法之一。第一种方法涉及以预定方向将适配器连接到RNA末端或第一链cDNA分子^21-23这些适配器的已知方向被用作参考点，以获取RNA链信息。第二种方法是直接测序溶液中产生的第一链cDNA产物^24，25或在表面上²⁶最后，第三种方法是对第二链cDNA合成产物或RNA进行选择性化学标记^27，28这些策略已经开始有助于我们理解转录体，包括RNA翻译状态的映射（例如，多聚体分析）²⁹新启动子相关RNA的鉴定²².

最近的一项研究使用了酿酒酵母作为参考，基因组比较了几种策略的性能，作者观察到这些方法在链特异性水平、覆盖均匀性、与已知注释的一致性、，库的复杂性（例如，唯一读取开始位置的数量，这表明协议避免重复读取等放大伪影的能力）和生成定量表达式配置文件的能力³⁰然而，目前仍缺乏深入的比较研究，以确定每种方法所引入的偏见和人为因素的特征，使用这些数据集的科学家应该意识到几个问题。

首先，考虑到逆转录酶在第一链cDNA合成过程中产生虚假第二链cDNA产物的趋势^17-19，尚不清楚依赖于第一链cDNA产物测序的方法（直接或通过分子内或分子间连接）是否是绝对链特异性的。这些方法的链特异性是通过量化反义方向上映射的读数与已知的、注释良好的基因的读数之比（相对于义方向上的读数）来报告的。这项研究表明，用这些方法获得的一小部分读取仍然与反义方向对齐；因此，这些方法可能并不完全是针对特定的领域³⁰此外，含有第一链和第二链cDNA产物的cDNA产物可能无法与参考序列正确对齐。考虑到基因组中有义和反义转录物的不完整注释，即使是在那些经过充分研究的物种中，如酿酒酵母应仔细评估这些方法的链特异性的真实程度。理想情况下，这种评估应该使用定义序列的化学合成RNA尖峰池进行。

其次，结扎往往有序列偏好^31，32因此，依赖结扎的方法可能会受到各种表征偏差的影响。这种偏见的例子可以在转录组分析中找到²³和核糖体剖析实验²⁹与酶促3′聚腺苷酸化制备的文库相比，使用连接制备的库的覆盖率极不均匀²⁹第三，其中一些方法中包含的溶液内或表面放大步骤可能会引入额外的人工制品，例如以Gc偏差和重复读取的形式^33-35对这些影响的检查表明，标准和特定于链的Illumina RNA-seq策略的重复读取分数在6.1%到94.1%之间，并且存在Gc偏向于中性Gc含量的RNA模板²³希望正在开发的测序技术或对现有测序技术的修改和改进能够克服这些局限⁴.

替代拼接图案的特征

考虑到选择性剪接模式在发育中的重要性，以及15-60%的已知致病突变影响剪接^36，37，将剪接事件的全部曲目编入目录，并了解改变的剪接模式是如何促进发育、细胞分化和人类疾病的，这将是至关重要的。使用基于RNA序列分析的方法进行的初始剪接位点定位研究受到读取长度的限制，这妨碍了与每个读取的两个独立外显子部分（代表外显子剪接事件）的基因组进行可靠比对。因此，最初基于RNA-seq的选择性剪接研究使用了计算策略来弥补这一限制。用于比对的参考序列被“人造”序列所补充，这些序列围绕着基因注释外显子之间所有可能的剪接连接，从而使读取结果得以对齐^38-41这些方法改变了我们对人类剪接的看法，因为超过95%的人类多xon基因被发现是交替剪接的，每个组织约有110000个新的剪接位点⁴²通过计算映射到每个外显子和跨越每个剪接连接的读取数，这些方法还可以确定每个连接的剪接效率，并量化不同亚型的水平^43，44.

对当前测序技术的改进现在可以使读取长度更长，从而可以更好地将读取映射到选择性剪接的外显子。这种改进来自于能够将读取划分为多个片段，并将每个片段独立地与基因组对齐。此外，涉及配对读取的方法现在可以通过读取之间的估计距离从转录本中的两个点获取序列信息。因此，现在可以搜索拼接模式，而无需事先了解转录本注释^45，46(图1). 以无偏见和全基因组的方式检查剪接模式和转录连接需要获得全长转录序列，这可能在未来通过新兴技术实现^47，48.

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图1

RNA-seq用于检测选择性剪接事件

一|序列读取被映射到基因组DNA或转录组参考，以检测RNA转录物的替代亚型。映射仅基于每个外显子的读取计数和跨越外显子边界的读取。有人通过基因组位置的无读映射推断转录本中没有基因组外显子。b条|配对序列读取提供了关于外显子剪接事件的额外信息，如匹配一个外显子中的第一个读取，并将第二个读取放在下游外显子，从而创建转录物结构图所示。

基因融合检测

RNA-seq与类似于上述剪接位点检测的计算分析相结合，也可用于识别疾病组织中的基因融合事件，这对癌症研究具有特别重要的意义⁴⁹基因组DNA可以用单读和成对端读策略进行分析，以检测易位和其他基因组重排⁵⁰然而，RNA-seq可能更适合于识别产生异常RNA物种的事件，因此在生物或疾病环境中具有功能或因果关系的可能性更高^51，52(图2). 此外，基于基因组DNA的方法无法识别由非基因组因素引起的融合事件，例如反式-拼接⁵³以及相邻转录本之间的通读事件^51，54配对末端RNA-seq对于融合鉴定可能是特别有利的，因为它提供了增加的物理覆盖。这种方法在肿瘤学中产生了重要的生物学发现^55，56为治疗调节提供潜在靶点。

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图2

RNA-seq用于BCR–ABL公司融合基因检测

一|断点簇区域(业务连续性审查)和ABL1公司基因转录本。b条|BCR–ABL公司融合基因转录本。c（c）|序列读取跨BCR–ABL公司融合基因位点显示了准确识别基因融合位点的能力。数据来源于RNA-seq分析²⁵使用HeliScope对K562转录组进行测序（原始数据文件可在加州大学圣克鲁斯分校基因组浏览器和直升机技术中心).

融合检测面临的挑战通常与选择性剪接检测的挑战并行。此外，基于RNA-seq的分析无法检测到涉及基因启动子与另一基因编码序列交换的融合事件。此外，RNA-seq数据包括在逆转录和扩增过程中通过模板转换产生的嵌合cDNA人工制品⁵⁷（下文讨论），导致基因融合鉴定中出现假阳性。当具有足够吞吐量和测序性能的长读RNA测序技术可用时，这些困难可能会得到部分缓解⁴.

使用RNA-seq的靶向方法

尽管NGS在吞吐量和降低每个数据点成本方面的能力不断增强，但为数项研究和潜在的临床应用获得足够的测序覆盖率所需的支出仍然令人望而却步。这些应用包括低丰度转录物的特征描述和基因分型，以确定转录物的哪些等位基因可能会差异表达。在这些情况下，最好是丰富所需的转录子子集，以最小化测序的总成本，并最大限度地增加可分析的样本数量。

靶向富集策略最初是为基因组DNA重新测序而开发的^4，58鉴于大部分致病突变可能位于蛋白编码转录组中，许多这些技术已被用于从基因组DNA中捕获人类外显子。poly（A）的RNA-seq⁺RNA物种为外显子组测序提供了一条天然路线，无需使用富集策略。最近的几项研究证明了mRNA-seq数据对核苷酸变异鉴定的潜在适用性^59-61然而，这些研究也强调了一些挑战，例如，足够覆盖低丰度转录物所需的高测序深度。

cDNA应用中基因组DNA富集策略的轻微修改允许开发靶向RNA-seq(图3). 靶向RNA-seq方法已用于检测融合转录物、等位基因特异性表达、突变和转录子集中的RNA-editing事件^62-64由于额外的探针或微阵列制备和靶点选择步骤，与其他RNA-seq方法相比，靶向RNA-seq策略目前需要更长的样品制备步骤和更高的输入RNA和cDNA数量。此外，根据杂交效率和其他因素，目标区域的捕获效率通常不同。为了获得更好的实验结果，需要简化该过程并提高捕获效率。

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图3

靶向RNA-seq的替代方法

一|使用poly（A）⁺RNA转化为双链cDNA——安捷伦SureSelect方法使用RNA探针富集所选cDNA⁶².b条|自定义NimbleGen阵列可以选择感兴趣的cDNA。c（c）|具有序列特异性互补靶点的DNA分子的产生允许靶向cDNA^63，64.d日|含有目标特异性寡核苷酸的螺旋测序表面可用于在一步中选择所需的RNA、DNA和cDNA物种和感兴趣的序列区域。nt，核苷酸。

小RNA分析

NGS技术对sRNA发现和表征的影响尤其值得注意。其他人对这些研究进行了广泛审查（例如，参见REF。65)，因此我们在此不深入讨论此主题，而是提供一个简短的摘要以确保完整性。

大多数最初的sRNA-discovery研究使用焦磷酸测序^66，67随后，其他吞吐量更高的NGS平台的使用导致了全基因组调查，发现了越来越多的sRNA物种^15，68，69。因为“较长”RNA（>200核苷酸）的NGS样品制备策略不适用于sRNAs，例如随机启动的反转录（因为这种启动短RNA物种cDNA合成的方法产生的cDNA物种更短，而这些cDNA物种的长度不足以进行有效的比对），制定了改进的准备策略^70-72.

目前基于RNA-seq的方法研究sRNAs的一个重要局限性是它们无法提供这些转录物的绝对定量视图。最近已经清楚，尽管基于NGS的sRNA保护方法可以用于差异表达分析，但每个sRNA获得的读取数并不一定与其实际丰度相关^73，74这种差异似乎是由于样品制备和测序步骤中引入的偏差造成的。新兴技术是否能提高sRNA定量仍有待观察。

直接RNA测序

RNA的直接测序

上述当前RNA-seq方法的局限性可能会因新兴的RNA分析技术（包括DRS）而得到部分缓解，这些技术实质上改变了RNA表征方法。DRS目前需要单分子测序能力，因为未经cDNA转换直接扩增RNA分子的技术尚未得到检验。虽然RNA依赖的RNA聚合酶确实存在⁸⁹，它们能在多大程度上适应基于扩增的下一代测序技术目前尚不清楚。

最近使用Helicos单分子测序平台开发了第一种大规模并行DRS方法^7，90，91(图4). 它依赖于将多个3′-聚腺苷化RNA模板的股骨头与聚（dT）涂层测序表面的单通道杂交，然后通过合成测序。这种方法可以选择并排序poly（A）⁺来自总RNA或细胞裂解物的RNA，序列数据来自多聚腺苷酸化位点的上游区域⁷因此，该技术为获得基因表达谱和以定量和全基因组的方式绘制多聚腺苷酸化位点提供了一条途径。缺乏天然聚（A）尾部的RNA物种可以被聚腺苷酸化在体外并用DRS进行分析。

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图4

使用Helicos方法进行直接RNA测序

一|聚腺苷化和3′脱氧被聚（A）聚合酶阻断的RNA被捕获在聚（dT）涂层表面。执行“填充并锁定”步骤，其中“填充”步骤使用天然胸腺嘧啶核苷和聚合酶执行，“锁定”步骤使用荧光标记的A、C和G虚拟终止体（VT）核苷酸执行¹⁰⁴和聚合酶。这一步纠正了聚（A）和聚（T）双工体中可能存在的任何失调，并确保测序从RNA模板开始，而不是从聚腺苷化尾部开始。b条|进行成像以定位模板的位置。然后，对染料-核苷酸连接物进行化学裂解，以释放染料并制备用于核苷酸合并的模板。c（c）|用一个标记的核苷酸（以C-VT为例）培养该表面，并进行聚合酶混合物。在该步骤之后，进行成像以定位已经并入核苷酸的模板。染料的化学裂解使表面和DNA模板为下一个核苷酸添加循环做好准备。核苷酸按C、T、A、G顺序添加120个总循环（每个核苷酸添加30个）。

DRS方法的发展不受cDNA合成人工制品的影响，例如模板切换和虚假的第二链合成，为诸如链特异性转录检测等应用提供了潜在的改进。此外，DRS只需要输入RNA的飞沫或等摩尔水平，这取决于应用，并且涉及相对简单的样品制备。因此，DRS型技术对于当前基于cDNA的方法具有挑战性的应用可能是有利的，例如产生亚基因组水平RNA的实验（如下所述）、档案标本或短RNA物种，其不能容易地转化为cDNA。此外，与基于cDNA的方法不同，这种方法需要不同的策略来分析短RNA和长RNA物种，涉及聚腺苷酸化的DRS样品制备可以应用于任何RNA物种，从而允许在单个实验中观察到短RNA和长RNA。DRS将来还可以通过整合靶点选择和测序步骤来简化靶点RNA-seq(图3d). 这种集成可以将样品制备步骤减少到仅核酸片段化，并且可以将成本以及所需的输入核酸数量降至最低。

DRS的一个关键挑战是生成许多RNA应用所需的数百万级读取量，特别是量化，并通过改变测序化学和模板采集步骤进一步降低错误率和输入RNA数量。DRS也可能无法解决上述所有RNA-seq限制，例如，在poly（A）过程中捕获降解产物的问题⁺RNA选择。此外，对于上面讨论的各种应用，包括侧重于识别RNA物种的5′（例如，CAGE型TSS映射）和3′边界的研究，需要将配对编码方法与DRS和更长的读取长度相结合。

分析低数量RNA样本

生物标本（如组织和体液）通常是异质的，是多种细胞类型的复杂混合物。明确需要专门选择和研究特定的细胞，但这项任务的实现并不简单。现在有几种工具可以选择特定的细胞类型，例如流辅助细胞分选（FAcS）、激光捕获显微切割（LcM）⁹²、系列稀释、专用微流体装置⁹³和微观操作。此外，也有从少量细胞中分离高质量RNA的方法。阻碍微小RNA量的可靠、全局分析的主要限制是高通量RNA分析方法与低量RNA样品的不相容性。这种方法的缺乏减缓了我们在一系列领域的进展，例如法医学、干细胞生物学、宏基因组学和植物生物学。这种局限性的影响可能在癌症和其他疾病的研究中最为明显，因为从患者身上获得的样本通常数量有限；分子剖析研究结果与用于临床研究和分子诊断的技术之间的过渡受到阻碍，减缓了我们向个性化医学的发展。因此，使用输入RNA的微微图数量提供转录组的全面无偏见视图的策略将促进一系列领域的巨大进步。

新兴技术

许多基于杂交和序列分析的技术正在出现，它们可以从微小的细胞数量中获得可靠的转录组图谱。在测序方面，nanoCAGE¹²现在，通过使用各种扩增策略，可以从10纳克总RNA中绘制TSS图谱。最近开发了无扩增RNA-seq方法，该方法可以最大限度地减少所需的输入RNA的数量。一种方法是从大约500微克的RNA中对第一链cDNA产物进行测序，并用寡核苷酸或随机六聚体在溶液中启动^24，25另一种方法是在测序表面上使用poly（dT）引物来选择poly（A）⁺来自细胞裂解物的mRNA，然后进行表面第一链cDNA合成和测序²⁶这种方法可以从约1000个细胞中获得可复制的基因表达谱，并消除RNA分离步骤中的RNA损失，这在输入细胞数量减少时可能特别重要。如上所述，DRS消除了cDNA合成阶段，只需要少量含有天然聚（a）尾或多聚腺苷酸的RNA在体外也可以想象微流体功能可以与DRS结合用于单细胞应用(图5a).

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图5

新兴的单细胞或低定量细胞基因表达谱分析技术

一|单分子DNA和RNA测序技术可以修改为单细胞应用。细胞可以使用射流系统输送到流动细胞，然后通过杂交在聚（dT）涂层的测序表面上进行细胞裂解和mRNA物种捕获。标准测序运行可以在127.5 mm的通道上进行²表面积，要求每个周期拍摄2750张图像，以对整个通道区域进行成像。单个细胞中容纳约350000 mRNA分子所需的表面积约为0.4 mm²; 因此，每个周期只需要8个图像。序列分析可以通过直接RNA测序（DRS）进行⁷或表面cDNA合成，然后进行单分子DNA测序²⁶.b条|计数器系统工作流。每个靶点使用两个探针：捕获探针（以红色显示）包含一个靶点特定序列和一个修饰，可以将分子固定在表面上；报告探针包含一个不同的目标特异序列（以蓝色显示）和一个荧光条形码（以绿色圆圈显示），该条形码对每个被检查的目标都是唯一的。捕获和报告探针混合物与溶液中的RNA样品杂交后，去除多余的探针。然后将杂交RNA双工体固定在表面并成像，以识别和计数捕获和报告探针上具有独特荧光信号的每个转录物。

基于杂交的方法学也为使用极少量RNA提供了希望。NanoString n计数器系统提供了一种不需要cDNA合成的RNA定量替代方法，并且它依赖于目标特异性探针的生成(图5b). 将探针混合物与溶液中的RNA样品杂交，然后在表面固定探针–RNA双工体，并进行单分子成像，以识别和计算单个转录物⁹⁹原则上，该系统可以同时检测多达16384份转录本。这种方法需要约100毫微克RNA或2000-5000个细胞¹⁰⁰但优化探针杂交和表面固定步骤可能会进一步减少输入RNA的数量。

Fluidigm提供了一个微流体平台，可以以多种方式在基因面板上进行定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）实验，并已用于分析单个细胞。允许一步cDNA合成和扩增的商业试剂盒用于细胞裂解、cDNA合成以及感兴趣转录区的PCR扩增。然后将预扩增的cDNA引入Fluidigm动态阵列进行qRT-PCR分析。这种方法可能有助于确定感兴趣细胞中转录子子集的表达水平^101，102.

上述方法中没有一种是成熟的，到目前为止，也没有一种完全满足我们对从微小细胞量中获得可靠、全基因组和深入转录组图谱的需求。例如，Fluidigm和NanoString技术都只查询选定的转录物子集，不提供全面的分析。然而，希望这些技术所形成的基础所带来的未来进步将使这种能力成为可能。

未来展望

RNA-seq的最新进展为研究人员提供了一个强大的工具箱，用于描述和量化转录组。新兴的测序技术有望至少部分缓解当前RNA-seq方法的困难，并为科学家提供更好的工具。利用这些技术进步，我们可以建立一个完整的转录物目录，这些转录物来源于从简单的单细胞生物到复杂的哺乳动物细胞的基因组，以及正常和疾病状态下的组织。此外，随着我们处理新鲜和福尔马林固定石蜡包埋组织和细胞中微小RNA数量的能力不断增强，并提供甚至单个细胞中RNA物种的量化，我们有机会在广泛的生物样本中定义复杂的生物网络。有了这些网络，我们可以使用细胞和组织的数据驱动RNA网络模型，试图全面了解在各种生理条件下活跃的生物途径。此外，这些技术使我们更接近于将RNA测量用于临床诊断的能力。例如，循环细胞外核酸的分析¹⁰³而细胞，如胎儿RNA和循环肿瘤细胞，利用这些新技术可能可以早期评估健康、疾病复发或突变状态。因此，这些技术将继续帮助我们实现基因组信息的全部潜力，因为它与分化和多样性的基本生物学问题有关，并对医疗个性化产生越来越大的影响。

致谢

脚注

工具书类